Matthew S. Lehnert

1 Departamentul de Științe Biologice, Universitatea de Stat Kent din Stark, North Canton, OH 44720, SUA

Andrew Bennett

1 Departamentul de Științe Biologice, Universitatea de Stat Kent din Stark, North Canton, OH 44720, SUA

Kristen E. Reiter

1 Departamentul de Științe Biologice, Universitatea de Stat Kent din Stark, North Canton, OH 44720, SUA

Patrick D. Gerard

2 Departamentul de Științe Matematice, Universitatea Clemson, Clemson, SC 29634, SUA

Qi-Huo Wei

3 Liquid Crystal Institute, Kent State University, Kent, OH 44242, SUA

Miranda Byler

1 Departamentul de Științe Biologice, Universitatea de Stat Kent din Stark, North Canton, OH 44720, SUA

Huan Yan

3 Liquid Crystal Institute, Kent State University, Kent, OH 44242, SUA

Wah-Keat Lee

4 Brookhaven National Laboratory, Upton, NY 11973, SUA

Date asociate

Setul de date care susține acest document poate fi găsit la Dryad Digital Repository: http://dx.doi.org/10.5061/dryad.b167g [46].

Abstract

1. Introducere

Lichidele nutritive, cum ar fi fluxurile de sapă și nectarul, sunt o resursă limitativă; competiția, seceta și alți factori de mediu pot reduce aceste lichide din bazine până la umplerea numai a porilor mici de pe suprafețe [1-3]. Insectele care sunt capabile să extragă lichide de pe suprafețe poroase în condiții de mediu nefavorabile, cum ar fi seceta, ar avea un avantaj adaptativ față de alte insecte. În ciuda provocărilor asociate cu extragerea fluidelor limitate în porii mici de pe suprafețe, muște (Diptera, peste 150.000 de specii) și fluturi și molii (Lepidoptera, peste 160.000 de specii), alimentatoarele de lichid de premieră (70% din toate insectele care alimentează lichide) [4, 5], sunt adesea observate hrănindu-se de pe suprafețe poroase. Capacitatea lor de a se hrăni cu o mare varietate de fluide, cum ar fi nectarul, sângele, fluxurile de seve, mierea și sucurile de pe carios, fructe putrezite și balegă [6-10], au contribuit probabil la radiația lor masivă oferind oportunități de a intra în noi zone adaptive [11]. Ambele grupuri au piese bucale (proboscise) care sunt conceptual o conductă cu părți distale modificate care susțin absorbția fluidelor [12-15].

Deși Diptera și Lepidoptera au în cap o pompă de aspirare care este utilizată pentru transferul fluidelor prin canalele lor alimentare [16,17], acțiunea pompei singure nu poate depăși presiunea capilară necesară pentru a extrage fluidele din porii mici ai substratului [12,18 ]. Imaginea cu contrast de fază cu raze X a relevat că fluturele monarh (Danaus plexippus L.) depășește această provocare având o proboză poroasă care sprijină îndepărtarea fluidului din porii substratului prin acțiunea capilară pentru a construi punți lichide, prin instabilitatea Platoului [12,19], în interiorul canalului alimentar al proboscisului. Odată formată, pompa de aspirare poate genera presiunea diferențială pentru a transporta punțile de lichid către intestin [12]. Formarea podului lichid în D. plexippus depinde totuși de o relație între dimensiunea porilor substratului și diametrul canalului alimentar al pieselor bucale - punțile lichide nu se pot forma în conductele părții bucale cu diametru mai mare decât porii substratului, deci există un por limitativ. dimensiune din care se poate hrăni D. plexippus. Dovezile experimentale care indică importanța acțiunii capilare în hrana lichidă de către insecte lipsesc, iar ipoteza limită a mărimii porilor nu a fost testată la alte specii de hrănire cu lichide.

Având în vedere că insectele care hrănesc cu lichide diferă în ceea ce privește dimensiunile pieselor bucale [20], am emis ipoteza că există dimensiuni diferite ale porilor substratului substrat din care speciile se pot hrăni. În plus, un model răspândit de limitare a dimensiunilor porilor ar sugera că aceste insecte utilizează capilaritatea și punțile lichide ca principii de unire pentru absorbția fluidelor. O provocare centrală în evaluarea dimensiunii limită a porilor este determinarea dacă o insectă a dobândit în mod pozitiv fluide din porii mici de pe suprafețe. Monaenkova și colab. [12], de exemplu, a evaluat abilitățile de hrănire a D. plexippus pe baza comportamentelor de sondare a proboscisului, care se referă la hrănire, dar nu confirmă achiziția de lichid. Aici, folosim o soluție de zaharoză 20% amestecată cu nanoparticule magnetice fluorescente ca indicator al capacității de hrănire.

2. Metode

(o specie

dimensiunile

(b) Soluție de alimentare

O nanoparticulă de 1 mg ml -1 dH2O (fluorescent, oxid de fier magnetic cu un strat de acid poliacrilic, cu aproximativ 20 nm în diametru [22]) a fost amestecată cu o soluție de zaharoză 20% și colorant alimentar roșu (4,75: 4,75: 0,5, respectiv) pentru a produce o soluție de nanoparticule care a fost utilizată pentru a determina abilitățile de absorbție a fluidelor.

(c) Încercări experimentale de instalare și hrănire

(d) Disecții și observații cu nanoparticule

Imediat după hrănire, insectele au fost disecate sub un stereoscop (stereomicroscop Leica M205 C), iar cultura a fost îndepărtată folosind forceps și foarfece de disecție. Recolta a fost plasată pe un diapozitiv cu o lamă de acoperire și imaginată cu un filtru CY3 pe un microscop confocal Olympus IX81 (Center Valley, PA) la 20 ×. Un magnet a fost fluturat de culturi pentru a verifica prezența nanoparticulelor; dacă este prezent, aceasta indica capacitatea de a se alimenta dintr-o dimensiune specificată a porilor filtrului (figura 2).

(e) Microscopie electronică de scanare, tomografie și imagistică cu contrast de fază cu raze X.

Insectele au fost pregătite pentru microscopie electronică de scanare prin plasarea acestora printr-o serie de deshidratare a etanolului (70%, 80%, 90%, 100% EtOH timp de 24 de ore fiecare) urmată de uscare chimică folosind hexametildisalizan. Insectele au fost apoi poziționate pe tijele de aluminiu cu microscop electronic cu scanare (SEM) folosind bandă de grafit carbon și acoperite cu pulverizare cu platină timp de 1-2 minute. Exemplarele au fost realizate la 20 kV cu un Hitachi TM3000 SEM. Hârtiile de filtru neutilizate au fost așezate pe un butuc SEM de aluminiu și acoperite cu pulverizare cu un strat de platină de 7 nm. Hârtia de filtru a fost fotografiată la vid înalt la 15 kV într-un JEOL 6010LA-SEM. Tomografia și imaginile cu contrast de fază cu raze X au fost achiziționate la Laboratorul Național Argonne în urma unor protocoale și intensități ale fasciculului stabilite anterior [12].

(f) Statistici

Măsurătorile părții bucale proximale și distale au fost comparate în cadrul speciilor folosind un test t asociat. Analiza varianței (ANOVA, p 2 = 0,9341; F85,05; p 2 = 0,3110; F2,71; p = 0,151) din cauza regiunilor mari ale părții bucale proximale a muștelor. Piesele bucale distale au fost semnificativ mai mici decât regiunile proximale pentru toate speciile testate (teste t asociate, p 2 = 0,8380; p = 0,0029; părțile bucale proximale R 2 = 0,8841, p = 0,0477; figura 3). Muștele de la tratamentul pre-alimentat au reușit să dobândească soluția de nanoparticule din toate dimensiunile testate ale porilor filtrului, împiedicându-ne să determinăm dimensiunea pragului substratului porilor. Insectele au exprimat, de asemenea, o serie de comportamente de hrănire legate de dimensiunile porilor substratului din care au fost prezentate; cele prezentate cu dimensiuni mai mici ale porilor au exprimat comportamente sporite de spongare sau sondare [13,29]. Lichidele expulzate au fost observate de la unii fluturi în timpul hrănirii (n = 16) și doar unul dintre acești fluturi nu a avut ulterior soluția de nanoparticule din cultura lor (a se vedea materialul suplimentar electronic, tabelul S2).

Corelația dintre dimensiunile conductei piesei bucale și dimensiunile limită ale porilor substratului pentru speciile de insecte testate. (a) Relația dintre piesele bucale ale insectelor care au fost în tratamentul pre-alimentat și dimensiunile limită ale porilor substratului lor. Imaginile cu fluturi sunt plasate lângă măsurătorile corespunzătoare ale pieselor bucale distale (cercuri negre). (b) Corelația dintre dimensiunile părții bucale și limitarea mărimii porilor la insectele care au fost în tratament nepăsător. Corelația dintre dimensiunile părții bucale proximale și dimensiunea limită a porilor substratului în tratamentul netratat a fost diferită de celelalte corelații datorită dimensiunilor mari ale părții bucale proximale a muștelor. Relația strânsă dintre mărimea porilor substratului și dimensiunile distale ale mușchilor indică faptul că absorbția fluidelor în canalele pseudotraheale este un pas critic în hrănirea poroasă. Imaginile cu insecte nu sunt prezentate la scară. Toate imaginile fluture, cu excepția P. p. asterius, sunt utilizate cu permisiunea lui Warren și colab. [28]. P. p. imaginea asterius este utilizată cu permisiunea sondajului Texas Lepidoptera. Toate imaginile fluture au fost achiziționate de la http://butterfliesofamerica.com/L/Neotropical.htm. Imaginile zburătoare au fost achiziționate de la Malcolm Storey (www.discoverlife.org). (Versiune online color.)

Insectele (P. rapae, V. cardui și ambele specii de muște) din tratamentul neînsuflețit au exprimat un tipar de dimensiuni limitate ale porilor substratului care diferă de cele din tratamentul pre-alimentat (a se vedea materialul suplimentar electronic, tabelul S3). Aici, a existat o corelație puternică între măsurătorile părții bucale distale și limitarea dimensiunilor porilor substratului (d.f. = 3,16; R 2 = 0,6184, p = 0,2136; figura 3); de exemplu, C. vomitoria avea o dimensiune limitativă a porilor substratului care diferea de dimensiunile părții bucale cu doar 0,06 µm și P. rapae avea o diferență de doar 4,79 µm. Relația dintre dimensiunile limită ale porilor substratului și dimensiunile proximale ale părții bucale a fost slăbită din cauza dimensiunilor mari ale părții bucale proximale a muștelor (d.f. = 3,16; R 2 = 0,5937; p = 0,2295). Nu s-a observat că insectele din tratamentul nepăsat expulzează lichide în timpul hrănirii.

4. Discutie

Rezultatele noastre arată că dimensiunile limită ale porilor substratului sunt proporționale cu dimensiunile conductelor părții bucale atât pentru fluturi, cât și pentru muște, indicând paralele în mecanismele de absorbție a fluidelor. Atribuim acest mecanism fizic comun acțiunii capilare. Rolul capilarității este o componentă substudiată, dar evident importantă a procesului de absorbție a fluidelor [12,30], în special pentru îndepărtarea lichidelor din porii substratului. Nectarul, seva, mierea și alte lichide nutritive sunt probabil limitate la porii substratului, mai degrabă decât prezenți ca bazine; prin urmare, arhitecții aparatului bucal care pot exploata capilaritatea ar avea valoare adaptativă. Capacitatea de a utiliza acțiunea capilară ar fi, de asemenea, legată de hrănirea din solul udat (adică băltoacele), care este necesară pentru achiziționarea de sodiu, o substanță care afectează fitnessul [31-33]. În plus, selecția naturală ar favoriza împărțirea fluidelor de intrare în punți lichide pentru a reduce rezistența fluxurilor de lichid prin conductele piesei bucale [12].

Propunem un model fizic care se bazează pe alimentarea de pe suprafețe poroase și formarea punții lichide (figura 4). Puntile lichide formate în interiorul conductelor părții bucale (de exemplu, canalul alimentar) sunt legate prin capilare (adică spații între proiecțiile cuticulare) la lichidele din porii substratului. Pentru ca lichidul să se deplaseze de la pori până la punțile lichide, presiunea din interiorul podurilor trebuie să fie mai mică sau echivalentă cu presiunea din interiorul porilor substratului, astfel încât

unde p1 și p0 sunt presiunile în podurile și atmosfera lichidului, σ este tensiunea superficială a lichidului, θc și θp sunt unghiurile de contact ale lichidului pe suprafețele canalului alimentar și ale materialului substrat, iar rc și rp sunt razele canalului alimentar și porii substratului. Ca rezultat, relația dintre dimensiunea canalului alimentar rc și dimensiunea limită a porilor rp poate fi aproximată ca

unde Δp = p1 - p0. Legea scalării arată că diferența de presiune generată de pompele de aspirare a animalelor este independentă de dimensiunea corpului pompei sau a insectelor [34]; prin urmare, este rezonabil să comparăm dimensiunile limită ale porilor diferitelor specii de insecte. Această expresie explică relația liniară aproximativă între 1/rp și 1/rc pentru insectele pre-hrănite (a se vedea materialul suplimentar electronic; figura 2). Este important de reținut că dimensiunile limitate calculate ale porilor substratului calculate din experimente sunt estimări bazate pe diferitele tipuri de hârtie de filtru folosite și că speciile de fluturi și muște au valori diferite Δp și θc. Prin urmare, adaptarea ecuației (4.2) la datele experimentale este aproximativă. De la interceptarea potrivirii liniare (ecuația (4.2)) până la rezultatele experimentale, putem estima că Δp ∼ 1 kPa, care se află în cadrul presiunii de aspirație estimată din legea scalării (aprox. 10 kPa) [34].

Pre-hrănirea sporește capacitatea insectelor de a extrage lichide din substraturi poroase. Așa cum s-a observat în experimentele noastre, dimensiunile limitate măsurate ale porilor pentru insectele hrănite în prealabil au fost întotdeauna mai mici decât cele pentru insectele nealimentate. Atribuim această îmbunătățire comportamentului de expulzare a fluidului, care a fost observat de la muștele și fluturii pre-hrăniți atunci când părțile lor bucale atingeau substraturile poroase. Așa cum se arată în figura 4 d, fluidele expulzate fac posibilă conectarea lichidului din porii mici ai substratului la puntea lichidului din interiorul canalelor alimentare printr-o conductă capilară. Observațiile noastre completează constatările anterioare că muștele și fluturii expulzează fluidele în timp ce se hrănesc pe suprafețe uscate sau poroase [13,35,36].

Pentru insectele nepăsate, dimensiunile limitate măsurate ale porilor sunt aproximativ egale cu diametrul pieselor bucale distale și prezintă o dependență mică de dimensiunile proximale (figura 3). Întrucât dimensiunea limită a porilor pentru insectele nepăsate este mai mare decât cea pentru insectele pre-hrănite, inegalitatea din ecuația (4.1) este satisfăcută. Pentru insectele nealimentate care nu expulză fluidele, stabilirea unei legături între lichidul din porii substratului și conducta capilară (spațiile dintre proiecțiile cuticulare) este cheia eliminării lichidelor din pori. Această conexiune este posibilă numai atunci când proiecțiile cuticulare (de exemplu, legula dorsală; figura 1) pot intra în contact cu lichidele din porii substratului. În consecință, dimensiunea limită a porilor pentru insectele nepăsate este probabil să fie dictată nu numai de dimensiunile conductei părții bucale, ci și de dimensiunile proeminențelor cuticulare; aceste două variabile ar putea fi proporționale ca dimensiune și ar necesita studii viitoare. Mărimea limită a porilor substratului limită determinată anterior pentru fluturii monarhi necuviinți a fost de 35 µm, care se potrivește și cu măsurătorile lor distale ale conductei bucale [12] și susține metodologia și interpretarea datelor noastre.

Lepidopterele și Dipterele au piese bucale cu proiecții și distanțe cuticulare (figura 1) [4] care susțin mișcarea fluidului, prin capilaritate, de pe suprafețele poroase în conducte. Ambele grupuri au, de asemenea, creste cuticulare în canalele lor, care ar favoriza răspândirea circumferențială a fluidelor și ar facilita formarea podului lichid. Piesele bucale de Dipteran, spre deosebire de cele ale Lepidoptera, constau dintr-o serie de conducte mai mici (pseudotrahee) care radiază din deschiderea orală mai mare (figura 1). Relația dintre dimensiunea porilor substratului și diametrul pseudotraheilor indică faptul că punțile lichide se formează mai întâi în pseudotrahee, apoi se transferă spre deschiderea orală unde se unesc împreună pentru ca pompa de aspirare să acționeze asupra. Acest sistem ierarhic și nou de absorbție a fluidelor necesită o explorare suplimentară.

Studiile convenționale ale mecanismelor de absorbție a fluidelor la insecte descriu adesea sistemele de hrănire ale unui anumit organism [12,14,16,37] sau al unui grup de specii înrudite [23]. Rezultatele noastre demonstrează un fenomen răspândit în rândul insectelor care se hrănesc cu lichide. În plus, un mecanism similar de hrănire ar putea avea loc în alte grupuri de insecte, mai îndepărtate. Piesele bucale ale greierului care alimentează nectarul Glomeremus orchidophilus Hugel și colab. (Gryllacrididae) [38] și albina Apis mellifera L. (Apidae), de exemplu, ar putea implica și utilizarea acțiunii capilare [39-41] și ar putea prezenta o relație între dimensiunile spațiilor dintre structurile părții bucale și dimensiunile a porilor substratului din care se pot hrăni.

Dacă a avea conducte mai mici pentru bucată facilitează hrănirea cu dimensiuni mai mici ale porilor substratului, atunci de ce selecția naturală nu favorizează insectele să aibă conducte de dimensiuni tot mai mici? Sugerăm că perioadele de secetă au ca rezultat selecția direcțională în care sunt favorizate piesele bucale mai mici; cu toate acestea, perioadele umede ar favoriza dimensiuni mai mari ale piesei bucale (adică selecție oscilantă), așa cum s-a demonstrat cu dimensiunile ciocului de cintezi în Insulele Galapagos [42]. Când fluidele sunt abundente pentru insectele care hrănesc cu lichide, piesele bucale mai mari sunt favorizate, deoarece insectele dobândesc cantități mai mari de fluide pe perioada de hrănire, date fiind modelele actuale pentru relația dintre dimensiunile părții bucale și debitele [18,36,43].

Investigația noastră oferă o platformă pentru studii viitoare care pot examina modele de selecție oscilante ale dimensiunilor părții bucale și mecanisme de absorbție a fluidelor în diferite condiții de mediu și disponibilitatea fluidelor, care ar putea avea, de asemenea, implicații importante pentru microfluidică și biomimetică [12,18]. Având în vedere că selecția naturală favorizează insectele care pot dobândi substanțe nutritive în perioadele de secetă și că Diptera și Lepidoptera au dezvoltat independent arhitecții bucale care susțin aceste metode de absorbție a fluidelor (împărtășind un strămoș comun 280 Ma care avea piese bucale de mestecat) [44,45] că această convergență în mecanismul de absorbție a fluidelor susține acest lucru ca o strategie optimă pentru extragerea cantităților de lichide de pe suprafețele poroase.