Affiliations Health Research Institute (INCLIVA), Valencia, Spania, Departamentul de fiziologie, Universitatea din Valencia, Valencia, Spania

dezvoltarea

Affiliations Health Research Institute (INCLIVA), Valencia, Spania, Departamentul de fiziologie, Universitatea din Valencia, Valencia, Spania

Departamentul de afiliere pentru patologie, Universitatea din Valencia, Valencia, Spania

Departamentul de afiliere pentru fiziologie, Universitatea din Valencia, Valencia, Spania

Afiliere UCIM, Universitatea din Valencia, Valencia, Spania

Departamentul de afiliere pentru fizioterapie, Universitatea din Valencia, Valencia, Spania

Affiliations Health Research Institute (INCLIVA), Valencia, Spania, Departamentul de Patologie, Universitat de Valenència, Valencia, Spania

Afilieri Health Research Institute (INCLIVA), Valencia, Spania, Departamentul de Cardiologie, Spitalul Clinic din Valencia, Valencia, Spania, CIBERCV, Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spania

Departamentul de afiliere pentru fiziologie, Universitatea din Valencia, Valencia, Spania

Departamentul de afiliere pentru fizioterapie, Universitatea din Valencia, Valencia, Spania

  • Oscar Julián Arias-Mutis,
  • Vannina G. Marrachelli,
  • Amparo Ruiz-Saurí,
  • Antonio Alberola,
  • Jose Manuel Morales,
  • Luis Such-Miquel,
  • Daniel Monleon,
  • Francisco J. Chorro,
  • Luis Such,
  • Manuel Zarzoso

Cifre

Abstract

Stabilirea unui model experimental adecvat este necesară pentru a obține o înțelegere a remodelării care are loc în diferite organe și sisteme. Până în prezent, în cazul MetS, au fost utilizate puține modele de iepuri induse de dietă care utilizează diete bogate în grăsimi și bogate în zaharoză [12-16] și cel mai important, nu a fost detaliată o caracterizare a diferitelor componente ale MetS. Acest lucru este de o mare importanță atunci când relaționează un fenotip cu remodelarea organelor. Astfel, obiectivul nostru principal este să dezvoltăm și să caracterizăm un model experimental de MetS indus de dietă la iepuri care ar permite ulterior studiul remodelării cardiovasculare și a aritmogenezei.

Material si metode

Animale și diete

Măsurători morfologice

Măsurătorile corporale au fost efectuate prin intermediul benzilor de măsurare și a unei scale de cântărire înainte de administrarea dietei experimentale și la săptămânile 14 și 28. Au fost determinate lungimea corpului, înălțimea, lungimea tibială, circumferința abdominală și raportul circumferința abdominală/lungimea corpului. Greutatea corporală a fost măsurată săptămânal. Indicele de masă corporală (IMC) a fost calculat ca greutate corporală (kg) [lungimea corpului (m) × înălțimea (m)] -1 [17].

Test de glicemie și toleranță la glucoză

Măsurătorile de glucoză în repaus s-au făcut înainte de administrarea dietei experimentale și în săptămânile 14 și 28 cu un glucometru (Contour Next, Bayer, Leverkusen, Germania). Pentru evaluarea metabolismului glucozei, testul de toleranță intravenoasă la glucoză (IVGTT) a fost efectuat așa cum s-a descris anterior [11]. Pe scurt, iepurii au fost posti timp de 7 ore și apoi experimentul a început între orele 14-15. După canularea venei auriculare, s-a administrat un bolus dintr-o soluție de glucoză 60% (0,6 g kg -1) i.v. prin vena urechii marginale și au fost prelevate probe de sânge înainte și în diferite momente de timp după injecție (15, 30, 60, 90, 120 și 180 de minute). Glicemia a fost măsurată cu un glucometru (Contour Next, Bayer, Leverkusen, Germania). Zona de sub curbă (ASC) a fost calculată prin înmulțirea înălțimii medii cumulative a glucozei (mg dL -1) cu timpul (ore) [18].

Tensiune arteriala

Iepurii au fost reținuți într-un suport de plastic și, după aplicare locală anestezică locală (EMLA, Astra AstraZeneca, Madrid, Spania), artera auriculară centrală a fost canulată (Introcan 18G, Braun, Melsungen, Germania). Apoi, restricțiile au fost slăbite și iepurelui i s-a permis să stea liniștit timp de 20-30 de minute. Tensiunea arterială a fost înregistrată direct din cateterul arterial, folosind un traductor de presiune poziționat la nivelul inimii. Semnalul de la traductor (Model 60–3003, Harvard Apparatus, Holliston, MA) a fost amplificat, trimis la o unitate Power Lab (Power Lab 2/26, AD Instruments, Oxford, Marea Britanie) și apoi înregistrat la Labchart (ver. 6, AD Instruments, Oxford, Marea Britanie) cu o frecvență de eșantionare de 1 KHz. Datele au fost analizate folosind software personalizat și ultimele 5 minute dintr-o înregistrare de 20 de minute au fost procesate pentru a calcula presiunea arterială sistolică, diastolică și medie (MAP). Determinările au fost făcute în săptămânile 14 și 28.

Măsurători plasmatice

Probele de sânge au fost prelevate din vena auriculară în săptămâna 14 și 28. După 7 ore de post, probele au fost colectate în tuburi EDTA (BD Vacutainer, Plymouth, Marea Britanie), depozitate pe gheață și centrifugate (1500 g, 15 min, 4 ° C) . Apoi, plasma a fost obținută și depozitată într-un frigider la -80 ° C. Trigliceridele plasmatice, colesterolul total, HDL, LDL, transaminazele, gamma-glutamil transpeptidaza (GGT), acidul biliar, bilirubina, creatinina, ureea, proteinele totale, albumina, glucoza și creatin fosfokinaza (CPK) au fost determinate folosind proceduri enzimatice standard laborator (Immunovet, Barcelona, ​​Spania).

Histologie

Țesutul hepatic a fost obținut de la 5 animale (martor n = 3, MetS n = 2). După premedicație cu ketamină (35 mg kg -1) și heparină (2500 UI), iepurii au fost eutanasiați cu o supradoză de pentobarbitonă de sodiu (100 mg kg -1). Apoi, ficatul a fost îndepărtat cu atenție și scufundat într-o soluție de formaldehidă de 4%, încorporată în parafină, secționată în serie în 5 μm, montată în lamele adezive și colorată cu hematoxilină și eozină. Am efectuat un studiu morfometric în 5 microfotografii pentru fiecare animal din zona venelor centrale, cu ajutorul unui microscop DMD108 (Leica Mircrosystems, Wetzlar, Germania) și un obiectiv de 40x. Image-Pro Plus 7.0 a fost utilizat pentru analiza imaginii și au fost cuantificați următorii parametri: numărul de hepatocite, aria și numărul de hepatocite cu conținut de vacuol lipidic.

Spectroscopie prin rezonanță magnetică nucleară (RMN)

analize statistice

Valorile sunt raportate ca media ± SD, cu excepția cazului în care se specifică altfel. Testul Shapiro-Wilk a fost efectuat pe toate variabilele pentru a evalua normalitatea distribuțiilor. Testul t nepereche și un model mixt ANOVA cu doi factori, unul dintre subiecți (timp) și unul între subiecți (grup), au fost folosiți pentru analiza statistică atunci când a fost cazul. Corecția Bonferroni a fost aplicată pentru comparații perechi. Diferențele au fost considerate semnificative la un nivel alfa cu două cozi de P Fig 1. Evoluția greutății în perioada experimentală.

Măsurarea săptămânală a greutății este afișată în panoul (A), în timp ce comparația creșterii în greutate în săptămânile 14 și 28 este afișată în panoul (B). Control (n = 12), MetS (n = 13), An = săptămână de aclimatizare, * p Tabelul 1. Caracteristici morfologice.

Aportul zilnic a fluctuat la animalele MetS în timpul celor 28 de săptămâni de administrare a dietei (variind între 716 și 374 kcal zi -1), în timp ce aportul în grupul de control a rămas constant, deoarece animalele au consumat în mod normal cele 120 g de chow furnizate pentru întreținere (Fig 2A) . Când s-a calculat valoarea medie a celor 28 de săptămâni, am obținut că iepurii MetS au ingerat cu 66,7% mai mult kcal decât martorii (537 ± 41 față de 322 ± 8 kcal zi -1, p Fig 2. Aportul de energie în grupurile experimentale.

Panoul (A) ilustrează evoluția aportului săptămânal în cele 28 de săptămâni ale perioadei experimentale. În panoul (B), este afișat aportul caloric mediu. Aportul relativ în procente de kcal de la chow bogat în grăsimi și soluția de băut poate fi observat în panoul (C). Control (n = 6), MetS (n = 8), * p -1). Dieta bogată în grăsimi, bogată în zaharoză a crescut nivelurile de glucoză în repaus alimentar la iepurii MetS în săptămânile 14 (115 ± 10 vs. 102 ± 7 mg dL -1, p -1, p Fig 3. Reglarea glicemiei.

Măsurătorile glicemiei au fost luate după post înainte de dietă și la 14 și 28 de săptămâni de administrare bogată în grăsimi și zaharoză (A). Rezultatele IVGTT în săptămânile 14 și 28 sunt prezentate în panoul (C), iar cuantificarea ariei de sub curbă (ASC) este prezentată în panoul (B). Control (n = 12), MetS (n = 13), * p $ p -1 în săptămâna 14, 110 ± 12 vs. 96 ± 6 mg dL -1 în săptămâna 28, p -1 în săptămâna 14, 104 ± 9 vs. 96 ± 6 mg dL -1 în săptămâna 28, Fig. 3C). Pe de altă parte, acest parametru a rămas crescut după 180 de minute la iepurii MetS în săptămânile 14 (126 ± 21 vs. 117 ± 11 mg dL -1, p -1, p Fig 4. Modificări ale tensiunii arteriale.

Panourile (A) și (B) prezintă măsurători ale tensiunii arteriale sistolice și diastolice în săptămâna 14 și 28 în ambele grupuri experimentale. Presiunea arterială medie (MAP) este prezentată în panoul (C). Control (n = 10), MetS (n = 11), * p Fig 5. Profil lipidic.

Măsurători plasmatice ale colesterolului total (A), HDL (B), LDL (C) și trigliceridelor (D) la săptămânile 14 și 28. Control (n = 11), MetS (n = 13), * p Fig 6. Afectarea ficatului markeri în săptămâna 14 și 28.

Măsurătorile plasmatice ale transaminazelor (raportul GOT-AST, GPT-ALT și GOT/GPT) sunt prezentate în panouri (A-C). Alți markeri ai funcției hepatice, cum ar fi gamma-glutamil transferaza (GGT), acidul biliar și bilirubina, sunt prezentați în panouri (D-F). Control (n = 11), MetS (n = 13), * p 2, p Fig 7. Studiu histologic hepatic.

Microfotografiile reprezentative (zona venelor centrale) după colorarea hematoxilinei-eozinei sunt prezentate în panoul (A) pentru control (stânga) și MetS (dreapta). Cuantificarea ariei hepatocitelor și a raportului lipid vacuol/hepatocit este afișată în panourile (B) și, respectiv, (C). Control (N = 3, n = 15), MetS (N = 2, n = 10), * p Tabelul 2. Modificări ale metaboliților așa cum se arată prin analiza metabolomică.

Discuţie

Scopul acestui studiu a fost de a dezvolta un model experimental de MetS indus de dietă la iepuri NZW și de a efectua o caracterizare detaliată a principalelor componente care definesc MetS uman. Rezultatele noastre au arătat că administrarea unei diete bogate în grăsimi și zaharoză în timpul a 28 de săptămâni a indus 1) obezitate centrală, 2) o stare de prediabet caracterizată prin afectarea glucozei la jeun și intoleranță la glucoză, 3) hipertensiune arterială ușoară, 4) modificări ale profilului lipidic evidențiată de o creștere a trigliceridelor și LDL, o scădere a HDL și nicio modificare a colesterolului total, 5) afectarea ficatului, după cum arată o creștere a GOT-AST, raportul GOT/GPT, acizi biliari și bilirubină 6) steatoză hepatică și 7 ) modificări ale metabolismului lipidelor, proteinelor, glucidelor și microbiotei intestinale care au fost legate de bolile cardiovasculare. Cel mai important, am dezvoltat un model animal relevant și ieftin de MetS indus de dietă, care imită principalele schimbări care apar la om.

Creșterea în greutate în exces și obezitatea sunt asociate cu modificări hemodinamice, cum ar fi creșterea volumului de sânge, preîncărcarea, încărcarea ulterioară și frecvent hipertensiunea. În această linie, am observat o creștere a tensiunii arteriale sistolice, diastolice și medii în săptămâna 14, care a fost menținută în săptămâna 28. Studiile anterioare care au utilizat o dietă bogată în grăsimi și zaharoză în timpul săptămânii 36 au dus la nicio modificare a tensiunii arteriale, în ciuda raportării o creștere cu 22% a greutății corporale [13], dar utilizarea unei rase de iepuri diferite și anestezie în timpul măsurătorilor ar putea explica aceste diferențe.

În modelul nostru, dislipidemia a apărut încă din săptămâna 14 și a fost menținută în săptămâna 28. Modificările profilului lipidic plasmatic s-au caracterizat printr-o creștere a trigliceridelor și LDL, o scădere a HDL și nicio modificare a colesterolului total. Acest lucru este similar cu criteriile care au fost stabilite la om pentru diagnosticul MetS [2]. În plus, am constatat, de asemenea, o scădere a nivelurilor de uree din plasmă, care ar putea fi explicată prin cantitatea redusă de proteine ​​prezente în chow-ul iepurilor MetS (15,7 vs. 23,4%). În schimb, proteinele totale au crescut la iepurii MetS în săptămânile 14 și 28 fără modificări ale albuminei, astfel încât această creștere s-a datorat probabil unei creșteri a globulinelor, dintre care unele au fost recent legate de dezvoltarea diabetului de tip 2 [27] și au au fost propuși ca biomarkeri pentru dezvoltarea fibrozei hepatice în afecțiunile hepatice grase nealcoolice [28].

Analiza plasmatică ne-a permis, de asemenea, să găsim semne de anomalii hepatice, după cum arată o creștere a raportului GOT-AST, GOT/GPT, acizi biliari și bilirubină în săptămânile 14 și 28. Modificările markerilor de afectare hepatică sunt, atunci când patologia nu este legată de steatoza alcoolică, nespecifică și include o creștere a GOT-AST, GPT-ALT, GGT și bilirubină. Rezultatele noastre sunt, prin urmare, compatibile cu dezvoltarea steatozei hepatice. Când am examinat histologia ficatului după colorarea cu hematoxilină-eozină și efectuarea unui studiu morfometric, s-a observat o creștere a suprafeței hepatocitelor și a procentului de infiltrare lipidică vacuolă. Aceste modificări sunt, de asemenea, în concordanță cu dezvoltarea steatozei hepatice care, deși nu este inclusă în criteriile de diagnostic ale MetS, însoțește adesea acest grup de anomalii metabolice [29] și ar putea duce la dezvoltarea steatohepatitei, fibrozei și cirozei. Rezultate similare au fost raportate la iepurii hiperlipidemici ereditari Watanabe după 16 săptămâni de hrănire bogată în grăsimi (10%) și bogată în fructoză (30%) [16].

Spectroscopia de rezonanță magnetică nucleară poate fi utilizată pentru a genera o „amprentă moleculară” a unei probe de ser pentru a identifica semnăturile moleculare asociate cu MetS. Există puține studii experimentale care au examinat modificările metabolomului plasmatic ca răspuns la intervențiile dietetice și, după cunoștințele noastre, aceasta este prima caracterizare a modificărilor metabolomice într-un model experimental de MetS indus de dietă la iepure. Analiza metabolomică ne-a permis să identificăm diferențele dintre grupuri în săptămâna 14, care în majoritatea cazurilor au fost menținute în săptămâna 28, în metaboliții implicați în metabolismul lipidelor, proteinelor, carbohidraților și microbiotei.

Creșterile nivelurilor plasmatice ale aminoacizilor au fost identificate ca fiind markeri ai obezității și rezistenței la insulină. În această linie, am găsit și am crescut alanina și treonina, care au fost raportate ca fiind crescute în diabetul de tip II și obezitate [30,31] și a fost propus ca predictor clinic pentru dezvoltarea hiperglicemiei și diabetului de tip II [32 ]. În plus, am găsit și modificări ale metabolismului carbohidraților, după cum arată o creștere a concentrației de metaboliți precum manoză, zaharoză și lactat, care au fost asociați și cu diabetul de tip II [33,34]. Defectele lanțului respirator mitocondrial și disfuncția mitocondrială ca factor semnificativ în rezistența la insulină indusă de acizii grași și diabetul de tip 2 este una dintre zonele critice în tulburările metabolice, care are o importanță tot mai mare [35]. Am constatat o creștere a nivelurilor de piruvat în plasmă, care a fost raportată la pacienții cu diabet de tip 2 [36]. Mai mult, hiperglicemia ar putea crește, de asemenea, rata oxidării glucozei către formarea excesivă de piruvat, indicând faptul că adaptările metabolice sunt direcționate către căile glicolitice în progresia către diabetul de tip 2 și rezistența la insulină [35].

În studiul nostru, dieta bogată în grăsimi și bogată în zaharoză a crescut intensitatea spectrală a fragmentului de acizi grași, FA (-CH2-) n, FA-β-CH2, FA-CH2C = C, FA-α-CH2 și FA-CH = CH, care la rândul său reflectă totalul acizilor grași circulanți. Dietele cu un conținut ridicat de grăsimi au ca rezultat o serie de perturbări metabolice, inclusiv dislipidemie, prin modificarea proporției VLDL/LDL și HDL. În plus, acizii grași sunt predictori independenți ai progresiei către diabet și afectează acțiunile insulinei prin mecanisme incluzând ciclul Randle, acumularea de derivați lipidici intracelulari (de exemplu, diacilglicerol și ceramide), stres oxidativ, inflamație și disfuncție mitocondrială [37]. Multe studii sugerează că o creștere a acizilor grași liberi circulanți ca una dintre principalele cauze ale acestei dislipidemii [38,39].

Disregularea microbiotei intestinale a fost legată de mai multe boli metabolice, cum ar fi boala ficatului gras nealcoolic, steatohepatita nealcoolică, diabetul, rezistența la insulină și obezitatea [40]. S-a demonstrat că dieta bogată în grăsimi induce modificări metabolice și, printre acestea, au existat modificări acide care, la rândul lor, pot produce o remodelare a microbiotei intestinale [41]. Chiar dacă nu am studiat compoziția acizilor biliari, am găsit o creștere a acizilor biliari în plasmă, precum și o creștere a acetoinei, un metabolit care poate fi produs în metabolismul piruvatului sau prin microbiota intestinală [42-45].

Modelele animale sunt un instrument puternic în înțelegerea mecanismelor care stau la baza proceselor patologice, cum ar fi MetS. Chiar dacă există mai multe modele animale de MetS, este dificil să alegeți un singur model care să reprezinte în mod adecvat condiția umană și este încă potrivit pentru studii cardiovasculare. Cu acest obiectiv, am descris un nou model animal de MetS indus de dietă, care prezintă multe dintre caracteristicile patologiei la om. Mai mult, din câte știm, iepurele nu a fost folosit anterior pentru studiul diferitelor componente ale MetS și aceasta este prima caracterizare detaliată folosind o dietă bogată în grăsimi saturate și zaharoză. De remarcat, utilizarea unui model indus de dietă este importantă, deoarece dieta afectează metabolismul și reglarea întregului corp prin efecte asupra hormonilor, metabolismului glucozei, căilor de metabolizare a lipidelor și efectelor sale în diferite organe, imitând îndeaproape ceea ce se întâmplă în MetS uman.

În concluzie, am dezvoltat un model relevant de MetS indus de dietă caracterizat prin obezitate centrală, hipertensiune arterială, pre-diabet și dislipidemie cu HDL scăzut, LDL ridicat și o creștere a nivelurilor de TG, reproducând astfel principalele manifestări clinice ale sindromului metabolic la om . De asemenea, am identificat modificări importante ale metabolomului direcționate către dezvoltarea rezistenței la insulină și a diabetului de tip 2, precum și modificări ale morfologiei și funcției hepatice, care indică dezvoltarea steatozei hepatice. Acest model experimental ar trebui să ofere un instrument valoros pentru studii viitoare asupra mecanismelor problemelor cardiovasculare, hormonale sau metabolice legate de MetS, cu relevanță specială în studiul remodelării cardiovasculare, aritmiilor și SCD.