1 Colegiul științei și tehnologiei vieții, Universitatea pentru naționalități din sud-vest, Chengdu 610041, China

conservanților

Abstract

1. Introducere

Staphylococcus aureus (S. aureus) este un agent patogen bacterian major care provoacă infecții clinice și boli de origine alimentară [1]. Organismul este robust, ceea ce îi permite să crească în multe tipuri de alimente preparate sau depozitate necorespunzător și să producă enterotoxine stafilococice (SE). SE sunt agenții cauzatori ai intoxicației alimentare cu stafilococ (SFP) [2]. Chiar dacă bacteriile pot fi ucise prin tratamentul termic al alimentelor, SE sunt rezistente la căldură. Astfel, deși bacteriile sunt eliminate, toxinele vor rămâne în alimente și vor provoca ulterior SFP [3].

Până în prezent, mai mult de douăzeci și patru de SE și proteine ​​asemănătoare enterotoxinelor stafilococice (SEls) au fost identificate și desemnate SEA la SElY [4-6]. Aceste SE/SE-uri au fost tradițional împărțite în tipuri clasice (SEA-SEE) și noi (SEG-SElY). Se presupune că SE sunt toxinele care provoacă emeză; SEl-urile asociate fie nu au activitate emetică, fie nu au fost încă examinate [4]. În ultimii ani, mai multe studii indică faptul că SEG și SEI pot fi responsabile pentru cazurile de SFP la om [7-9]. Cu toate acestea, kiturile comerciale pentru detectarea imunologică a proteinei SEI nu sunt disponibile în prezent [10, 11]. Astfel, există date foarte limitate privind producția SEI.

Conservanții alimentari sunt folosiți pe scară largă pentru a reduce riscul de otrăvire alimentară. Conservanții convenționali sunt substanțe chimice sintetice precum nitritul de sodiu, benzoatul de sodiu și sorbatul de potasiu. Din cauza efectelor secundare, se reconsideră utilizarea conservanților artificiali [12]. Odată cu creșterea cererii consumatorilor de conservanți naturali pentru a înlocui compușii chimici, se dezvoltă noi produse antimicrobiene de diferite origini, inclusiv produse derivate de la animale (lizozime, lactoperoxidază, chitosan, peptidă antimicrobiană și altele), produse derivate din plante (polifenolici, uleiuri esențiale), peptide antimicrobiene vegetale și altele) și metaboliți microbieni (nisină, natamicină, ε-polilizină, acid organic și altele). Aceste produse trebuie investigate pentru potențialul de a controla agenții patogeni de origine alimentară din alimente.

În acest studiu, efectele comparative ale mai multor conservanți alimentari: nitrit de sodiu, polilizină, chitosan și catehină de ceai asupra creșterii bacteriilor, tu expresia genelor și secreția extracelulară SEI dintr-o penicilină rezistentă S. aureus izolatul H4 asociat cu otrăvirea alimentară a fost detectat pentru a evalua aceste produse pentru a fi utilizate ca agenți antimicrobieni în conservarea alimentelor.

2. Materiale și metode

2.1. Numărarea plăcilor bacteriene
2.2. PCR cantitativ în timp real

PCR cantitativă în timp real a fost utilizată pentru a detecta nivelul relativ de ARNm de tu în S. aureus H4 tratat cu conservanți alimentari. După incubare timp de 24 de ore, 200 mL de suspensie celulară au fost colectate și centrifugate la 10.000

timp de 15 min. Supernatantul a fost recoltat pentru următoarea cuantificare a proteinei SEI și celulele au fost lizate prin tampon TE (10 mmol/L Tris-HCI, 1 mmol/L EDTA, pH = 8,0) suplimentat cu 3 mg/ml lizozimă. ARN-ul total a fost extras cu reactiv TRIzol® (Tiangen, Beijing, China) conform protocolului produsului. Concentrația de ARN a fost detectată într-un spectrofotometru (Biowave II, Biochrom, UK) și 2 μg ARN a fost utilizat pentru a sintetiza ADNc prin transcriere inversă cu un kit de reactivi PrimeScript® RT (Fermentas Life Science, Hanover, MD, SUA) așa cum este descris în instrucțiunile producătorului.

PCR cantitativă pe bază de fluorescență în timp real a fost efectuată la o temperatură de fluorescență iCycler (Bio-Rad, Hercules, CA, SUA). Primerii specifici pentru tu gena pe care am clonat-o anterior (numărul de acces GenBank: KT853046.1) au fost sei-qF: 5′-TGCCTTTACCAGTGTTATT-3 ′ și sei-qR: 5′-AGGACAATACTTAAATTCTGCT-3 ′. Acești primeri au fost proiectați cu software-ul Primer Premier 5.0 și specificitatea primerilor a fost testată prin PCR. Condițiile pentru amplificarea PCR au fost 120 s la 95 ° C, urmate de 39 de cicluri de 10 s la 95 ° C, 30 s la 55 ° C și 30 s la 72 ° C. Ciclul de prag (CT) a fost analizat cu un

metoda [14]. FtsZ (grunduri: FtsZ-F 5'-TGAAGATGCAATCCAAGGTG-3 'și FtsZ-R 5'-GTTAATGCGCCCATTTCTTT-3') a fost utilizat ca control de încărcare pentru normalizare.

2.3. Sandwich dublu anticorp ELISA

Sandwich-ul cu dublu anticorp ELISA a fost dezvoltat pentru detectarea secreției SEI din S. aureus H4 cu administrare de conservanți alimentari așa cum s-a descris anterior [13]. Pe scurt, 2,89 μg/ml anticorp monoclonal împotriva SEI în PBS a fost acoperit în placă de microtitrare peste noapte la 4 ° C; placa a fost blocată cu 5% lapte degresat în PBS la 37 ° C timp de 60 min. 0,1 ml supernatant de S. aureus H4 colectat la a 24-a oră a fost adăugat la fiecare godeu la 37 ° C timp de 60 min, spălat extensiv cu PBS conținând 0,05% Tween-20, urmat de incubare cu 0,1 mL, anticorp policlonal împotriva SEI (diluare 1: 1000) la 37 ° C timp de 60 min și spălat din nou. Apoi, 0,1 mL, capră anti-iepure IgG-hrean peroxidază (diluare 1: 6000, Santa Cruz, SUA) a fost adăugată la fiecare godeu la 37 ° C timp de 60 min și spălată din nou. Ulterior, s-au utilizat 0,1 ml soluție de tetrametilbenzidină (TMB) și, în cele din urmă, s-a folosit H2SO4 pentru a termina reacția. Măsurarea a fost efectuată la 450 nm fotometric.

2.4. Analize statistice

Datele au fost prezentate ca

iar diferențele dintre tratamentele și controalele pentru conservanții alimentari au fost analizate statistic folosind SPSS13.0 (SPSS, Chicago, IL, SUA).

3. Rezultate

3.1. Numărarea plăcilor bacteriene

Numarul S. aureus H4 cu diferite tratamente pentru conservanții alimentari a fost determinat prin numărarea viabilă a plăcilor, așa cum se arată în Figura 1. Toți acești conservanți au fost deprimați S. aureus Creșterea H4, în special la concentrații maxime admise (Figura 1 (a)). Este demn de menționat faptul că 0,8 g/L ceai catehină a perturbat absolut bacteriile după 24 de ore de incubație; astfel, concentrația de catehină de ceai a fost ajustată la 0,4 g/L. Ulterior, cea mai bună doză de conservant alimentar pentru următorul studiu sau comparație a fost 0,15 g/l azotit de sodiu, 0,25 g/l polilizină, 6 g/l chitosan și 0,4 g/l catehină de ceai. Ordinea efectului inhibitor a fost 6 g/L chitosan> 0,25 g/L polilizină> 0,4 ​​g/L ceai catehină> 0,15 g/L azotit de sodiu de la 12 la 48 de ore de incubare (Figura 1 (b)). Prin urmare, părea că conservanții naturali: chitosan, polilizină și catehină de ceai au fost mai eficienți decât compusul chimic azotit de sodiu în inhibarea S. aureus creştere.

3.2. Efectul conservanților alimentari asupra tu Transcrierea genei

Mai mult, nivelul relativ de ARNm de tu expresie genică în S. aureus H4 a fost detectat prin PCR cantitativă în timp real. Rezultatele au indicat că 0,25 g/L polilizină (

) sau 0,15 g/L azotit de sodiu (

) nu s-a modificat semnificativ tu transcriere genică, în timp ce 6 g/L chitosan (versus,

) a crescut evident nivelul relativ de ARNm de tu expresia genelor. 0,4 g/L ceai catehină inhibată remarcabil tu transcrierea genei (

versus,) (Figura 2). Astfel, numai catehina de ceai a prevenit tu transcriere.


3.3. Influența diferiților conservanți alimentari asupra producției extracelulare SEI

În plus, producția extracelulară de SEI a fost testată prin ELISA sandwich cu dublu anticorp. După cum se arată în Figura 3 (a), 0,15 g/L azotit de sodiu (

ng/celulă versus ng/celulă) și 6 g/L chitosan (ng/celulă versus ng/celulă) au îmbunătățit semnificativ secreția SEI; Creșterea proteinei SEI prin chitosan a fost în concordanță cu rezultatul PCR, în timp ce 0,25 g/L polilizină (ng/celulă versus ng/celulă), în special 0,4 g/L catehină de ceai (ng/celulă versus ng/celulă), inhibată brusc nivelul secreției SEI. Dintre acești conservanți alimentari, catehina de ceai nu numai că nu este reglementată tu transcrierea genei, dar și-a deprimat secreția proteică. Pe de altă parte, cu excepția nitritului de sodiu, toți cei trei conservanți alimentari naturali au redus în mod remarcabil concentrația totală extracelulară de SEI în cultura TSB (Figura 3 (b)).

4. Discutie

În zilele noastre, consumatorii doresc alimente mai convenabile, gata de consum. Mâncarea convenabilă oferă un mediu de creștere adecvat pentru S. aureus, un agent patogen important asociat cu boli de origine alimentară, inclusiv sindromul șocului toxic și otrăvirea alimentară prin secretarea unei largi varietăți de SE/SE [15]. Pentru a produce alimente de înaltă calitate, sigure din punct de vedere microbiologic pentru consumatori, au fost necesare date privind producția de SE/SEl în medii de conservanți pentru a îmbunătăți înțelegerea existentă despre creșterea și supraviețuirea S. aureus în culturi lichide.

În acest studiu, am evaluat efectele nitritului de sodiu, polilizinei, chitosanului și catechinei de ceai asupra creșterii S. aureus H4. Toți conservanții testați au inhibat creșterea bacteriană și 0,8 g/L ceai catehină a fost letală S. aureus. După 24 ore de incubație, numărul de celule bacteriene a fost la fel de martor> 0,15 g/l azotit de sodiu> 0,4 ​​g/l ceai catehină> 0,25 g/l polilizină> 6 g/l chitosan. Se părea că cei trei conservanți naturali pentru alimente au fost mai eficienți în inhibarea creșterii bacteriilor decât conservantul chimic pentru alimente nitrit de sodiu la aceste concentrații.

Pe de altă parte, polifenolii din ceai includ catehine, flavonoide, taninuri și theaflavine. Acești compuși oferă beneficii potențiale pentru sănătate [20]. Catechinele sunt compuse din epigalocatechin-3-galat (EGCG), epicatechin, epicatechin-3-gallat și epigalocatechin. Principalul ingredient activ EGCG reprezintă aproximativ 59% din totalul catechinelor [21]. Un raport a sugerat că EGCG încărcat negativ își exercită activitatea antibactericidă prin legarea de lipidele încărcate pozitiv ale membranei celulare bacteriene, ducând la deteriorarea stratului lipidic [22, 23]. Un alt raport a indicat faptul că catehina ceaiului EGCG a inhibat producția de SEB în mod dependent de doză și timp [24]. Sunt necesare lucrări suplimentare pentru a determina efectele catechinei de ceai EGCG asupra diferitelor producții de SE și dacă EGCG are proprietăți neutralizante față de alte superantigene stafilococice. În experimentul nostru, catehina de ceai nu numai că a fost puternic inhibată S. aureus Creșterea H4, dar și deprimată tu producția de ARNm și proteine, care a fost în concordanță cu raportul lui Hisano.

Luate împreună, am detectat și comparat efectele conservanților alimentari: nitrit de sodiu, polilizină, chitosan și catehină de ceai asupra penicilinei rezistente S. aureus Creșterea H4 și producția SEI. Rezultatele noastre au indicat faptul că conservanții naturali exercită o activitate antibacteriană mai mare decât compusul chimic, iar catechina ceaiului a fost cea mai eficientă dintre cele patru tipuri de conservanți alimentari în inhibarea S. aureus creșterea și producția SEI. Ancheta a fost utilă pentru ca industria alimentară să ofere produse alimentare mai sigure datorită S. aureus strategia de control legată de enterotoxine.

Interese concurente

Toți autorii declară că nu au niciun conflict de interese. Niciunul dintre autori nu are o relație financiară sau personală cu alte persoane sau organizații care ar putea influența sau influența necorespunzător conținutul acestei lucrări.

Mulțumiri

Această lucrare a fost susținută în comun de Fundația Națională pentru Științe Naturale din China (31371781, 31400794), Programele de cercetare de bază aplicate din provincia Sichuan (2014JY0253) și Talentul excelent al noului secol în universitate (NCET-11-0847).

Referințe