Institutul de Biochimie a Macromoleculelor, Facultatea de Medicină și Chirurgie, Universitatea a II-a din Napoli, Via Costantinopoli 16, 80138 Napoli, Italia

Institutul de Biochimie a Macromoleculelor, Facultatea de Medicină și Chirurgie, Universitatea a II-a din Napoli, Via Costantinopoli 16, 80138 Napoli, Italia

Institutul de Biochimie a Macromoleculelor, Facultatea de Medicină și Chirurgie, Universitatea a II-a din Napoli, Via Costantinopoli 16, 80138 Napoli, Italia

Departamentul de Inginerie Electrică, Universitatea din Napoli „Federico II”, Via Claudio, 80125 Napoli, Italia

Departamentul de Inginerie Electrică, Universitatea din Napoli „Federico II”, Via Claudio, 80125 Napoli, Italia

Institutul de Biochimie a Macromoleculelor, Facultatea de Medicină și Chirurgie, Universitatea a II-a din Napoli, Via Costantinopoli 16, 80138 Napoli, Italia

Institutul de Biochimie a Macromoleculelor, Facultatea de Medicină și Chirurgie, Universitatea a II-a din Napoli, Via Costantinopoli 16, 80138 Napoli, Italia

Institutul de Biochimie a Macromoleculelor, Facultatea de Medicină și Chirurgie, Universitatea a II-a din Napoli, Via Costantinopoli 16, 80138 Napoli, Italia

Institutul de Științe Alimentare, Consiliul Național pentru Recreere, Via Roma 52 A/C, 83100 Avellino, Italia

Institutul de Biochimie a Macromoleculelor, Facultatea de Medicină și Chirurgie, Universitatea a II-a din Napoli, Via Costantinopoli 16, 80138 Napoli, Italia

Institutul de Biochimie a Macromoleculelor, Facultatea de Medicină și Chirurgie, Universitatea a II-a din Napoli, Via Costantinopoli 16, 80138 Napoli, Italia

Institutul de Biochimie a Macromoleculelor, Facultatea de Medicină și Chirurgie, Universitatea a II-a din Napoli, Via Costantinopoli 16, 80138 Napoli, Italia

Departamentul de Inginerie Electrică, Universitatea din Napoli „Federico II”, Via Claudio, 80125 Napoli, Italia

Departamentul de Inginerie Electrică, Universitatea din Napoli „Federico II”, Via Claudio, 80125 Napoli, Italia

Institutul de Biochimie a Macromoleculelor, Facultatea de Medicină și Chirurgie, Universitatea a II-a din Napoli, Via Costantinopoli 16, 80138 Napoli, Italia

Institutul de Biochimie a Macromoleculelor, Facultatea de Medicină și Chirurgie, Universitatea a II-a din Napoli, Via Costantinopoli 16, 80138 Napoli, Italia

Institutul de Biochimie a Macromoleculelor, Facultatea de Medicină și Chirurgie, Universitatea a II-a din Napoli, Via Costantinopoli 16, 80138 Napoli, Italia

Institutul de Științe Alimentare, Consiliul Național pentru Recreere, Via Roma 52 A/C, 83100 Avellino, Italia

Abstract

Două enzime termofile și termostabile, izolate din Sulfolobus solfataricus, S‐Adenosilhomocisteina hidrolaza și 5 ′ - metiltioadenozin fosforilaza au fost expuse la radiații cu microunde de 10,4 GHz pentru a discrimina efectele termice și non-termice ale microundelor. Expunerea provoacă o inactivare non-termică, ireversibilă și dependentă de timp a ambelor enzime; rata de inactivare este legată de energia absorbită și este independentă de concentrația enzimei. A fost investigată și influența sărurilor asupra inactivării enzimei. Modificări conformaționale ale S‐Adenosilhomocisteina hidrolaza, detectată prin fluorescență și tehnici de dicroism circular, sugerează că microundele induc rearanjamente structurale ale proteinelor care nu au legătură cu temperatura.

1. Introducere

În ultimele decenii, utilizarea radiațiilor cu microunde a crescut mult în sistemele radar și de comunicații, precum și în tehnologia de prelucrare a alimentelor și în alte aplicații industriale. Dezvoltarea dispozitivelor cu microunde pentru consumatori și medicale pentru diagnostic și terapie clinică a suscitat, de asemenea, un interes larg și a stimulat multe cercetări privind mecanismele de interacțiune a radiațiilor cu microunde cu organismele vii [1-5]. Conform literaturii, două tipuri de efecte pot fi atribuite microundelor, adică termice și netermice [1, 2, 4, 5]. Efectele termice sunt legate de căldura generată de absorbția energiei cu microunde de către mediul de apă sau de sistemele organice complexe, ambele caracterizate printr-o polarizare permanentă sau indusă. În prezent, se știe foarte puțin despre mecanismele moleculare implicate în efectele supuse non-termice care ar putea implica transferul direct de energie din câmpul electromagnetic către modurile vibraționale ale macromoleculelor [6] modificându-le conformația.

În ultimii ani au fost raportate multe efecte non-termice după expunerea biosistemelor la microunde; printre acestea s-au descris modificări ale activității canalelor K + dependente de Ca 2+ [7], modificări ale structurii și funcției membranei [8, 9], modificări ale permeabilității lipozomilor [10, 11] și ale celulelor izolate [12]. Pe de altă parte, unii autori au pus sub semnul întrebării existența efectelor non-termice ale microundelor [4, 13, 14] .

În special, rezultatele obținute pe sistemele enzimatice sunt până acum controversate, probabil din cauza dificultăților experimentale în controlul și monitorizarea corespunzătoare a temperaturii. Nu s-a observat niciun efect non-termic măsurabil asupra activității catalitice la un număr de enzime izolate iradiate in vitro [15-18]. Dimpotrivă, alte sisteme enzimatice, cum ar fi protein kinazele limfocitelor [19], ornitina decarboxilază a celulelor hepatom [20] și fosfataza acidă [21] răspund la câmpuri cu microunde cu intensitate mică și mare și cu amplitudine modulată. Mai mult, a fost raportată o inhibare semnificativă a Na +/K + ATPazei celulelor roșii, probabil legată de modificările conformaționale ale proteinei [22]. .

În lucrarea de față este descrisă o nouă abordare experimentală care vizează discriminarea efectelor termice și non-termice folosind enzime termofile purificate ca sistem model. Termofilitatea și termostabilitatea acestor molecule permit expunerea la microunde de intensitate ridicată cu interferențe minore de temperatură asupra stabilității enzimei, permițând astfel utilizarea unor controale adecvate la temperaturi ridicate.

Această lucrare raportează efectele expunerii la microunde de 10,4 GHz asupra stabilității a două enzime termofile implicate în poliamină și S‐Metabolismul adenosilmetioninei [23], adică. S‐Adenosilhomocisteină (AdoHcy) hidrolază și 5 ′ - metiltioadenozină (MTA) fosforilază, purificată din Sulfolobus solfataricus [24, 25], un microorganism termofil aparținând Archaea [26]. Mai mult, sunt raportate date despre influența microundelor asupra conformației hidrolazei AdoHcy.

2. Materiale și metode

2.1 Expunerea la microunde

2.2 Analize enzimatice și determinarea proteinelor

Activitatea hidrolazei AdoHcy a fost testată în urma sintezei de [8-14 C] AdoHcy din [8-14 C] adenozină în prezența homocisteinei. Testul a fost efectuat așa cum este descris de Porcelli și colab. [24]. Activitatea fosforilazei MTA a fost determinată prin măsurarea formării de [metil‐ 14 C] 5 - metiltioriboză - 1 - fosfat din [metil‐ 14 C] MTA. A fost descrisă procedura de testare [25] .

Concentrația de proteine ​​a fost estimată în conformitate cu Bradford [28] folosind γ-globulina umană ca standard.

2.3 Iradierea cu microunde

Dacă nu se specifică altfel, 300 μl soluție (0,3 mg/ml) de hidrolază AdoHcy sau fosforilază MTA în tampon Tris - HCI 10 mM, pH 7,4, a fost expusă la radiații cu microunde de 10,4 GHz la diferite temperaturi în intervalul 70-90 ° C. În aceste condiții, SAR a variat între 1,5-3,1 W/g. La intervale de timp diferite, 50 μl probe de enzime au fost extrase din celula de expunere și testate. Activitatea enzimatică reziduală a fost apoi calculată ca procent dintr-un martor incubat la aceeași temperatură într-o baie de apă.

2.4 Măsurători spectrale

Măsurătorile de fluorescență au fost efectuate pe un spectrofluorometru Perkin-Elmer MPF-66B în domeniul liniarității fluorescenței. Absorbanța tuturor soluțiilor a fost de 0,02-0,15 la lungimea de undă de excitație.

Măsurătorile de dicroism circular (CD) au fost efectuate pe un spectropolarimetru Jobin Yvon Mark III. Absorbanța probelor de proteine ​​utilizate pentru măsurătorile CD a fost de aproximativ 0,125 la 280 nm. Spectrele CD au fost analizate în regiunea 200-250 - nm.

3. Rezultate si discutii

3.1 Efectele radiației cu microunde asupra stabilității enzimei

Hidrolaza AdoHcy și fosforilaza MTA din S. solfataricus au fost purificate [24, 25], caracterizate pe scară largă [24, 25] și clonate [29, 30] în laboratorul nostru. Ambele enzime sunt dotate cu termofilicitate și termostabilitate ridicate, precum și cu o rezistență remarcabilă la solvenți organici, denaturanți ai proteinelor și detergenți, chiar și la temperaturi ridicate [24, 25]. .

Hidrolaza AdoHcy și fosforilaza MTA au fost expuse la radiații cu microunde de 10,4 GHz de intensitate ridicată (SAR, 1,5-3,1 W/g) într-un interval de temperatură de la 70 ° C la 90 ° C. După cum sa raportat în Fig. 1 a, b, iradierea determină o pierdere a activității enzimatice în ambele enzime în funcție de timpul de expunere la temperaturile experimentale utilizate. Gradul de inactivare este diferit pentru cele două enzime. În intervalul de temperatură studiat, hidrolaza AdoHcy apare mai sensibilă decât fosforilaza MTA mai termostabilă. De fapt, la 90 ° C AdoHcy hidrolaza păstrează doar 18% activitate după 40 de minute de iradiere comparativ cu un martor incubat la aceeași temperatură fără iradiere. În aceleași condiții, MTA fosforilaza păstrează încă 78% activitate după 40 de minute și atinge o inactivare mai mare (58%) numai după 90 de minute.

microundelor

Inactivarea enzimatică observată trebuie atribuită unui efect de microunde non-termic, deoarece AdoHcy hidrolaza apare pe deplin activă după 90 de minute de incubație la 70 ° C și după 30 de minute la 90 ° C [24], iar fosforilaza MTA este complet stabilă până la 2 h incubație la 100 ° C [25] .

Deoarece învelișul de apă care înconjoară ghidul de undă al suportului probei a fost menținut la o temperatură constantă, atingerea temperaturilor experimentale a fost determinată de diferitele niveluri de energie absorbite de probe. Așa cum se arată în FIG. 1a, b, activitatea enzimei scade odată cu creșterea puterii cuptorului cu microunde absorbită pe unitate de masă (SAR). O comparație suplimentară a celor două figuri arată că efectul exercitat de microunde depinde de structura proteinei specifice; de fapt, la 90 ° C, când puterea absorbită (SAR) de cele două enzime este similară, scăderea valorilor activității este destul de diferită.

Efectul câmpului electromagnetic nu depinde de concentrația enzimatică a probei, deoarece experimentele efectuate la diferite concentrații de proteine, variind de la 0,01 la 0,3 mg/ml, nu au evidențiat nicio modificare a cineticii de inactivare (datele nu sunt prezentate).

Influența sărurilor asupra inactivării enzimei a fost studiată prin supunerea hidrolazei AdoHcy și fosforilazei MTA la iradiere cu microunde la 10,4 GHz la 90 ° C (SAR, 3 W/g) în prezența KCl 250 mM sau KH2PO4 250 mM.

Cele două enzime termofile prezintă un comportament diferit; adăugarea de KCl sau KH2PO4 la soluția enzimatică expusă la microunde nu provoacă niciun efect suplimentar asupra inactivării AdoHcy hidrolazei (datele nu sunt prezentate). Pe de altă parte, KH2PO4 exercită o protecție moderată împotriva inactivării cu microunde a fosforilazei MTA, în timp ce KCl îmbunătățește procesul de inactivare (Fig. 2). Mai mult, un experiment similar efectuat cu NaCl 250 mM și Na2SO4 250 mM indică faptul că, după 1 oră de iradiere a fosforilazei MTA la 90 ° C (datele nu sunt prezentate), Na2SO4 exercită o protecție moderată (76% activitate reziduală) în timp ce NaCl determină o creștere a inactivarea enzimei (34% activitate reziduală).

Mecanismul prin care KCl sau NaCl crește susceptibilitatea fosforilazei MTA la iradierea cu microunde este în prezent dificil de interpretat și merită o investigație suplimentară. În schimb, protecția împotriva inactivării cu microunde exercitată de fosfat sau sulfatul său analog ar putea fi atribuită rolului lor de substrat al fosforilazei MTA. Se știe că legarea substraturilor are ca rezultat protecția enzimelor împotriva inactivării cauzate de agenți fizici sau chimici precum temperatura sau enzimele proteolitice [31]. Prin urmare, pentru a evalua posibilul efect protector al fosfatului asupra termostabilității fosforilazei MTA, am efectuat cinetica pe termen scurt a denaturării termice a enzimei în prezența și în absența KH2PO4 250 mM. Așa cum se arată în inserția din Fig. 2, din diagrama activității reziduale după 10 minute de preincubare în funcție de temperatură este posibil să se calculeze o temperatură de tranziție (Tm aparentă) de 132 ° C. Această valoare crește la 135 ° C atunci când enzima este preincubată cu 250 mM KH2PO4, indicând astfel o protecție semnificativă de către fosfat.

Pe baza rezultatelor raportate, este posibil să se facă ipoteza că legarea substratului crește stabilitatea conformațională a enzimei, modificându-și astfel susceptibilitatea la radiații cu microunde.

3.2 Efectele microundelor asupra structurii hidrolazei AdoHcy

Inactivarea observată a hidrolazei AdoHcy și a fosforilazei MTA prin expunerea la microunde sugerează că structura ambelor enzime a fost afectată direct de câmpul electromagnetic.

Comparația spectrelor de emisie de fluorescență după excitația proteinei la 340 nm, raportată în Fig. 3b, arată o creștere netă a intensității fluorescenței hidrolazei iradiate AdoHcy, indicând astfel o posibilă modificare structurală a proteinelor chiar și a regiunii de legare a NADH.

FIG. 4 prezintă spectrul CD al hidrolazei AdoHcy după iradierea cu microunde, în comparație cu cel al controlului enzimei. Ambele spectre sunt caracterizate de un minim centrat la aproximativ 221 nm și de un umăr la 208-209 nm. Aceste caracteristici spectrale sunt indicative pentru prezența atât a structurilor α - helix, cât și a celei β [32]. După cum se poate observa, cea mai importantă diferență dintre cele două spectre este o scădere a activității dicroice a hidrolazei iradiate AdoHcy, susținând astfel opinia că microundele determină o rearanjare proteică structurală cu o creștere a structurii neorganizate.

În concluzie, expunerea la radiații cu microunde determină o inactivare ireversibilă, dependentă de timp și temperatură a ambelor enzime. Deoarece aceste enzime sunt destul de stabile la temperaturile investigate, rezultatele pot fi atribuite efectelor non-termice ale microundelor.

O atenție tot mai mare a fost acordată în ultimii ani efectelor potențiale ale radiațiilor cu microunde asupra sănătății. Standardele de siguranță au fost stabilite numai în funcție de efectele termice ale microundelor [33]. Apariția efectelor non-termice sugerează că criteriile utilizate până acum pot fi luate cu prudență atâta timp cât efectele non-termice ale microundelor asupra biomoleculelor sunt mai bine înțelese.

Mulțumiri

Mulțumim sincer Prof. L. Servillo pentru sugestii utile și pentru revizuirea critică a manuscrisului.