• Găsiți acest autor pe Google Scholar
  • Găsiți acest autor pe PubMed
  • Căutați acest autor pe acest site
  • Record ORCID pentru Na Li
  • Pentru corespondență: [email protected]

Abstract

Declarație sumară Analiza microarray și qRT-PCR au fost utilizate pentru a determina expresia DSCAM-AS1 și miR-204-5p în BC. DSCAM-AS1 a promovat proliferarea și afectarea apoptozei celulelor BC prin reducerea miR-204-5p și îmbunătățirea expresiei RRM2.

tumorii

Introducere

Cancerul de sân (BC) este o afecțiune malignă obișnuită în întreaga lume și peste 370.000 de femei mor în fiecare an din cauza BC în întreaga lume (Wang și colab., 2017). Principala cauză a morbidității și mortalității BC este o boală metastatică incurabilă, care este foarte rezistentă la terapiile tradiționale (Xu și colab., 2017). În ciuda progreselor în diagnostic și terapie, cum ar fi chirurgia, chimioterapia și radiațiile, există rate ridicate de recurență și metastază în rândul pacienților cu BC (Wang și colab., 2015). În plus, tratamentul continuu cu radioterapie și chimioterapie duce la distrugerea mai puțin eficientă a celulelor canceroase datorită rezistenței dobândite (Vimalraj și colab., 2013). Prin urmare, mecanismele moleculare care stau la baza tumorigenezei BC trebuie investigate în continuare.

ARN-urile necodificate lungi (ARNc) sunt definite ca transcrieri care au mai mult de 200 de nucleotide și nu au capacitate de codificare a proteinelor (Xu și colab., 2017). S-a raportat că ARNc-urile implică progresia tumorii și metastaza prin reglarea diferitelor niveluri ale proceselor biologice, cum ar fi splicarea alternativă a ARNm, activitățile proteice, modificările localizării proteinelor etc. (Huarte, 2015; Xu și colab., 2017). Un număr tot mai mare de literaturi a raportat că ARNc-urile sunt strâns legate de cancerul uman și sunt implicate în controlul disponibilității pentru miARN specifice (Bartonicek și colab., 2016). În BC, au fost raportate o serie de ARNc-uri exprimate diferențial și corelația lor cu funcțiile tumorigenice (Xi și colab., 2017; Yan și colab., 2017; Zhou și colab., 2017). De exemplu, lncFOXO1 a fost în mod special reglementat în jos în BC și a inhibat creșterea BC prin creșterea transcripției FOXO1 (Xi și colab., 2017). În timp ce, linc-ITGB1 a fost foarte mult reglementat în BC, ceea ce a favorizat metastaza celulară (Yan și colab., 2017).

DSCAM (Down Syndrome Cell Adhesion Molecule) antisens lncRNA (DSCAM-AS1), situat pe 21q22.2, este transcris din catena antisens a DSCAM aparținând superfamiliei de imunoglobulină a moleculelor de adeziune celulară (Zhao și colab., 2014). Mai multe literaturi au raportat că DSCAM-AS1 este asociat cu progresia celulelor canceroase (Miano și colab., 2016; Niknafs și colab., 2016; Zhao și colab., 2014). Zhao și colab. a constatat că DSCAM-AS1 a fost supraexprimat în adenocarcinomul pulmonar și ar putea interacționa cu genele lor gazdă pentru a îndeplini funcția diferitelor subtipuri de cancer pulmonar (Zhao și colab., 2014). Miano și colab. a descoperit că supraexpresia DSCAM-AS1 a promovat creșterea unei linii celulare luminale de cancer de sân (Miano și colab., 2016). De remarcat, Yashar S și colab. a arătat că DSCAM-AS1 ar putea interacționa cu hnRNPL pentru a media progresia tumorii (Niknafs și colab., 2016). Cu toate acestea, întreaga poveste despre modul în care creșterea și progresia luminală a cancerului de sân mediată de DSCAM-AS1 rămâne în mare parte necunoscută. Prin urmare, este necesară o înțelegere suplimentară a țintelor și rețelelor reglementate de DSCAM-AS1.

Ribonucleotida reductază M2 (RRM2) este subunitatea catalitică a ribonucleotide reductazei, care este o enzimă esențială implicată în sinteza ADN și poate regla activitatea enzimatică a acesteia (Iwamoto și colab., 2015). Mai multe publicații au raportat că RRM2 a fost supraexprimat în diverse celule canceroase (Zhong și colab., 2016). Disregularea RRM2 în BC a fost investigată anterior în unele literaturi. De exemplu, RRM2 a fost supus reglării în celulele BC și ar putea acționa ca un marker critic pentru BC agresiv (Lu și colab., 2012). Shah și colab. a constatat că inhibarea RRM2 a suprimat creșterea tumorilor in vivo și a scăzut celulele migratoare și invazive în BC (Putluri și colab., 2014). Mai multe studii au indicat rolul RRM2 ca țintă a miARN în cancerele umane. Rezultatele experimentelor noastre au clarificat mecanismul de reglare între RRM2 și miR-204-5p.

În studiul actual, am măsurat nivelul de expresie al DSCAM-AS1 și miR-204-5p în celulele BC. Ulterior, am folosit un sistem de raportare dual-luciferază pentru a verifica corelația DSCAM-AS1 și miR-204-5p. Ulterior, efectele DSCAM-AS1 asupra proliferării BC, metastazelor de creștere și apoptozei au fost măsurate printr-o serie de experimente in vitro incluzând testul apoptozei celulare, testul CCK-8 și testul transwell și experimentele in vivo. În plus, am explorat și impactul RRM2 asupra activităților celulelor BC și asupra creșterii tumorii. Aceste rezultate au evidențiat faptul că DSCAM-AS1 poate fi o strategie terapeutică promițătoare pentru tratamentul BC uman.

Materiale și metode

Exemplare de țesut

Țesuturile BC și țesuturile adiacente au fost colectate între ianuarie 2014 și august 2015 de la 40 de pacienți ai Spitalului Centrului Afiliat, Universitatea de Medicină Xinxiang. Toate exemplarele au fost colectate de la femei cu vârste cuprinse între 44 și 71 de ani (vârsta medie: 62,3). Pacienții nu au primit chimioterapie sau radioterapie înainte de operație. Toate probele de țesut au fost verificate independent de trei patologi sau medici înainte de a se păstra în azot lichid la -80 ° C sau de a transfera în tuburi de microcentrifugă care conțin reactiv TRIzol pentru extracția ARN. Caracteristicile relevante ale acestor 40 de pacienți sunt descrise în Tabelul 1. Toate experimentele au fost efectuate cu consimțământul informat al pacienților și sub aprobarea Spitalului Centrului Afiliat, Universitatea Medicală Xinxiang.

Caracteristicile clinice și patologice ale subiecților studiați

Cultură de celule

Linia celulară de cancer mamar uman HCC1937 și linia celulară de rinichi embrionar uman HEK293 au fost achiziționate de la banca de celule a Academiei Chineze de Științe (Shanghai, China). Celulele HCC1937 au fost cultivate în mediu RPMI-1640 (GIBCO, Grand Island, NY, SUA) plus 10% (v/v) ser bovin fetal (FBS), 1,5 g/L de NaHCO3, 2,5 g/L glucoză, 0,11 g/L piruvat de sodiu și 1% (v/v) penicilină-streptomicină. Celulele HEK293 au fost menținute în mediu DMEM suplimentat cu 10% (v/v) FBS ȘI 1% (v/v) penicilină-streptomicină.

Analiza microarray

Datele despre țesutul tumorii mamare au fost colectate din baza de date TCGA. Pachetul R „DESeq2” a fost utilizat pentru a normaliza, identifica și vizualiza miARN și lncRNA exprimate diferențial (log2 | Fold Change |> 1 și s-a folosit metoda P.adjust - ΔΔCt pentru a cuantifica valorile relative ale expresiei ARNm. Sunt prezentate exemplele specifice utilizate în tabelul 2.

Exemple de secvențe pentru qRT-PCR

Western blot

Probele de proteine ​​au fost lizate în tampon RIPA (Beyotime, Shanghai, China) cu un cocktail de inhibitor de protează (Roche, Basel, Elveția). După centrifugare, concentrația de proteine ​​supernatante a fost măsurată cu reactivul Bradford (Bio-Rad, CA, SUA). După eluare cu tampon de încărcare SDS, proteinele au fost electroforizate în gel de electroforeză gel SDS-poliacrilamidă 10% (SDS-PAGE), transferate în membranele nitrocelulozice (Millipore, SUA) și blocate. Au fost adăugați anticorpi primari (anti-RRM2, ab172476, 1: 2000; anti-GAPDH, ab181603, 1: 10000, Abcam, Cambridge, MA, SUA). După ce s-a spălat extensiv cu TBST, s-a adăugat anti-corp secundar (capră anti-iepure IgG H&L (HRP), ab6721, 1: 2000, Abcam, Cambridge, MA, SUA) timp de 1,5 ore. Detectarea semnalului a fost efectuată prin imunoblotare cu un sistem ECL (Life Technology, SUA). Pentru cuantificarea relativă, am normalizat nivelul de expresie GADPH (ca nivel de gri) la 1 și am comparat nivelurile de expresie (nivel de gri) ale diferitelor grupuri experimentale prin intermediul software-ului ImageJ.

Citometrie în flux

Apoptoza celulară a fost evaluată prin trusa de detectare a apoptozei Annexin V-PE (Beyotime, Shanghai, China) urmând protocoalele producătorului. La 48 de ore după transfecție, celulele au fost spălate resuspendate în tampon de legare conținând iodură de propidiu (PI) și anexină V-FITC. Celulele colorate au fost analizate prin citometru de flux BD Accuri C6 (BD, SUA) utilizând software-ul Cell Quest Pro (BD, SUA).

Analiza CCK-8

8 × 10 3 celule HCC1937 pe godeu au fost incubate în 96 de godeuri și vitalitatea celulară a fost evaluată prin Kit de numărare a celulelor-8 (Biotechwell, Shanghai, China) la 0, 24, 48, 72 și 96 h conform instrucțiunilor producătorului. Absorbanța a fost înregistrată la 450 nm cu o platformă SpectraMax i3x Multi-Mode Detection (Molecular Devices, SUA).

Testul Transwell

Celulele au fost suspendate în mediu fără ser și plasate în camera superioară cu Matrigel acoperit dintr-o cameră cu 24 de godeuri (Sigma-Aldrich, MO, SUA). Medii de șase sute de microlitri care conțin 10% FBS au fost adăugați în camera inferioară peste noapte. Celulele migrate au fost fixate cu paraformaldehidă 4% și colorate cu violet de cristal. Celulele au fost clătite și numărate din câmpuri aleatorii (mărire × 100). Fiecare experiment a fost realizat în trei exemplare.

Testele reporterului Luciferase

Douăzeci și patru de ore înainte de transfecție, celulele HEK293 au fost însămânțate pe o placă cu 24 de godeuri (1 × 10 5/godeu), apoi celulele au fost co-transfectate cu pCMV-Renilla (Promega, WI, SUA) și cu plasmide raportor luciferază licurică pGL3 ( Promega, WI, SUA) conținând control negativ (NC) sau 3'UTR de miR-204-5p în aval de gena luciferază Firefly, împreună cu pLenti6.1-DSCAM-AS1, pLenti6.1-DSCAM-AS1 mut # 1 (regiunea 406-427 mutat), sau pLenti6.1-DSCAM-AS1 mut # 2 (regiunea 685-706 mutat) și pcDNA3.1 (+) - RRM2 sau pcDNA3.1 (+) - RRM2 mut # (regiunea 1949 -1956 mutat) folosind Lipofectamina 3000 (Invitrogen, CA, SUA) conform recomandărilor producătorului. Mutanții au fost generați prin PCR și secvența a fost prezentată în Fig2A-B, care au fost confirmate prin secvențierea ADN-ului. La patruzeci și opt de ore de la transfecție, activitățile luciferazei au fost efectuate folosind trusa de testare a reporterului dual-luciferază (Promega, WI, SUA). Apoi, licuriciul și activitățile de luciferază renilă au fost măsurate cu un luminometru Berthold (Bundoora, VIC, Australia).

Experiment pe animale

Pentru studiile in vivo, HEK293T au fost transduse în prezența de 8ug/ml polibren și crescute în mediu de cultură conținând 2ug/ml puromicină pentru a genera particule lentivirale pLenti6.1-DSCAM-AS1 și pLenti6.1-shDSCAM-AS1. Celulele HCC1937 au fost transduse de aceste particule lentivirale. Apoi, celulele au fost cultivate în mediu cu 3ug/ml de blasticidină pentru selecția stabilă a liniei celulare înainte de injectare subcutanată în flancul drept al șoarecilor nud femele (6-8 săptămâni). Dimensiunile tumorii au fost măsurate la fiecare 5 zile folosind un etrier. Volumul tumorii a fost estimat folosind formula V = (π/6) (W 2 * L), unde W = lățimea și L = lungimea tumorii. La 30 de zile după injecție, șoarecii au fost sacrificați și dimensiunea tumorii a fost utilizată ca obiectiv final al citirii. Toate studiile efectuate pe animale au fost aprobate de Spitalul Centrului Afiliat, Universitatea Medicală Xinxiang și în conformitate cu normele Spitalului Centrul Afiliat, Universitatea Medicală Xinxiang. Datele sunt prezentate ca volum mediu X ± S.E.

analize statistice

(A) QRT-PCR a indicat faptul că expresia DSCAM-AS1 a celulelor HCC1937 transfectate cu DSCAM-AS1 a fost semnificativ mai mare decât celulele transfectate cu sh-DSCAM-AS1. (B) Volumul tumoral al grupului DSCAM-AS1 a fost mai mare decât cel al grupului NC, cu o creștere în timp. (C) Greutatea tumorii a fost mult mai mare în grupul DSCAM-AS1 comparativ cu grupul NC în ziua 30. (D) Diagrama tumorală în ziua 30. (E) QRT-PCR a dezvăluit că expresia miR-204-5p în grupul DSCAM-AS1 a fost semnificativ mai mic decât cel din grupul NC. (F) QRT-PCR a arătat că expresia RRM2 a fost semnificativ mai mare în grupul DSCAM-AS1 comparativ cu grupul NC. (G) Western blot a dezvăluit că expresia proteinei RRM2 în grupul DSCAM-AS1 a fost semnificativ mai mare decât cea din grupul NC.

Discuţie

O serie de publicații au confirmat faptul că ARNcn sunt asociați cu tumorigeneză în BC (Cui și colab., 2017). În studiul de față, au fost investigate efectele lncRNA DSCAM-AS1 asupra BC. În primul rând, am constatat că DSCAM-AS1 a fost semnificativ reglat în sus, în timp ce miR-204-5p a fost reglat în jos în celulele BC prin analiza microarray și qRT-PCR. În al doilea rând, am dezvăluit că DSCAM-AS1 vizează direct miR-204-5p de către un sistem de raportare dual-luciferază. Între timp, rezultatele analizelor CCK-8, transwell și citometrie în flux au indicat faptul că DSCAM-AS1 a favorizat proliferarea celulelor BC și metastazarea și afectarea apoptozei celulare prin afectarea expresiei miR-204-5p. În plus, am examinat relația dintre miR-204-5p și RRM2 și am constatat că miR-204-5p inhibă expresia RRM2. Mai mult, o serie de experimente au demonstrat că RRM2 a contribuit la promovarea proliferării celulelor BC și a metastazei, precum și la suprimarea apoptozei celulare. Mai mult, experimentele in vivo au arătat că eliminarea DSCAM-AS1 ar putea suprima creșterea tumorii.

S-a raportat anterior că DSCAM-AS1 ca ARNcc oncogen este asociat cu mai multe tipuri de cancer uman (Niknafs și colab., 2016). DSCAM-AS1 a fost considerat un discriminant major în diferite linii de celule canceroase și tumori (Miano și colab., 2016). Experimentele noastre au arătat că DSCAM-AS1 a fost reglementat în sus în BC. În plus, supraexprimarea DSCAM-AS1 a favorizat reproducerea și metastaza celulară, precum și inhibarea apoptozei celulare în BC. O serie de rezultate similare au fost raportate în publicațiile anterioare. De exemplu, Niknafs și colab. a constatat că DSCAM-AS1 s-a exprimat la un nivel foarte ridicat în țesuturile BC și a promovat creșterea și invazia celulelor T47D in vivo (Niknafs și colab., 2016). Miano și colab. a demonstrat că a existat o reglare aberantă a DSCAM-AS1 în probele BC în comparație cu țesuturile adiacente, iar DSCAM-AS1 a fost legată de motilitatea, aderența și invazia celulelor canceroase (Miano și colab., 2016). Xu și colab. a dezvăluit că eliminarea DSCAM-AS1 a inhibat proliferarea celulelor BC și progresia ciclului, precum și creșterea apoptozei celulare in vitro (Xu și colab., 2017).

MiR-204-5p a fost prezis ca o moleculă anti-oncogenă în mai multe tipuri de cancer (Luo și colab., 2017). Mai multe publicații au raportat că expresia miR-204-5p a fost reglată în jos în diferite tumori și a acționat ca un puternic supresor tumoral care inhibă proliferarea tumorii și metastazele, inclusiv carcinom hepatocelular, carcinom cu celule scuamoase orale și BC (Jiang și colab., 2016; Wang și colab., 2016; Zeng și colab., 2016). În BC, Li și colab. a arătat că expresia miR-204 s-a redus semnificativ în comparație cu țesuturile BC adiacente normale și pierderea miR-204 ar putea favoriza proliferarea și invazia celulelor BC (Luo et al., 2017). În plus, miR-204-5p poate interacționa cu ARNcn pentru a efectua o reglare suplimentară a creșterii tumorii. Wang și colab. a constatat că reglarea descendentă a MALAT1 a crescut expresia miR-204 în celulele BC și a inhibat invazia celulară prin inversarea tranziției epiteliale-mezenchimale (Wang și colab., 2017). Pe baza cercetărilor anterioare, am cercetat în continuare relația dintre miR-204-5p și DSCAM-AS1 pe patologia BC. Rezultatele au indicat faptul că miR-204-5p a inhibat reproducerea celulelor BC și a îmbunătățit apoptoza celulară, a cărei expresie a fost inhibată de DSCAM-AS1.

RRM2, ca genă cheie în metabolismul pirimidinei, a fost corelată cu tumori umane variate (Putluri și colab., 2014). Literaturile anterioare au raportat că RRM2 a avut o expresie ridicată în cancer și a fost implicat în agresivitatea tumorii, prognostic slab și chimiorezistență (Shah și colab., 2015). De exemplu, Sturtz și colab. a demonstrat că RRM2 s-a exprimat la niveluri mai ridicate în țesuturile tumorale, asociate cu reglarea în sus a propagării celulare și a invazivității (Sturtz și colab., 2014). Shah și colab. a dezvăluit că RRM2 a fost supraexprimat în celulele BC rezistente la tamoxifen și a îmbunătățit proliferarea și metastaza celulelor MCF-7 BC (Shah și colab., 2015). În mod consecvent, am constatat că RRM2 a fost supus reglementării în BC. Între timp, o serie de rezultate experimentale au indicat că efectele RRM2 asupra activităților celulare BC au fost modificate invers cu miR-204-5p. Am investigat în mod clar mecanismul molecular care stă la baza DSCAM-AS1, miR-204-5p și RRM2 și am dezvăluit relația lor în BC pentru prima dată.

Cu toate acestea, unele deficiențe ale studiului nostru ar trebui luate în considerare în următoarele cercetări. De exemplu, experimentele in vitro ale DSCAM-AS1 și RRM2 ar trebui efectuate pentru a înțelege în mod cuprinzător rețeaua moleculară a DSCAM-AS1, miR-204-5p și RRM2 în BC.

Concluzie

În concluzie, am validat că DSCAM-AS1 a fost crescut în celulele BC, DSCAM-AS1 a promovat proliferarea și metastaza celulelor BC și a suprimat apoptoza celulară prin inhibarea miR-204-5p și creșterea expresiei RRM2. Prin urmare, acest studiu sugerează că inhibarea DSCAM-AS1 poate fi o strategie terapeutică promițătoare pentru tratamentul BC.

Dezvăluire

Interese concurente

Autorii declară că nu există interese concurente asociate manuscrisului.

Aprobarea eticii și consimțământul de participare

Toate procedurile efectuate în studii care au implicat participanți umani și animale au fost în conformitate cu standardele etice ale Spitalului Centrului Afiliat, Universitatea de Medicină Xinxiang. Au fost obținute consimțământuri scrise de la toți participanții individuali incluși în studiu.

Consimțământul pentru publicare

Autorii sunt de acord cu publicarea.

Disponibilitatea datelor și a materialului

Seturile de date utilizate și analizate în timpul studiului curent sunt disponibile de la autorul relevant la o cerere rezonabilă.

Contribuțiile autorilor

Contribuție substanțială la concepția și proiectarea operei: Wen-Hui Liang și Na Li; Analiza și interpretarea datelor: Zhi-Qing Yuan, Zhi-Hui Wang și Xin-Lai Qian; Redactarea manuscrisului: Wen-Hui Liang și Na Li; Revizuirea critică a lucrării pentru un conținut intelectual important: Na Li; Colectarea de subvenții: Na Li; Aprobarea finală a lucrării: Toți autorii.

Finanțarea

Acest studiu a fost susținut parțial de subvenții de la Fundația de Științe Naturale din provincia Henan, China (nr. 162300410220), Comisia educațională a provinciei Henan, China (nr. 16A310002, nr. 18A310004), Fundația pentru știință și tehnică a provinciei Henan, China (Nr. 201403133).