1 Spitalul de Instruire și Cercetare din Istanbul, Clinica de Oftalmologie, Fatih, 34098 Istanbul, Turcia

2 Departamentul de Fiziologie, Facultatea de Medicină, Universitatea Yeni Yüzyıl, Topkapi, Istanbul, Turcia

3 Universitatea din Istanbul, Departamentul de Neuroștiințe, Institutul de Medicină Experimentală, Istanbul, Turcia

4 Departamentul de chimie analitică, Facultatea de Farmacie, Universitatea Bezmialem Vakif, Fatih, 34093 Istanbul, Turcia

5 Facultatea de Inginerie și Științe Naturale, Universitatea Sabancı, Tuzla, Istanbul, Turcia

Abstract

Au fost investigate efectele ischemiei și reperfuziei asupra metaboliților lentilei și efectul unui produs comercial fitoterapeutic numit „Enoant” (conținut mixt de polifenoli) asupra metaboliților lentilei selectați. În acest scop, 30 de șobolani Wistar au fost împărțiți în trei grupe în funcție de dieta lor și au fost supuși ischemiei. 10 dintre șobolani ca grupa I au fost hrăniți cu dietă uscată; celelalte 10 (grupa II) au fost hrănite cu dietă uscată și apă potabilă cu Enoant. La sfârșitul perioadei de 15 zile, ambele grupuri de șobolani au fost supuse ischemiei timp de 2 ore și reperfuzate. După alte 15 zile cu aceeași dietă, șobolanii au fost decapitați. Restul de 10 șobolani, care nu au fost supuși ischemiei (grupa III), au fost hrăniți doar cu dietă uscată. Spectroscopia 1 RMN a fost utilizată pentru determinarea metaboliților lentilei fiecărui grup de șobolani. Rezultatele obținute din cele trei grupuri au fost comparate statistic. Diferențele de metaboliți au fost semnificative, cu excepția piruvatului și succinatului. Administrarea orală a Enoant a evidențiat efecte asupra creșterii stabilizării membranei, capacității antioxidante, capacității moleculei regulatoare osmotice și conținutului de sorbitol al cristalinului perturbat de ischemie. Enoant poate fi utilizat acolo unde se formează stres oxidativ sau osmotic.

1. Introducere

Ca necesitate a vieții, aparițiile oxidative din celule determină formarea speciilor reactive de oxigen (ROS) și sunt neutralizate în cristalin prin mijloace enzimatice sau neenzimatice [1-3]. Insuficiențele din sistemele antioxidante induc producerea mai multor proteine ​​inflamatorii care contribuie la procesul celulelor care favorizează deteriorarea lipidelor, ADN-ului, carbohidraților și proteinelor.

Metaboliții lentilei și corneei au fost studiați prin intermediul spectroscopiei prin rezonanță magnetică nucleară (RMN) încă din anii 1980. Datorită ușurinței aplicabilității lor, extractele de acid percloric au fost studiate până în ultimii ani pentru a defini metaboliții. În ultimii ani, 1 RMN a fost utilizat mai mult, în special în țesuturile tumorale, pentru a urmări efectul stimulărilor apoptotice [15-18]. Markerul cel mai frecvent studiat al deteriorării țesutului oxidativ este substanța reactivă tiobarbiturică (TBARS), iar markerul cel mai frecvent marcat în măsurarea capacității antioxidante este glutationul reductiv (GSH). Ne-am propus să cercetăm efectul asupra metaboliților lentilei cauzat de aplicarea ischemiei/reperfuziei (I/R) și efectul asupra metaboliților lentilei selectați cauzat de un produs comercial numit „Enoant”, cunoscut pentru a avea caracteristici antioxidante ridicate din cauza conținutul mixt de polifenoli și introdus ca aditiv dietetic și concentrat standardizat de extract de vin fără alcool.

2. Material și metode

2.1. Investigarea extractelor de vin concentrat

Enoant a fost furnizat cu amabilitate de Te-ha Cosmetic Company (Istanbul, Turcia). Conținutul de polifenoli din Enoant, extras din piele și semințe de struguri, a fost determinat prin cromatografie lichidă de înaltă presiune (HPLC) ca 1,47 mg/ml catehină, 0,88 mg/ml epicatechină, 130 mg/ml quercetină și 23 mg/ml resveratrol [ 19].

2.2. Investigarea lentilelor

Pregătirea animalelor a fost după cum urmează: toate studiile la animale sunt efectuate în conformitate cu directivele Comisiei Europene pentru mediu (86/609/CEE). Șobolani masculi albini Wistar (

) au cântărit 200-250 g în acest experiment. Animalele au fost găzduite 3-4 șobolani pe cuști de laborator și menținute pe un ciclu de 12 ore lumină-întuneric, cu acces ad libitum la condițiile standard de laborator timp de cel puțin 1 săptămână înainte de experiment. Zece dintre aceștia au fost numiți ca grupa I, care au fost hrăniți cu diete uscate. Ceilalți 10 șobolani (grupa II) pe lângă dieta lor au primit Enoant pe cale orală în apă proaspătă de băut (1,25 g/kg/zi) timp de 15 zile. La sfârșitul perioadei de 15 zile, carotidele bilaterale ale șobolanilor au fost legate timp de 2 ore și s-a format ischemie. Apoi, au fost refuzate la sfârșitul perioadei de 2 ore. Restul de 10 șobolani și-au continuat doar dieta uscată (Grupa III). Acești șobolani, care au ținut regimul timp de 15 zile, au fost sacrificați cu aplicarea tiopentalului peritoneal (100 mg/kg). Lentilele celor 3 șobolani din fiecare grup au fost înghețate pentru a prepara extract de acid percloric. TBARS a fost menținut la una dintre lentilele fiecăruia dintre cei 7 șobolani rămași, iar GSH reductiv a fost menținut la celelalte lentile. Spectrele 1 RMN ale celor 3 șobolani au fost preluate în extracte de acid percloric.

2.3. Pregătirea și analiza extractelor de acid percloric

Lentilele înghețate au fost pulverizate cu un mortar de porțelan și un pistil răcit cu azot lichid. Acid percloric (300 μL 10%) a fost adăugat la pulberea de țesut și pulberea a fost agitată continuu până la consistența pastei înghețate.

Proba congelată a fost imediat centrifugată la 3000 g timp de 10 minute la temperatura camerei. Supernatantul a fost neutralizat cu hidroxid de potasiu 0,1 M la valori de pH de 7,0-7,2. Proba a fost apoi centrifugată la 3000 g timp de 10 minute la temperatura camerei și supernatantul final a fost colectat [20].

Supernatanții preparați au fost uscați sub vid și au fost rezolvați în 0,3 ml oxid de deuteriu (D20). Spectrele 1 RMN au fost obținute cu un spectrometru Varian Unity Inova 500 (11,7 T) care funcționează la 500 MHz pentru protoni.

În plus, un număr mare de vârfuri suprapuse care aparțin glucozei, fructozei și sorbitolului în spațiul cuprins între 3,00 și 5,00 ppm. De aceea, tripletul din spațiul dintre 3,71 și 3,74 ppm pentru sorbitol a fost luat ca referință. În plus, în literatura de specialitate, sa raportat că tripletul 3.73 a crescut în lipsa sorbitol dehidrogenazei [31]. Integralele relative ale vârfurilor de referință ale metaboliților selectați în spațiul cuprins între 0,5 și 5,00 ppm au fost luate luând în considerare apa, deoarece apa a fost introdusă fix în preparatul 1 RMN din grupele I, II și III. Și rezultatele integrale relative medii dintre fiecare 3 grupuri au fost comparate statistic.

2.4. Măsurarea nivelurilor de lentile GSH

S-a adăugat o soluție de deproteinază (120 g NaCI, 6,68 g acid m-fosforic și 0,8 g EDTA) la omogenizat tisular 10% al cristalinului. Proteinele precipitate au fost îndepărtate prin centrifugare. La supernatant s-au adăugat fosfat disodic 0,6 M și acid 5,5'-ditio-bis-2-nitrobenzoic (DTNB), iar probele au fost măsurate la 412 nm în 5 minute. Rezultatele au fost exprimate ca μmoL/g țesut [32].

2.5. Măsurarea nivelurilor de lentile TBARS

10% omogenizat de lentile au fost preparate cu 0,15 M KCL. 50 μL 8,1% dodecil sulfat de sodiu, 50 μAcid acetic L (ajustat la pH 3,5) și 100 μReactivii acidului tiobarbituric (TBA) au fost adăugați la 50 μL se omogenizează. Amestecul de reacție a fost menținut într-o baie de apă clocotită timp de 45 de minute. După răcire la temperatura camerei, TBA a fost extrasă cu n-butanol/piridină (15: 1). Probele au fost măsurate la 535 nm. Rezultatele au fost calculate ca țesut nmoL/g [33].

2.6. Statistici

Integralele relative ale metaboliților lentilei selectați și nivelurile GSH și nivelurile de oxidare a lipidelor (TBARS) la șobolanii Wistar care au prezentat I/R (grupa I și II) și grupul de control (grupa III) au fost comparate statistic între grupurile I și II între Grupa II și III. Efectul I/R asupra metaboliților lentilei și efectul lui Enoant asupra modificărilor din Grupul I și Grupul II și Grupul II din Grupul III au fost comparate statistic și discutate în literatura de specialitate. Diferențele dintre mediile de densitate ale metaboliților au fost comparate de „Mann Whitney

"Test. Datele au fost exprimate ca medii

a fost acceptat ca fiind semnificativ statistic pentru toate rezultatele.

3. Rezultate si discutii

3.1. Rezultatele unei analize RMN a lentilelor extrase cu acid percloric

În literatura de specialitate, aproape 25 de metaboliți pot fi găsiți în aceste spectre, inclusiv valină, leucină/izoleucină, 3-OH butirat, treonină, lactat, alanină, acetat, lisină, N-acetilglucozamină, glutamat, glutation, piruvat/succinat, glutamină, citrat, glucoză, hipotaurină, aspartat, colină și derivații săi (fosfocolină, glicerofosfocolină), taurină, mioinozitol, sciloinozitol, glicină, sorbitol, sorbitol 3 fosfat și vârfuri de serină. Dar cele mai vizibile, vârfuri analizabile sunt în 0,5-5,00 ppm, care sunt derivați de sorbitol, sciloinozitol, mioinozitol, taurină, fosfocolină, piruvat/succinat, acetonă, acetat și tripletul la 2,8 ppm.

Spectrele de probă în spațiul cuprins între 0,5 și 5,00 ppm din grupele I, II și III au fost prezentate în Figura 1. Spațiile integrate au fost marcate după spectrele extinse pentru fiecare metabolit.

reperfuziei

1 Spectroscopie RMN a metaboliților lentilelor între 0,5 și 4,5 ppm.

Sorbitol (3,71-3,75 ppm), scilloinositol (3,38-3,36 ppm), mioinozitol (3,29-3,27 ppm), taurină (3,264-3,25 ppm), colină (3,22-3,20 ppm), piruvat/succinat (2,42-2,40 ppm), acetonă (2,32-2315 ppm), acetat (1,965-1,90 ppm) și un triplet la 2,8 ppm au fost observate clar. Tripletul la 2,8 ppm în grupa III nu a putut fi văzut. Vârful piruvat/succinat a avut aceeași densitate relativă integrală în toate grupurile.

Ratele medii de densitate integrală relativă a metaboliților clari, observabili și măsurabili în grupuri au fost prezentate în Figura 2.


Mediile metaboliților lentilei din grupurile de studiu.

Diferențele dintre mediile de densitate ale metaboliților din grupele I și II, cu excepția piruvatului/succinatului

și sciloinozitol și pentru taurină (

) și acetat (), au fost semnificativ semnificative statistic (). Diferențele dintre toți metaboliții grupurilor II și III au fost semnificativ semnificative statistic (), cu excepția piruvatului/succinatului .

3.2. Tarifele TBARS ale lentilelor

În timp ce rata TBARS din grupa III a fost

lentila nmoL/g în medie și în greutatea umedă a lentilei grupului II nmoL/g, sa determinat ca

nmoL/g greutate umedă a lentilei în grupa I. Diferența (între grupurile I și II și diferența dintre grupele II și III) a fost semnificativă statistic ().

3.3. Rată GSH redusă a obiectivelor

Ratele medii GSH ale lentilelor din grupa III au fost calculate ca

μgreutate umedă a lentilei moL/g,

μgreutate umedă lentilă moL/g în grupa II și μgreutate umedă moL/glens în grupa I. Diferența dintre grupa I și grupa II și grupa II și grupa III a fost semnificativă static ().

1 Analiza RMN face posibilă observarea multor metaboliți. Majoritatea metaboliților sunt cauzați în mare măsură de umorul apos, iar alții sunt sintetizați în lentile. Studiile care s-au concentrat pe interacțiunea metaboliților lentilelor, cauzate de mai multe substanțe chimice, se desfășoară. Efectele extractului de semințe de grapefruit (GSE) asupra îmbătrânirii și diabetului au fost investigate [34].

Singleturile din 3,21, 3,22 și 3,23 ppm s-au cunoscut că aparțin derivaților lor cu colină și fosfat [21, 25]. Sarcinile colinelor din lentile nu au fost încă clarificate cu exactitate; se știe că au sarcina de a transporta în membrana celulară.

S-a arătat că quercetina, un element al GSE, și-a furnizat efectul antioxidant nu numai prin prinderea radicalilor liberi, ci și prin protejarea celulei de radicalii liberi prin combinarea directă cu H2O2. S-a informat că quercetina inhibă accesul ionilor de Ca +2 și Na + cauzați de H2O2 în celulă; în plus, protecția împotriva cataractei H2O2 a fost asigurată și cu protecția proteinelor canalului membranar prin intermediul fenolilor din GSE [35].

Când H2O2 crește în celulă, scade nicotinamida adenină dinucleotidă (NAD), GSH, ATP și lactat [36, 37]. Când H2O2 crește, membranele celulei sunt deteriorate și citoscheletul său este distrus, iar poliADP riboză polimeraza activează și rupe NAD; în plus, conținutul ridicat de H2O2 provoacă daune cristalinelor prin formarea proteinelor cu solubilitate redusă datorită faptului că provoacă formarea de noi fluorofori [38]. S-a susținut că proantocianidinele existente în GSE inhibă dezvoltarea cataractei prin creșterea capacității antioxidante a lentilelor. În literatura de specialitate, s-a demonstrat că s-au format pierderea de glutation de oxid în cataractă, oxidarea lipidelor de membrană, oxidarea proteinelor tiolilor, formarea acidului cisteic, metionină sulfoxidă, disulfuri mixte și disulfuri de proteine ​​[39].

În acest studiu, faptul că glutationul reductiv a scăzut și rata TBARS a fost semnificativ ridicată la lentilele din grupul I, în comparație cu lentilele din grupele II și III, a dovedit că stresul oxidativ exista în grupul I și părea să promoveze creșterea H2O2 în celulă. GSH este prezent în concentrații relativ mari în cristalin și este implicat în protecția împotriva deteriorării oxidative, a aminoacizilor și a transportului cationic prin membrana celulară [40, 41]. Preluarea orală de Enoant, care este un extract de vin, după I/R a crescut capacitatea antioxidantă în grupa II. Faptul că nivelul MDA al Grupului II a fost mai mic decât cel al Grupului I arată că capacitatea antioxidantă a cristalinului a crescut și este compatibilă cu literatura de specialitate. Considerăm că Enoant în diete protejează lentilele de stresul oxidativ și este posibil să ofere un control mai bun al accesului lichid-electrolit cu furnizarea de stabilizare a membranei și o funcție mai bună de barieră. Dar consumul de Enoant în grupurile I/R nu ar putea fi suficient pentru ca ratele GSH și TBARS să atingă nivelurile normale ale lentilelor.

Se raportează că inozitolul are și un efect similar [46, 47]. Între ratele de scilloinozitol din grupele I și II, nu s-a observat o diferență semnificativă. Scilloinozitolul în lentilele din grupa III care nu au experimentat I/R este mai mare decât grupurile I și II în mod dramatic. Mioinozitolul în sine este la cea mai mare rată din grupa III; are rate mai mari în grupa II decât în ​​grupa I. S-a demonstrat că adăugarea de ARI a inhibat dezvoltarea cataractei diabetice la șobolanii hrăniți cu galactoză și în investigații; a crescut nivelul mioinozitolului din lentilă [48]. Sa arătat, de asemenea, că ARI-urile au scăzut ieșirea/eliberarea mioinozitolului în celulă. Pierderea mioinozitolului a scăzut, de asemenea, atunci când lentilele au fost introduse într-un mediu hipoton. Se susține că canalul anionic și/sau proteina de transport mediată de purtător ajută mioinozitolul să iasă din celulă [37]. S-a demonstrat că mioinozitolul a scăzut caracteristicile oxidante ale peroxizilor din celulă în funcție de doză [49]. S-a demonstrat că mioinozitolul s-a acumulat în epiteliul cristalin cu scopul adaptării la hipertonicitate [50]. Se susține că creșterea activității enzimei Na-K ATPaza facilitează acumularea osmoliților organici precum taurina și mioinozitolul în fața stresului hipertonic [51].

În acest studiu nu a devenit posibil pentru noi să arătăm dacă există hipertonicitate în cristalin, în funcție de existența polifenolilor care probabil au trecut spre cristalin sau camera anterioară. În acest studiu, nu este posibil să se spună dacă acest lucru are loc în funcție de efectul șocului osmotic format din creșterea atât a taurinei, cât și a mioinozitolului sau a efectului sorbitolului a cărui dezvoltare a fost inhibată în metabolismul glucozei sau a scăderii ieșirii/eliberării mioinozitolului. cu/prin efect ARI. Dieta cu Enoant în cazurile care au avut I/R pare să fie un agent asistent pentru protejarea conținutului de taurină și mioinozitol al cristalinului. Într-o serie de investigații, un număr de compuși flavonoizi izolați din plante au fost caracterizați ca inhibitori ai aldozei reductazei [52]. Pentru ca taurina și mioinozitolul să fie mai mari și pentru sorbitol în lentilele șobolanilor din grupa II legate de flavonoizii conținuți de Enoant să fie mai mici în mod dramatic s-au realizat.

Care este concluzia semnificativă în această investigație este că vârful piruvat/succinat în 2,41 ppm este similar în fiecare dintre cele trei grupuri. În cazul menținerii dietei normale, I/R sau aportul de Enoant nu au avut efect asupra nivelului de piruvat care este sintetizat ca un prim pas în glicoliză.

Diferențele dintre acetonă și acetat relativ între ratele integrale dintre grupuri sunt, de asemenea, importante din punct de vedere statistic, dar nu am putut explica importanța metabolică a acestor diferențe pentru lentile.

Lactatul pare un dublet la 1,32 ppm în 1 spectroscopie RMN. Deoarece această regiune este regiunea -CH2, a fost foarte zgomotoasă, iar lactatul nu a putut fi determinat în mod clar. Limita acestui studiu a fost că acidul lactic nu a putut fi determinat de densitățile integrale relevante din spectroscopia RMN.

Ca rezultat, s-a arătat că pentru Enoant, un produs comercial, care conține complexe polifenol și flavonoide, pentru a fi utilizat pe cale orală, a avut un efect asupra creșterii stabilizării membranei, a capacității antioxidante a cristalinului, a capacității moleculei de regulator osmotic și a conținutului de sorbitol după I/R. Enoant poate fi utilizat în cazuri naturale sau speciale, în care s-a format stres oxidativ sau osmotic, cu scopul de a inhiba complicații precum cataracta diabetică și neuropatia, ca remediu protector sau poate curativ în cazuri precum UV, care stimulează oxidantul sau mai multe apoptotice. răspunsuri, sau poate cu scopul de a ajuta tratamentul ca produs suplimentar, și în această direcție a fost convins că trebuie planificate studii susținute de inspecții histologice.

Mulțumiri

Autorii îi mulțumesc profesorului Dr. Dr. Atilla Güngör, Universitatea Marmara, Facultatea de Chimie, pentru orientare și profesorul Dr. Gülaçtı Topçu, Universitatea Bezmialem Vakif, Facultatea de Farmacie, pentru analiza 1 spectroscopii HNMR și 13 CNMR.

Referințe