Abstract

Obezitatea este un factor de risc major pentru dezvoltarea diabetului de tip 2, iar ambele afecțiuni sunt acum recunoscute că posedă componente inflamatorii semnificative care stau la baza fiziopatologiilor lor. Am testat ipoteza conform căreia curcumina compusă polifenolic din plante, despre care se știe că exercită efecte antiinflamatorii și antioxidante puternice, ar ameliora diabetul și inflamația la modelele murine de obezitate rezistentă la insulină. Am constatat că amestecul curcuminei dietetice a ameliorat diabetul zaharat la șoarecii obezi ob/ob cu deficit de leptină și cu deficiență de leptină la șoareci masculi C57BL/6J, determinați prin teste de toleranță la glucoză și insulină și procentaje de hemoglobină A1c. Tratamentul cu curcumină a redus, de asemenea, semnificativ infiltrarea macrofagelor în țesutul adipos alb, a crescut producția de adiponectină a țesutului adipos și a scăzut activitatea factorului nuclear hepatic-κB, hepatomegalia și markerii inflamației hepatice. Prin urmare, concluzionăm că curcumina ingerată oral inversează multe dintre tulburările inflamatorii și metabolice asociate cu obezitatea și îmbunătățește controlul glicemic la modelele de șoarece de diabet de tip 2. Acest compus sau compușii înrudiți justifică investigații suplimentare ca noi terapii adjuvante pentru diabetul de tip 2 la om.

PREVALENȚA MARE a obezității este o amenințare majoră pentru sănătatea publicului. Obezitatea este un factor de risc important pentru dezvoltarea infarctului miocardic, accident vascular cerebral, diabet zaharat de tip 2, cancer (1,2,3,4,5), infertilitate feminină (6,7,8) și complicații ale sarcinii (9). Nu este surprinzător că obezitatea este, de asemenea, asociată cu o scădere substanțială a calității vieții legate de sănătate și cu o creștere a cheltuielilor medicale (10,11,12). Având în vedere povara mare impusă de obezitate asupra bunăstării societății, este imperativ să se dezvolte noi metode care să-i poată reduce prevalența, precum și să inverseze modificările sale fiziologice dăunătoare.

Există dovezi convingătoare că o componentă mare a fiziopatologiei asociate obezității poate proveni dintr-o stare proinflamatoare de grad scăzut. Manifestările acestei stări proinflamatorii includ producția crescută de molecule proinflamatorii, cum ar fi TNF-α, proteina chemoattractantă monocitară (MCP) -1, oxidul azotic sintaz inductibil și inhibitorul activatorului plasminogen-1 în țesutul adipos, hepatic și muscular și activarea crescută a căi de semnalizare inflamatorie, cum ar fi factorul nuclear-κB (NF-κB) și sistemele de kinază Jun-N-terminale din aceste țesuturi. Țesutul alb adipos al subiecților obezi se inflamează histologic, cu dovezi de hipoxie, creșterea morții adipocitelor și infiltrarea atât a macrofagelor, cât și a celulelor T citotoxice în spațiul vascular stromal (13,14,15).

Ștergerile țintite ale mai multor gene importante pentru medierea răspunsurilor inflamatorii protejează împotriva dezvoltării rezistenței la insulină și a hiperglicemiei la modelele de obezitate de la șoareci. Unele dintre aceste gene codifică citokine precum TNF-α și MCP-1 (16,17). Recent, mai multe studii au arătat că întreruperea genei care codifică receptorul sistemului imunitar înnăscut Receptorul de tip Toll (TLR) -4 la șoareci conferă protecție împotriva inflamației induse de obezitate și a rezistenței la insulină (18,19,20,21,22). De asemenea, inhibarea semnalizării NF-κB utilizând salicilați cu doze mari sau ștergerea condiționată a inhibitorului-κB kinază-β în celulele descendente mieloide conferă protecție împotriva inflamației induse de obezitate și rezistența la insulină la modelele de șoarece (23, 24). În schimb, stimularea semnalizării hepatice NF-κB cu un transgen este suficientă pentru a crește producția hepatică locală de citokine proinflamatorii și rezistența sistemică la insulină (25). Prin urmare, compușii care atenuează răspunsul inflamator asociat cu obezitatea se pot dovedi utili în managementul medical al pacienților cu diabet de tip 2.

Materiale și metode

Animale experimentale

Șoarecii C57BL/6J masculi de tip sălbatic și ob/ob au fost obținuți de la Laboratorul Jackson (Bar Harbor, ME). Șoarecii au fost adăpostiți la o cușcă și au fost menținuți pe un ciclu întunecat de 12 ore, 12 ore, cu acces ad libitum la alimente și apă. La primirea la vârsta de 8-10 săptămâni, șoarecii ob/ob au fost randomizați pentru a primi o masă dietetică standardizată de 4% grăsime în greutate (D12450B-I; Research Diets, New Brunswick, NJ) conținând fie un amestec de 3% în greutate de curcumină sau fără aditiv. Șoarecii C57BL/6J de tip sălbatic au fost primiți la vârsta de 3-5 săptămâni și randomizați pentru a primi fie o dietă standardizată de 4% grăsime în greutate, fie o dietă bogată în grăsimi conținând 35% grăsimi în greutate (D12492-I; Research Diets). La vârsta de 20 săptămâni, acești șoareci de tip sălbatic au fost randomizați în continuare în ceea ce privește adăugarea la dieta lor predesemnată a unui amestec de curcumină de 3% în greutate sau fără aditiv.

Curcumina utilizată a fost complexul Curcumin C3 (Sabinsa Corp., Newark, NJ), care este un extract de curcumină standardizat în proporție de 95%. Toți șoarecii au rămas la dieta lor atribuită până când au fost uciși prin asfixierea CO2 la vârsta de aproximativ 24-28 săptămâni. Toate protocoalele au fost realizate în acord cu ghidul Institutului Național de Sănătate pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator și au fost aprobate de Comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor de la Columbia University.

Analiza compoziției corpului

Masele de grăsime și țesut slab au fost calculate de la șoareci vii, neanesteziați, folosind o mașină de rezonanță magnetică nucleară (RMN) (Bruker, Billerica, MA). Alimentele peletate au fost cântărite zilnic pentru a evalua totalul de grame de alimente consumate pe cușcă pe zi și apoi împărțite la 5 pentru a estima mâncarea medie zilnică consumată pe șoarece.

Test de toleranță la glucoză

După post în cuști proaspete timp de 16 ore peste noapte, s-a recoltat aproximativ 25 μl de sânge de vârf de coadă pentru a stabili nivelurile de glucoză și insulină în post. După aceea, toți șoarecii au primit o unitate (0,01 cmc) dintr-o soluție de dextroză 20% per gram de greutate corporală prin injecție ip. Nivelurile de glicemie de tip coadă de probă au fost evaluate utilizând un glucometru Freestyle Flash (Abbott, Abbott Park, IL) la 15, 30, 60 și 120 min. Probele de sânge au fost centrifugate la 14.000 rpm timp de 10 min (4 C), iar serurile au fost transferate în tuburi proaspete și congelate la -80 C pentru testarea ulterioară a insulinei.

Test de toleranță la insulină

După șoareci de post timp de 6 ore pentru stabilizarea nivelului de glucoză și insulină din dietă, s-a recoltat aproximativ 25 μl de sânge de tip coadă pentru a stabili nivelul de glucoză și insulină de post. Șoarecii au primit apoi 1,5 U/kg insulină obișnuită (Lilly, Indianapolis, IN) prin injecție ip. Nivelurile de glicemie de tip coadă de probă au fost evaluate cu glucometru la 15, 30, 45, 60 și 120 min.

Imunohistochimie

Toate țesuturile au fost fixate timp de 12-16 ore la temperatura camerei în fixativ de zinc-formalină (Z-Fix; Anatech Ltd., Battle Creek, MI) și încorporate în parafină. Țesutul a fost tăiat în secțiuni de 5 μm tăiat la intervale de 50 μm și apoi montat pe lamele de sticlă încărcate, deparafinat în xilen și colorat. Diapozitivele adipoase albe perigonadale au fost colorate cu un anticorp monoclonal specific F4/80 pentru macrofage furnizat de E. Richard Stanley (Colegiul de Medicină Albert Einstein, New York, NY). Pentru fiecare depozit adipos de șoarece, au fost analizate patru câmpuri diferite de mare putere din fiecare din cele patru secțiuni diferite. Numărul total de nuclee și numărul de nuclee de celule care exprimă F4/80 au fost numărate pentru fiecare câmp. Fracțiunea de celule care exprimă F4/80 pentru fiecare probă a fost calculată ca suma numărului de nuclee de celule care exprimă F4/80 împărțit la numărul total de nuclee din secțiunile unei probe (SPOT versiunea 3.3; Diagnostic Instruments Inc., Sterling Heights, MI).

PCR cantitativ în timp real

ARN total a fost extras din țesutul adipos înghețat (100 mg) folosind un reactiv acid-fenol disponibil comercial (TRIzol; Invitrogen, Carlsbad, CA). Pentru eșantioanele de țesut, ADNc din prima catenă a fost sintetizat folosind transcriptaza inversă SuperScript III și primeri hexameri aleatori, așa cum este descris în protocolul producătorului (Invitrogen). Probele de ADNc au fost diluate 1:25 în apă fără nuclează (QIAGEN Inc., Valencia, CA). Probele din fiecare grup de ADNc au fost diluate 1:10, 1:30, 1:90 și 1: 270 pentru a crea o curbă standard pentru calcularea nivelurilor relative de expresie genică. Amestecurile de amplificare PCR (20 μl) conțineau 10 μl de 2 × PCR SYBR Green I QuantiTect master mix (QIAGEN), 0,4 μl dintr-un amestec de 25 μm primeri inversați și înainte și 11,6 μl șablon de ADNc diluat. PCR cantitativă în timp real a fost efectuată utilizând instrumentul DNA Engine Opticon 2 (MJ Research Inc., Waltham, MA) cu următorii parametri de ciclare: activarea polimerazei timp de 15 min la 95 C și amplificare pentru 40 de cicluri de 15 sec la 94 C, 10 sec la 58 C și 10 sec la 72 C. După amplificare, analiza curbei de topire a confirmat prezența unui singur amplicon în fiecare caz.

Pentru analiza expresiei, am utilizat primeri PCR în timp real prevalidați (QuantiTect; QIAGEN) pentru mai multe gene de șoarece: proteina ribozomală S3, Emr1 (antigen F4/80), TNF-α, IL-6 și proteină asociată cu complementul adipocit).

Pentru fiecare eșantion de ADNc și curbă standard, s-au efectuat PCR cantitative pentru a testa expresia fiecărei gene de control interne. Pentru a calcula nivelurile de expresie relativă normalizate ale fiecărei gene testate în fiecare probă, am împărțit valoarea expresiei genei relative pentru proba respectivă la media geometrică a valorilor de expresie relativă ale genelor martor. Analizele separate în care valorile relative ale expresiei au fost normalizate cu valorile relative ale expresiei fiecărei gene de control au dat rezultate similare.

Analize hormonale

După un post minim timp de 6 ore pentru a evita orice fluctuații potențial acute ale glucozei sau leptinei care pot fi atribuite consumului recent, șoarecii au fost cântăriți și apoi li s-a măsurat glicemia din glucometru (Glucometer Elite, Elkhart, IN) folosind aproximativ 5 μl de sânge de tip coadă. Au fost apoi uciși de asfixierea CO2. Sângele lor a fost apoi obținut prin puncție cardiacă, lăsat să se coaguleze pe gheață timp de 3 ore și apoi centrifugat la 10.000 × g timp de 10 min. Serurile au fost apoi transferate în flacoane curate pentru depozitare la -80 C până în ziua testului. Insulina serică a șoarecelui, leptina, MCP-1, adiponectina, rezistina și activatorul plasminogen tisular-1 au fost cuantificate prin ELISA (Linco Research Inc., St. Charles, MO). Toți coeficienții de variație inter și intra-test au fost mai mici de 10%.

Testul activității NF-κB

Extractele de proteine ​​nucleare au fost preparate din țesut hepatic de la șoareci martori și hrăniți cu curcumină folosind kitul de extract nuclear (Active Motif, Carlsbad, CA) conform instrucțiunilor producătorului. Concentrațiile de proteine ​​au fost apoi cuantificate folosind un test Bradford și s-au utilizat cantități egale de proteine ​​într-un test colorimetric NF-κB specific pentru forma activată a subunității p65 a NF-κB (kit TransAM NF-κB p65; motiv activ).

Statistici și definiții

Testele t ale studenților cu două cozi au fost utilizate pentru a compara analiții serici între grupurile experimentale slabe C57BL/6J și obezi. P 1, A și B). Acest tipar a persistat la șoarecii DIO pentru durata de 5 săptămâni a tratamentului, în timp ce șoarecii ob/ob au devenit în cele din urmă euglicemici fără tratament, un fenomen binecunoscut atribuit hiperplaziei insulelor pancreatice (44). Șoarecii DIO și ob/ob tratați cu curcumină au manifestat zone semnificativ diminuate sub curbă (ASC) generate de testarea toleranței la glucoză de 2 ore (Fig. 2 2, A și B), comparativ cu martorii. Mai mult, procentul de hemoglobină A1c (HbA1c) la șoarecii DIO și ob/ob a scăzut semnificativ după 5 săptămâni de tratament cu curcumină (Fig. 3 3),), în timp ce nu a fost observată o astfel de scădere la șoarecii slabi de tip sălbatic, sugerând că curcumina nu induce hipoglicemie la animalele euglicemice.

semnificativ

Efectul curcuminei asupra nivelului de glucoză din sânge hrănit la șoarecii obezi, diabetici. Curcumina dietetică a redus semnificativ nivelurile aleatorii de glucoză din sânge atât la șoarecii masculi C57BL/6J PART (A), cât și la șoarecii ob/ob (B) pe parcursul unei perioade de 6 săptămâni. Nivelurile de glucoză din sânge la șoarecii ob/ob care primesc dieta de control s-au normalizat spontan în timp datorită înclinației lor către hiperplazie și hiperinsulinemie a insulelor pancreatice (n = 5 per grup). *, P 4A). ). Nu s-a găsit o astfel de diferență pentru șoarecii DIO hrăniți cu curcumină (Fig. 4B (Fig. 4B)), care, spre deosebire de omologii lor ob/ob, au manifestat niveluri de glicemie care au fost semnificativ mai mici decât cohorta lor de control într-un grad similar 40 mg/dl) în toate momentele, inclusiv momentul inițial al postului. Pentru a înfățișa o impresie mai precisă a stării lor glicemice, testul lor de toleranță la insulină a fost afișat, de asemenea, utilizând nivelurile medii de glucoză pentru axa ordonată, mai degrabă decât procentul nivelurilor bazale de glucoză (Fig. 4C 4C).

Efectul curcuminei asupra toleranței la insulină și a șoarecilor diabetici. Curcumina îmbunătățește toleranța la insulină la șoarecii ob/ob, așa cum se manifestă printr-o ASC scăzută a unui test de toleranță la insulină de 2 ore cu niveluri de glucoză din sânge după injectarea insulinei exprimată ca procent din nivelul bazal de glucoză (A). Șoarecii masculi DIO nu au manifestat astfel de diferențe (B) deoarece au exprimat niveluri de glucoză la jeun semnificativ mai mici decât grupul lor de control corespunzător și după injectarea insulinei; glucozele lor la fiecare moment ulterior au rămas semnificativ mai mici (C) (n = 5 per grup). *, P 5). ). Șoarecii DIO și ob/ob tratați cu curcumină au cântărit ușor, dar semnificativ mai puțin decât cohorta lor de control (Fig. 6 6, B și C). Tratamentul cu curcumină a fost, de asemenea, asociat cu o cantitate semnificativ mai mică de grăsime corporală la șoarecii DIO și ob/ob și o masă mai slabă la șoarecii ob/ob, așa cum a fost determinat de analiza RMN Bruker (Fig. În timp ce șoarecii de control DIO hrăniți în grăsimi au continuat să câștige în greutate pe durata acestui studiu, șoarecii DIO au trecut la o dietă bogată în grăsimi, dar îmbogățită cu curcumină, au pierdut o cantitate semnificativă de greutate cu 2 săptămâni în acest studiu, care ulterior părea să fie platou (Fig. 6D 6D).

Efectul curcuminei asupra aportului alimentar la șoareci. Curcumina dietetică a fost asociată cu o creștere semnificativă a consumului de alimente la șoareci slabi și DIO, dar nu ob/ob, șoareci C57BL/6J, chiar și după compensarea celor 3% din aportul alimentar care a fost curcumină (n = 5 pe grup). *, P (Fig.7). ). De asemenea, am analizat efectul tratamentului cu curcumină asupra expresiei mai multor gene despre care se știe că sunt strâns corelate cu procesul inflamator din țesutul adipos alb perigonadal folosind PCR cantitativă în timp real. Curcumina a scăzut semnificativ expresia Emr1, gena specifică macrofagelor care codifică antigenul F4/80 (Fig. 8 8), în concordanță cu prezența imunohistochimică scăzută a macrofagelor observate în țesutul adipos pe secțiunea transversală. Tratamentul cu curcumină a crescut semnificativ expresia adipoză perigonadală a genelor care codifică factorul de transcripție a furcii Foxo1 și adiponectina adipokină antiinflamatorie. Aceste constatări sunt în concordanță cu studiile recente care au demonstrat scăderea expresiei Foxo1 a țesutului adipos la șoareci obezi și stimularea directă a transcripției adiponectinei de către Foxo1 în adipocite (45,46).

Efectul curcuminei asupra inflamației adipoase. Multe adipocite din țesutul adipos al șoarecilor masculi ob/ob netratați prezintă colorare întunecată pentru F4/80, un marker macrofagic, în timp ce adipozele de la șoarecii tratați cu curcumină alimentară prezintă o colorare macrofagă semnificativ mai mică (B și C).

Efectul curcuminei asupra expresiei adipoase a citokinelor și a genelor de răspuns la stres. Curcumina alimentară crește semnificativ expresia adiponectinei (Acdc) și scade expresia F4/80 (Emr1) în țesutul adipos alb perigonadal al șoarecilor ob/ob masculi după 10 săptămâni (A). Tratamentul cu curcumină a indus, de asemenea, un efect dramatic asupra răspunsului la stres ER transcrierea genei grăsimii perigonadale, cu creșteri semnificative în expresia Sirt1, HSP70, HSP90 și FOXO1a (B) (n = 5 per grup). *, P 9). ). Greutatea hepatică a șoarecilor ob/ob hrăniți cu curcumină nu a cântărit semnificativ mai puțin decât martorii, efect potențial atribuibil absenței complete a leptinei la acești șoareci, care s-a dovedit a fi asociată cu hepatosteatoză severă și refractară (47,48 ). Am stabilit că curcumina a scăzut semnificativ expresia TNF-α hepatică, supresor al citokinei de semnalizare-3, MCP-1 [receptorul chemokinei (motiv CC)] și al ligandului chemokinei (motiv CC) la șoarecii ob/ob (Fig. 10 10). ). Folosind o analiză specifică pentru activitatea p65 (kit TransAM NF-κB p65; Active Motif), am stabilit că există o activitate p65 semnificativ mai mică în probele de extract nuclear din ficat derivate din șoarecii DIO și ob/ob tratați cu curcumină, comparativ cu cei derivați de la șoareci netratați (Fig. 11 11). ). Scăderea activității NF-κB poate explica, de asemenea, masa musculară crescută observată la șoarecii ob/ob hrăniți cu curcumină, deoarece activarea NF-κB favorizează puternic atrofia musculară, în special din cauza neutilizării (49).

Efectul curcuminei asupra greutății ficatului. Tratamentul cu curcumină a fost asociat cu scăderea semnificativă a greutăților hepatice la DIO, dar nu la șoareci ob/ob (n = 5 per grup). *, P 12). ). Acest lucru este în concordanță cu datele privind expresia adiposului și rezultatele îmbunătățite ale acestora la testul de toleranță la insulină (Fig. 4 4). ). Nivelurile serice ale MCP-1, un factor chimiotratant monocit secretat de adipocite, au fost scăzute de curcumină în toate grupurile experimentale, atingând semnificație în grupurile slabe și DIO. Acest lucru este în concordanță cu infiltrarea diminuată a macrofagelor observate imunohistochimic în țesutul perigonadal al șoarecilor obezi din acest studiu.