ABSTRACT

MATERIALE ȘI METODE

Cultivarea bacteriilor. L. monocytogenes 4B (izolat clinic, B1242 din colecția institutului nostru) a fost depozitat în mod obișnuit la -80 ° C în bulion de infuzie cardiacă cerebrală (Difco, Detroit, Mich.) Conținând 20% (vol/vol) glicerol. Soluțiile stoc au fost rapid dezghețate, placate pe plăci PALCAM listeria-selective (Merck, Darmstadt, Germania) și apoi incubate aerob la 37 ° C timp de 18 ore. Ulterior, câteva colonii au fost inoculate în bulion de infuzie a inimii creierului, urmată de incubare peste noapte la 37 ° C în condiții aerobe. Celulele bacteriene au fost colectate prin centrifugare (15 min la 3.500 × g), spălate de trei ori în soluție salină sterilă și resuspendate în soluție salină conținând 3% (greutate/vol) bicarbonat de sodiu. Virulența tulpinii utilizate a fost susținută de trecerea orală de rutină la șobolani Wistar, urmată de izolare din splină și ficat în ziua 3 după administrarea orală.

translocației

Animale și infecție. Protocolul experimental a fost aprobat de comitetul pentru bunăstarea animalelor de la Universitatea Wageningen, Wageningen, Olanda. Șobolanii masculi Wistar (fără patogeni specifici, WU; Harlan, Horst, Olanda), în vârstă de 9 săptămâni, cu o greutate corporală de aproximativ 325 g, au fost adăpostiți individual în cuști metabolice. Temperatura ambiantă (22 la 24 ° C), umiditatea relativă (50 la 60%) și ciclul de lumină întunecată (lumină, 0600 la 1800 h) au fost menținute constante. Șobolanii au fost hrăniți cu diete purificate constând din 20% cazeină, 63% glucoză, 5% celuloză, 4% ulei de porumb și vitamine și minerale conform recomandării AIN-93 (25), cu excepția colinei, care a fost adăugată sub formă de clorură de colină. în loc de tartrat de colină și calciu, care a fost adăugat sub formă de fosfat de calciu (CaHPO4 · 2H2O; dietă de 180 mmol/kg) în loc de carbonat de calciu (dietă de 125 mmol/kg). Dietele au fost furnizate sub formă de terci cu 68% greutate uscată (diete uscate amestecate cu apă dublu distilată) pentru a reduce la minimum vărsarea alimentelor și contaminarea ulterioară a urinei și a fecalelor. Șobolanilor li s-a oferit acces gratuit la alimente și apă potabilă demineralizată. Aportul alimentar și greutatea corporală au fost înregistrate la fiecare 2 până la 4 zile de preinfecție și postinfecție zilnică.

Statistici. Rezultatele sunt exprimate ca medii ± erori standard (n = 8). Datele au fost verificate pentru normalitate și omogenitate a varianțelor utilizând testul Shapiro-Wilks și respectiv testul lui Levene. Când au fost distribuite în mod normal, diferențele dintre grupuri au fost testate prin analiza varianței (ANOVA), urmat de testul t Student (unilateral) cu corecția Bonferroni pentru comparații multiple. În caz contrar, diferențele dintre grupuri au fost testate cu testul Kruskal-Wallis neparametric. Corelația a fost determinată utilizând momentul produsului Pearson. Diferențele au fost considerate semnificative dacă creșterea șobolanilor P și aportul de alimente. Creșterea în greutate nu a fost afectată de doza de L. monocytogenes administrată. Greutatea corporală medie a fost de 324 g la începutul experimentului, în timp ce greutatea corporală medie finală a fost de 375 g. Aportul alimentar nu a fost afectat în mod semnificativ de doza de L. monocytogenes administrată. Înainte de infecție, aportul mediu de alimente era de 23,1 g/zi. După infecție, aportul mediu de alimente a fost de 21,1 g/zi.

Colonizarea intestinală și translocarea Listeriei. Colonizarea intestinală a fost determinată prin enumerarea celulelor viabile L. monocytogenes în fecale. Figura 1 prezintă cinetica excreției fecale a L. monocytogenes viabil. În ziua 1 după inoculare, au fost excretate niveluri ridicate de listeria. Excreția de L. monocytogenes a scăzut treptat până la limita de detecție în decurs de 1 săptămână după inoculare. Excreția fecală a L. monocytogenes viabil a fost dependentă de doză. Așa cum era de așteptat, nu s-a putut detecta L. monocitogen viabil la fecalele șobolanilor care au primit 8 × 10 9 bacterii ucise de căldură. Nu s-au observat semne clinice de diaree în cursul infecției.

Excreția fecală a L. monocytogenes înainte și în timpul infecției cu diferite doze de acest agent patogen. Celulele viabile sau ucise prin căldură (8 × 10 9) au fost administrate oral în ziua 0. Datele sunt exprimate ca medii ± erori standard de opt șobolani per grup. DL, limită de detecție. Valorile din aceeași zi care nu împărtășesc aceeași literă sunt semnificativ diferite (P 9 celulele L. monocytogenes ucise la căldură erau sterile (Fig. 2). Cantitatea de celule L. monocytogenes în MLN de șobolani infectați cu bacterii viabile depindea de greutatea dozei MLN nu a fost afectată de infecție (131 ± 51, 188 ± 40, 127 ± 22 și 109 ± 27 mg pentru listeria termică la 8 × 10 7, 8 × 10 8 și 8 × 10 9 CFU, Nu s-au putut detecta agenți patogeni viabili în splină și ficatul șobolanilor infectați.

Cinetica excreției urinare de NOx (A) și a NOx urinar (B) indusă de infecție totală după provocare orală cu diferite doze de L. monocytogenes. Celulele viabile sau ucise prin căldură (8 × 10 9) au fost administrate oral în ziua 0. Datele sunt exprimate ca medii ± erori standard de opt șobolani per grup. Valorile care nu împărtășesc aceeași literă sunt semnificativ diferite (P 9 CFU la șobolanii masculi F344/Slc, alte modele orale care folosesc șoareci au arătat că acest agent patogen poate fi detectat în splină numai din a doua zi și după aceea (24, 26) Diferențele de specii și tulpini (F344/Slc versus șobolani Wistar în studiul nostru) și, probabil, dietele distincte (rozătoare chow versus diete purificate în studiul nostru) pot explica această discrepanță. Datele literaturii despre cinetica translocării în MLN sunt consistente; au arătat translocație la MLN în ziua 1 după inoculare (17, 24, 26). Deși timpul de răspândire în splină și ficat poate depinde de modelul animal utilizat, aceste studii, precum și experimentul nostru arată clar că diseminarea extraintestinală a L. monocytogenes apare într-o manieră dependentă de doză atât la șobolani, cât și la șoareci (26, 30).

Cinetica răspunsului urinar de NOx după infecția cu listeria este diferită de cea observată după infecția cu salmonella (6, 27), care crește din ziua 3 și atinge valorile maxime în zilele 6 și 7, revenind la nivelurile inițiale în ziua 12 după inoculare. Acest lucru poate fi explicat de evoluția timpului infecției. În comparație cu listeria, infecția cu salmonella este eliminată încet la șobolani. În timp ce numărul de listerii viabile în organele sistemice crește până la valorile maxime în ziua 3 a infecției și sunt complet eliminate la 7 zile după inoculare (24, 28), numărul viabil de salmonella în țesutul limfoid începe să crească în ziua 3 și după (10), cu cantități considerabile încă detectabile în MLN în ziua 7 a infecției (27).

S-a demonstrat că NOx este crescut în plasmă și urină la pacienții cu gastroenterită acută infecțioasă indusă de agenți patogeni precum salmonella, shigella și campylobacter (1, 8, 9, 11). Azotatul plasmatic este corelat cu severitatea infecției (8). Astfel, pe lângă aplicarea la determinarea cantitativă a listeriozei dobândite oral pe modele animale, NOx urinar ar putea fi, de asemenea, util pentru a monitoriza eficacitatea tratamentului listeriozei la om.

În concluzie, există o relație dependentă de doză între NOx urinar și translocarea listeriei într-un model de șobolan de infecție cu L. monocytogenes dobândită oral. Prin urmare, excreția de NOx în urină poate fi utilizată ca biomarker neinvaziv pentru cuantificarea translocației acestui agent patogen în modele animale și poate oferi un instrument pentru a studia eficacitatea componentelor alimentare funcționale. Pe lângă această aplicație, NOx urinar poate fi, de asemenea, utilizat pentru a monitoriza severitatea listeriozei la om.

MULȚUMIRI

Mulțumim Maria Faassen-Peters și Wilma Blauw (Centrul pentru animale mici, Universitatea Wageningen, Wageningen, Olanda) pentru asistență biotehnică abilă și lui George Mahulette (NIZO Food Research) pentru analiza metaboliților oxidului nitric urinar.