Abstract

[Scop]

Scopul acestui studiu a fost de a compara eficacitatea fie a suplimentării cu resveratrol, fie a antrenamentelor de exercițiu asupra infiltrării macrofagelor și trecerea de la celulele kupffer M1 la M2 la șoarecii cu dietă bogată în grăsimi.

exercițiilor

[Metode]

Șoarecii C57BL/6 au fost separați în 5 grupuri: dietă normală (ND; n = 6), dietă bogată în grăsimi (HD; n = 6), dietă bogată în grăsimi cu resveratrol (HR; n = 6), dietă bogată în grăsimi cu exerciții fizice (HE; n = 6) sau dietă bogată în grăsimi cu resveratrol și exerciții fizice (HRE; n = 6). Șoarecii suplimentați cu resveratrol au fost gavați oral cu resveratrol (25 mg/kg greutate corporală) dizolvat în 50% propilen glicol. Șoarecii de exerciții au rulat pe o bandă de alergat la 12-20 m/min timp de 30-60 min/zi, de 5 ori/săptămână timp de 12 săptămâni.

[Rezultate]

După 12 săptămâni de intervenție, ficatul a fost analizat. Expresia F4/80 a fost evaluată prin western blot, în timp ce expresiile mRNA CD11c și CD163 au fost evaluate prin RT-PCR. Greutățile corpului și ale ficatului au fost semnificativ crescute în grupul HD și HR comparativ cu grupul ND (p Cuvinte cheie: obezi, exerciții fizice, resveratrol, infiltrare de macrofage, schimbare

INTRODUCERE

Ficatul are funcții majore în coordonarea metabolismului. Hepatocitele sunt implicate în metabolismul lipidelor și în eliberarea citokinelor inflamatorii [1]. În obezitate, citokinele inflamatorii eliberate din țesutul adipos se deplasează în afara ficatului prin vena portă și pot interfera direct cu funcțiile hepatice. În special, celulele Kupffer sunt surse importante de citokine inflamatorii în ficat și sunt macrofage care locuiesc în ficat. În timpul steatozei, recrutarea macrofagelor în ficat poate modifica distribuția celulară, modificând astfel morfologia și funcția celulei Kupffer [2]. Macrofagele au un fenotip extrem de plastic care le permite să se specializeze și să afișeze proprietăți funcționale polarizate, cum ar fi acțiuni inflamatorii sau antiinflamatorii ca răspuns la produsele citokinice [3].

Așa-numitele macrofage clasice activate sau „M1” secretă cantități mari de mediatori pro-inflamatori, în timp ce macrofagele „M2” activate alternativ sunt producători de citokine pro-inflamatorii scăzute. La obezitate, echilibrul dintre macrofagele M1 și M2 este perturbat. Markerul specific pentru macrofage M1, CD11c, este crescut în condiții de dietă bogată în grăsimi, în timp ce markerul specific pentru macrofage M2, CD163, este scăzut [4].

Rapoartele anterioare au arătat că expresia moleculelor de aderență în țesutul adipos a fost crescută în starea obeză [5,6] și un studiu diferit a indicat că șoarecii obezi induși de HFD au prezentat o expresie mai mare a moleculei de adeziune intercelulară 1 (ICAM-1) și a aderenței celulelor vasculare. molecula 1 (VCAM-1) în țesutul adipos. Pe de altă parte, șoarecii obezi nu au prezentat infiltrarea macrofagelor în țesutul adipos după tratamentul cu antagonist ICAM-1 [7]. Astfel, moleculele de adeziune afectează infiltrarea macrofagelor indusă de obezitate în țesutul adipos.

Exercițiile fizice regulate pot preveni inflamația cronică [8,9] și pot reduce starea fibrozei ca marker al leziunii hepatice [10,11]. Un studiu anterior a arătat că antrenamentul la exerciții fizice reduce citokinele inflamatorii din țesutul adipos prin suprimarea mai multor gene de diferențiere a adipocitelor [12]. Recunoașterea moleculelor celulare de către receptori de tip toll, cum ar fi receptorul Toll-like 4 (TLR4), induce producerea de citokine inflamatorii [13]. O revizuire [14] pe această temă a demonstrat că expresia TLR4 în grupurile de exerciții este mai mică decât în ​​grupurile de control. O posibilă explicație este că antrenamentul la exercițiu suprimă citokinele inflamatorii la șoarecii obezi, care ar putea fi controlate de scăderea TLR4.

S-a demonstrat că resveratrolul are proprietăți antiinflamatorii și antioxidante [15,16]. Resveratrolul atenuează, de asemenea, metabolismul lipidelor hepatice [17]. Un studiu recent a demonstrat că resveratrolul exercită efecte inhibitoare asupra diferențierii adipocitelor, care însoțește reglarea descendentă a mai multor gene specifice adipocitelor [18].

Deși s-a sugerat că resveratrolul sau exercițiile fizice reduc reducerea acumulării de grăsime hepatică, efectul benefic asupra infiltrării macrofagelor este neclar. În plus, nu se cunoaște efectul protector al polarizării induse de grăsimi de la M2 la M1.

Prin urmare, scopul acestui studiu a fost de a compara eficiența fie a suplimentării cu resveratrol, fie a antrenamentului de exerciții aerobe cu privire la infiltrarea macrofagelor, trecerea de la M1 la M2 și genele induse de inflamație la șoarecii cu dietă bogată în grăsimi.

METODE

Animale și dietă

Șoarecii masculi C57BL/6 (Central Experiment Animal, Korea, n = 30) de 4 săptămâni au fost adăpostiți în cuști (5 șoareci pe cușcă) într-un laborator experimental standard, la o temperatură de 22 ± 2 ℃, cu 60 ± 5 % umiditate. După o perioadă de aclimatizare de o săptămână, șoarecii au fost hrăniți fie cu o dietă bogată în grăsimi (45% din energie din grăsimi, Orient Bio Inc., # D12451), fie cu o dietă normală (10% din energie din grăsimi, Orient Bio Inc., # D12451) ad libitum timp de 12 săptămâni.

Șoarecii au fost împărțiți în 5 grupe: dietă normală (ND; n = 5), dietă bogată în grăsimi (HD; n = 5), dietă bogată în grăsimi cu resveratrol (HR; n = 5), dietă bogată în grăsimi cu exerciții fizice (HE; n = 5), dietă bogată în grăsimi cu resveratrol plus exercițiu (HRE; n = 6). Grupurile de exerciții au efectuat banda rulantă timp de 23-60 min/zi la 10-22 m/min, de 5 ori/săptămână timp de 12 săptămâni. Consumul de alimente și greutatea corporală au fost monitorizate zilnic și, respectiv, o dată pe săptămână, utilizând o scală de masă standard. La sfârșitul perioadei experimentale, țesuturile hepatice au fost disecate, cântărite și înghețate imediat.

Protocoalele au fost aprobate de Comitetul de experimentare a animalelor de la Universitatea Națională Chungnam (CNU-00202), Coreea.

Protocol de exerciții și supliment de resveratrol

În faza incipientă a exercițiului moderat, toți șoarecii din grupul de exerciții au rulat la o viteză de 8-10 m/min timp de 10 minute pe o bandă de alergare cu rozătoare acționată automat. Ulterior, viteza și timpul de antrenament au fost crescute treptat până la 10-22 m/min timp de 30-60 de minute.

Volumul protocolului de antrenament la exerciții reprezintă 60-75% din consumul maxim de oxigen al rozătoarelor pentru un program de exerciții de intensitate moderată [19]. Un burete de spumă a fost plasat în spatele fiecărei benzi de alergat pentru a preveni rănirea animalului. Șocul electric nu a fost utilizat în timpul rulării benzii de rulare. În timp ce șoarecii din grupul de exerciții s-au antrenat, șoarecii de control au fost expuși la stresul mediului, precum și la vibrații și zgomot de la banda de alergare, iar alimentarea și alimentarea cu apă a acestora au fost eliminate. Șoarecii suplimentați cu resveratrol au fost gavați oral cu resveratrol (25 mg/kg greutate corporală) dizolvat în 50% propilen glicol [20]. Celălalt grup a primit doar vehiculul. Fiecare tratament a fost administrat o dată pe zi, de 5 ori pe săptămână timp de 12 săptămâni înainte de colectarea țesuturilor.

Western blot

Patruzeci de micrograme de proteine ​​au fost separate pe 7,5-10% SDS/PAGE și transferate pe membrane de nitroceluloză. După blocare timp de 1 oră în soluție de lapte degresat 5%, membranele au fost incubate cu anticorpi specifici față de F4/80 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, SUA) și β-actină (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, STATELE UNITE ALE AMERICII). Membranele au fost apoi expuse la un anticorp secundar anti-iepure conjugat cu peroxidaza de hrean (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, SUA) timp de 1 oră la temperatura camerei. Semnalele au fost detectate prin chemiluminiscență utilizând reactivul de detectare ECL (GE Healthcare, Piscataway, NJ, SUA). Benzile au fost scanate cu un sistem ChemiDoc XRS (Bio-Rad Laboratories) cu o cameră de 12 biți răcită și cuantificate prin densitometrie. Nivelurile de proteine ​​țintă au fost normalizate la valorile β-actinei.

Extracția ARN și RT-PCR

ARN-ul total a fost izolat din 20 mg de țesut hepatic folosind Trizol (Qiagen, Hilden, Germania), conform instrucțiunilor producătorului. ARN a fost cuantificat prin spectroscopie (NanoDrop, Wilmington, DE). Din fiecare probă, 1 μg de ARN total a fost transcris invers în ADNc cu primeri aleatori și oligo (dt) folosind un kit ARN-ADNc de mare capacitate (Roche, Mannheim, Germania) într-un volum total de 20 μL, ca descris în protocolul kitului de ARN-la-ADNc de mare capacitate. Amplificarea a fost efectuată într-un volum total de 20 μL, care a inclus 2 μL de ADNc, 1 μL din fiecare primer (10 pmol/μL) și 16 μL de apă DEPC (dietil pirocarbonat). Reacțiile au fost efectuate într-un sistem ABI 7500 utilizând următorii parametri de ciclare termică: 95 ℃ timp de 2 minute, apoi 38-40 de cicluri de 95 ℃ timp de 30 sec, temperatura de recoacere adecvată pentru 30 sec, și 72 ℃ timp de 2 minute. Toate probele au fost examinate în paralel pentru β-actină. Toate secvențele de exemplu au fost proiectate utilizând IDT (Skokie, IL), verificate folosind funcția BLAST a Centrului Național pentru Informații despre Biotehnologie (NCBI) și achiziționate de la MWG Biotech (Huntsville, AL).