Departamentul de Chirurgie Ortopedică, Universitatea Washington, Universitatea Couch Biomedical Research, Camera 3121, Campus Box 8233, Saint Louis, Missouri 63110

Spitale Shriners pentru copii - St. Louis, Saint Louis, Missouri 63110

Departamentul de Inginerie Biomedică, Universitatea Washington, Saint Louis, Missouri 63110

Departamentul de Chirurgie Ortopedică, Universitatea Washington, Universitatea Couch Biomedical Research, Camera 3121, Campus Box 8233, Saint Louis, Missouri 63110

Spitale Shriners pentru copii - St. Louis, Saint Louis, Missouri 63110

Departamentul de Chirurgie Ortopedică, Universitatea Washington, Centrul de Cercetări Biomedice Couch, Camera 3121, Campus Box 8233, Saint Louis, Missouri 63110

Spitale Shriners pentru copii - St. Louis, Saint Louis, Missouri 63110

Departamentul de Chirurgie Ortopedică, Universitatea Washington, Universitatea Couch Biomedical Research, Camera 3121, Campus Box 8233, Saint Louis, Missouri 63110

Spitale Shriners pentru copii - St. Louis, Saint Louis, Missouri 63110

Departamentul de Chirurgie Ortopedică, Universitatea Washington, Universitatea Couch Biomedical Research, Camera 3121, Campus Box 8233, Saint Louis, Missouri 63110

Spitale Shriners pentru copii - St. Louis, Saint Louis, Missouri 63110

Departamentul de Inginerie Biomedică, Universitatea Washington, Saint Louis, Missouri 63110

Corespondență cu: Farshid Guilak (T: + 314‐362‐7239; E-mail: [email protected])

Departamentul de Chirurgie Ortopedică, Universitatea Washington, Universitatea Couch Biomedical Research, Camera 3121, Campus Box 8233, Saint Louis, Missouri 63110

Spitale Shriners pentru copii - St. Louis, Saint Louis, Missouri 63110

Departamentul de Inginerie Biomedică, Universitatea Washington, Saint Louis, Missouri 63110

Departamentul de Chirurgie Ortopedică, Universitatea Washington, Universitatea Couch Biomedical Research, Camera 3121, Campus Box 8233, Saint Louis, Missouri 63110

Spitale Shriners pentru copii - St. Louis, Saint Louis, Missouri 63110

Departamentul de Chirurgie Ortopedică, Universitatea Washington, Universitatea Couch Biomedical Research, Camera 3121, Campus Box 8233, Saint Louis, Missouri 63110

Spitale Shriners pentru copii - St. Louis, Saint Louis, Missouri 63110

Departamentul de Chirurgie Ortopedică, Universitatea Washington, Universitatea Couch Biomedical Research, Camera 3121, Campus Box 8233, Saint Louis, Missouri 63110

Spitale Shriners pentru copii - St. Louis, Saint Louis, Missouri 63110

Departamentul de Chirurgie Ortopedică, Universitatea Washington, Universitatea Couch Biomedical Research, Camera 3121, Campus Box 8233, Saint Louis, Missouri 63110

Spitale Shriners pentru copii - St. Louis, Saint Louis, Missouri 63110

Departamentul de Inginerie Biomedică, Universitatea Washington, Saint Louis, Missouri 63110

Corespondență cu: Farshid Guilak (T: + 314‐362‐7239; E-mail: [email protected])

ABSTRACT

Pentru a studia mai direct mecanismele care leagă obezitatea și OA, s-au dezvoltat modele animale de obezitate folosind fie o dietă bogată în grăsimi 10-14, fie ablația genetică a semnalizării leptinei (de ex., ob/ob sau db/db șoareci). 15 Studii multiple au arătat o severitate crescută a OA spontan 15-17 sau OA 7, 13, 14 indusă de leziuni la animalele hrănite cu o dietă bogată în grăsimi, dar lipsa OA spontană la șoarecii obezi cu deficiență de leptină hrăniți cu o dietă standard de chow . 15

Există, de asemenea, dovezi în creștere că compoziția dietetică în sine poate contribui la OA indusă de obezitate. În plus față de conținutul caloric, există dovezi din ce în ce mai mari că compoziția dietei, în special conținutul de acizi grași, poate avea efecte semnificative asupra severității OA într-o manieră specifică articulațiilor. 7, 10, 18, 19 De exemplu, dietele bogate în grăsimi compuse în principal din acizi grași saturați (SFA) sau acids - 6 acizi grași polinesaturați (PUFA) prezintă o OA la genunchi indusă de leziuni considerabil mai slabă decât omologii cu greutate potrivită dietă grasă cu ω - 3 PUFA sau o dietă standard pentru șoareci. 10 Aceste studii au observat că o dietă bogată în grăsimi suplimentată în ω - 3 PUFA protejează genunchiul de OA indusă de leziuni, în timp ce dietele bogate în grăsimi bogate în SFA și ω - 6 PUFA exacerbează degenerarea cartilajului și sinovita după leziuni la genunchi. Cu toate acestea, nu s-a observat niciun efect semnificativ al creșterii FA-3 PUFA dietetice asupra dezvoltării OA spontană în articulația genunchiului. 7, 10, 20

Scopul acestui studiu a fost de a determina dacă conținutul de acizi grași din dietă a influențat apariția modificărilor structurale spontane ale OA și ale oaselor la șoarecii obezi cu conținut ridicat de grăsimi. Șoarecii au fost hrăniți fie cu o dietă chow de control cu ​​conținut scăzut de grăsimi, fie cu diete bogate în grăsimi bogate în ω - 3 PUFA, ω - 6 PUFA sau SFA. Am emis ipoteza că dieta bogată în FA - 3 PUFA ar avea un efect protector asupra cartilajului și a oaselor. Osul, cartilajul și sinoviul capetelor humerale au fost analizate pentru modificări asociate OA folosind tomografia micro-computerizată (MicroCT) pentru a examina microstructura osoasă, microscopia cu forță atomică (AFM) pentru a examina proprietățile mecanice ale cartilajului la scară mică și gradarea histologică la evaluează degenerarea cartilajului și inflamația sinovială.

METODE

Model animal

Începând cu vârsta de 4 săptămâni, șoarecii masculi C57BL/6J au fost hrăniți timp de 24 de săptămâni fie cu o dietă cu conținut scăzut de grăsimi (10% kcal), fie una din cele trei diete bogate în grăsimi (60% kcal) bogate în ω - 3 PUFA, ω - 6 PUFA sau SFA. Acești șoareci au fost inițial dezvoltați pentru un studiu anterior care investiga modul în care acizii grași din dietă afectează dezvoltarea OA a genunchiului și au fost raportate date privind conținutul dietetic, greutățile corporale, severitatea OA a genunchiului, măsurarea citokinelor și lipidelor serice și răspunsul la vindecarea rănilor urechii. 7, 10 Astfel, nu au fost utilizate animale vii în prezentul studiu, dar toate procedurile anterioare de utilizare a animalelor au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor. 7, 10 Toate exemplarele au fost depozitate la -20 ° C după eutanasie. Înainte de analiză, specimenele au fost decongelate la 4 ° C, iar capetele humerale au fost izolate.

Analiza MicroCT a osului trabecular și cortical

Capetele humerale au fost fixate în paraformaldehidă 4% timp de 24 de ore la temperatura camerei (n = 12-15 pe grup de dietă). Eșantioanele au fost apoi deshidratate în etanol și scanate în aer cu MicroCT (SkyScan 1176, Bruker, Billerica, MA) la o rezoluție de 9 µm/pixel, o tensiune de raze X de 55 kV, curent 455 μA, timp de expunere 980 ms, mediu de 3x cadru, și filtrarea fasciculului cu filtru de aluminiu de 0,5 mm. Densitatea minerală osoasă a fost calibrată utilizând fantome de hidroxiapatită (Bruker). Regiunile trabeculare ale capului humeral au fost definite ca volumul dintre placa osoasă subcondrală și placa proximală de creștere. Fiecare regiune a fost analizată folosind extensia BoneJ în ImageJ. S-au calculat fracțiunea volumului osului trabecular (BV/TV), grosimea trabeculară (Tb.Th) și separarea trabeculară (Tb.Sp). Regiunile osoase corticale au fost analizate folosind pachetul software CTan automat (Bruker). Secțiunea transversală a osului cortical și grosimea au fost calculate din 20 de felii situate la două regiuni diafizare: 0,5 mm de aspectul distal al capului humeral și la aspectul distal al tuberozității deltoide (n = 6-14).

Microscopia forței atomice

Deflexia în consolă și mișcarea z - piezo au fost înregistrate pentru fiecare punct de indentare din software-ul Asylum Research și analizate folosind un script personalizat MATLAB (The MathWorks, Natick, MA). Modulul elastic al țesutului a fost definit folosind un model Hertz modificat așa cum a fost descris anterior. 28, 31-33 Extrapolarea punctului de contact a fost utilizată pentru a determina punctul în care consola a contactat suprafața. Imaginile de fluorescență au fost suprapuse pe hărțile de rigiditate pentru a identifica fiecare punct de indentare ca ECM sau PCM. Punctele de analiză din corpul celulei au fost excluse din analize ulterioare. Punctele de date au fost, de asemenea, excluse dacă depășeau de 2,5 ori media valorilor înconjurătoare; în acest caz, au fost înlocuite cu valoarea medie a punctelor adiacente. Pentru a trasa modulul în raport cu distanța față de centrul celulei, imaginea fluorescentă a fiecărei regiuni a celulei a fost pragată în MATLAB și s-au calculat moduli medii pentru fiecare inel gros de 0,5 μm definit radial începând de la marginea celulei. Datorită densității mari a condrocitelor din cartilajul murin, modulul mediu a fost trunchiat la valoarea maximă pentru a evita includerea regiunilor de PCM din condrocitele învecinate.

Analiză histologică și notare

Capetele humerale au fost fixate în paraformaldehidă 4%, decalcificate folosind Calex II (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) și încorporate în parafină. Probele au fost secționate la 8 µm și colorate folosind safranin-O, verde rapid și hematoxilină pentru clasificarea OA sau hematoxilină și eozină pentru clasificarea sinovitei. Fenotipul cartilajului a fost clasificat folosind un sistem modificat de notare Mankin de către doi indivizi orbiți. 7, 13 Această clasificare a constat din următoarele categorii: Structura suprafeței cartilajului (0-11), dublarea marcajului (0-3), colorarea Safranin-O (0-8), clonele condrocitelor din cartilajul necalcificat (0-2), hipertrofice condrocite în cartilajul calcificat (0-2) și grosimea osului subcondral (0-2). Scorul total posibil a fost de 28. Inflamația sinovială a fost evaluată de doi marcatori orbi, folosind un sistem de notare stabilit. 13 Aceasta a constat din următoarele categorii: Mărirea stratului celular de căptușeală sinovială (0-3) și densitatea celulelor din căptușeala sinovială (0-3). Grosimea cartilajului necalcificat și calcificat și a plăcii subcondrale au fost determinate folosind imagini histologice reprezentative. S-a luat o medie de cinci măsurători de grosime pentru fiecare îmbinare.

Analize statistice

Semnificația dintre grupurile de dietă pentru rezultatele osoase și AFM a fost determinată de ANOVA unidirecțional și Tukey post-hoc teste. Pentru scorurile de gradare histologică discrete, semnificația a fost determinată folosind un test Kruskal-Wallis. Datele sunt prezentate ca medie ± eroare standard a mediei (SEM). Valorile aberante au fost determinate folosind un test ROUT (Î = 1%). Toate statisticile au fost efectuate în Prism 7.03 (GraphPad Software, La Jolla, CA).

REZULTATE

Analiza MicroCT a regiunii trabeculare epifizare humerale (Fig. 1A) nu a arătat niciun efect al compoziției dietetice a acizilor grași asupra BMD (Fig. 1B) sau Tb.Th (Fig. 1D). Fracțiunea volumului osos BV/TV (Fig. 1C) și Tb.Sp (Fig. 1E) au fost semnificativ diferite între grupurile de dietă. BV/TV a scăzut semnificativ atât în ​​grupurile de dietă ω - 6, cât și în cele cu dietă SFA, în timp ce Tb.Sp a crescut doar pentru grupul de dietă SFA, comparativ cu grupul de dietă control.

efectele

În osul cortical, două regiuni au fost analizate și prezentate ca regiune corticală proximală și regiune corticală distală (Fig. 2A). Modificări mai pronunțate ale DMO pot fi observate în regiunea corticală distală, dar diferențe semnificative datorate dietei s-au găsit în ambele regiuni (Fig. 2B și C). Interesant este că dieta cu grăsimi saturate arată o DMO mai scăzută în regiunea proximală, dar nu și în regiunea distală. În regiunea proximală, numai grupul de dietă ω - 3 a avut o scădere a suprafeței (Fig. 2D); cu toate acestea, toate dietele bogate în grăsimi au dus la o scădere semnificativă a ariei secțiunii transversale medii în regiunea distală față de controalele standard ale chow-ului (Fig. 2E). Grosimea corticală a regiunii proximale în grupul ω - 3 a fost, de asemenea, scăzută semnificativ din toate celelalte diete (Fig. 2F), dar grosimea regiunii distale nu a prezentat dependență de dietă (Fig. 2G).

Testarea mecanică utilizând AFM ghidat cu imunofluorescență (Fig. 3A) nu a arătat modificări semnificative în valorile modulului cartilajului nici pentru ECM în vrac, nici pentru PCM din jurul condrocitului (Fig. 3C). Progresia modulului de la PCM mai moale la ECM mai rigidă nu a fost modificată în mod semnificativ de dietă, deși șoarecii hrăniți cu dietă SFA au arătat o tendință spre modul redus (Fig. 3D). O hartă reprezentativă a rigidității (Fig. 3B) arată PCM mai moale care înconjoară celula și progresia treptată către ECM mai rigidă.

O imagine histologică reprezentativă a unui cap humeral din grupul de control este prezentată în Figura 4A, iar imaginile mărite ale suprafeței cartilajului din fiecare grup de dietă sunt prezentate în Figura 4B. În timp ce scorul global modificat Mankin nu a arătat diferențe cu dieta (Fig. 5A), două subcategorii au variat în funcție de dietă. Numărul de condrocite hipertrofice în cartilajul calcificat (Fig. 5B) a crescut semnificativ în grupele ω - 6 și SFA comparativ cu dietele ω - 3 și de control. De asemenea, numărul clonelor condrocitelor din cartilajul necalcificat (Fig. 5C) a fost redus semnificativ în dieta ω - 6 față de toate celelalte grupuri de dietă. Coroborarea fenotipului cartilajului absent, grosimile respective ale regiunilor cartilajului necalcificat (Fig. 5D) și calcificat (Fig. 5E) au fost, de asemenea, independente de dietă. Cu toate acestea, grosimea plăcii osoase subcondrale măsurată din imaginile histologice a fost redusă semnificativ în dieta ω - 3 comparativ cu toate celelalte grupuri de dietă (Fig. 5F).

Gradul de inflamație sinovială a fost evaluat utilizând o scară de gradare a sinovitei, care ține cont atât de grosimea, cât și de celularitatea căptușelii sinoviale. Secțiunile histologice reprezentative pentru fiecare grup de dietă sunt prezentate în Figura 6A. Nu s-au observat diferențe semnificative statistic în scorul numeric general pentru inflamația sinovială (Fig. 6B).

DISCUŢIE

Acest studiu a arătat că compoziția cu acizi grași a dietelor bogate în grăsimi, în absența leziunilor articulare, a cauzat modificări semnificative în calitatea osoasă a humerusului. În special, dieta bogată în FA - 3 PUFA protejează împotriva pierderii osoase humerale în comparație cu dietele bogate în grăsimi ω - 6 și SFA. În schimb, s-au observat puține modificări ale proprietăților cartilajului articular cu compoziția acizilor grași din dietă, chiar și la microscop. Modificările observate, de exemplu, numărul crescut de condrocite hipertrofice, pot fi asociate cu remodelarea osoasă.

Este bine recunoscut faptul că formarea și calitatea oaselor pot, cel puțin, să depindă parțial de nivelurile de activitate (adică, încărcarea potențială pe schelet). 49 În ciuda faptului că nu am observat modificări semnificative în activitatea locomotorie spontană la șoarecii hrăniți cu diete bogate în grăsimi sau de control în lucrările noastre anterioare publicate, 10 nu este clar dacă locomoția spontană este un model optim pentru a investiga încărcarea greutății pe scheletul umărului . Pentru a examina modul în care nivelul de activitate afectează calitatea oaselor umărului, studiile viitoare pot dori să utilizeze teste comportamentale care sunt mai concentrate pe activitatea membrelor superioare, cum ar fi cățărarea verticală. 50

Aceste efecte minime ale dietei și obezității asupra structurii cartilajului au fost susținute de rezultatele că dietele noastre bogate în grăsimi nu au modificat proprietățile mecanice ale PCM și ECM. Am demonstrat anterior că modificările atât ale modulului ECM, cât și ale modulului PCM, precum și o schimbare a gradientului proprietăților mecanice de la PCM la ECM, reflectă degradarea matricei în OA, în special în apropierea condrocitelor individuale. 28 Deși aceste constatări sugerează că umărul nu este ușor susceptibil la OA indusă de obezitate, lipsa modificărilor cartilajului macro- sau microscopic ar putea fi cauzată de alți factori. De exemplu, astfel de modificări pot apărea pe o perioadă mai lungă de timp decât 24 de săptămâni pe o dietă bogată în grăsimi, iar scala de timp a progresiei bolii, precum și gradul de deteriorare, pot fi specifice articulațiilor.

În concluzie, am observat o serie de modificări ale dietei în os din cauza obezității, în timp ce structura cartilajului și proprietățile mecanice au rămas relativ neschimbate. Studiile au arătat diferențe specifice articulațiilor ca răspuns la OA legată de obezitate, corelații fiind observate la genunchi și mâini, dar cu o corelație mică sau deloc pentru OA de șold și umăr. 21 În ciuda literaturii relativ rare pe OA a umărului, constatările noastre sunt în concordanță cu lipsa dovezilor clinice pentru obezitate ca factor de risc pentru OA de umăr, dar indică faptul că modificările osoase subiacente apar în acest model. Acest studiu pune bazele pentru o mai bună înțelegere a patogenezei OA a umărului, precum și legătura dintre obezitate și modificările țesuturilor musculo-scheletice ale umărului. Această lucrare oferă motive suplimentare pentru examinarea rolului obezității și a intervenției dietetice în sănătatea sistemului musculo-scheletic, inclusiv alte articulații, cum ar fi umărul, în plus față de genunchi și șold.

CONTRIBUȚIILE AUTORILOR

LV și FG au dezvoltat conceptul și au conceput experimente. LV a efectuat experimente. LV, AGS, NSH și CLW au analizat datele. LV a scris manuscrisul. Toți autorii au citit și au aprobat manuscrisul final trimis.

MULȚUMIRI

Autorii îi mulțumesc Sara Oswald pentru că a oferit suport tehnic de redactare a manuscrisului, iar Dr. Kelsey Collins pentru discuții și asistență cu evaluarea comună. Acest studiu a fost susținut parțial de granturile NIH AR073752, AR50245, AR48852, AG15768, AR48182, AG46927, AR073752, OD10707, AR060719, Centrul de Cercetare Musculoscheletală a Universității Washington (NIH P30 AR057235), Fundația pentru Artrită și Fundația Nancy Taylor pentru Ch Boli.