Abstract

Mecanismele pentru reglarea mecanică a expresiei colagenului par legate de anumiți factori de creștere receptivi la stres, inclusiv factorul de creștere transformant-β1 (TGF-β1) și factorul de creștere a țesutului conjunctiv (CTGF), care sunt exprimate ca răspuns la stimuli mecanici și, la rândul lor, conduc la inducerea expresiei colagenului în multe tipuri de celule (16, 25, 32, 44, 50). De asemenea, factorul de creștere tip insulină I (IGF-I) este cunoscut pentru a induce sinteza colagenului în celulele tendinoase (1, 37), iar dovezile recente susțin un rol pentru IGF-I și TGF-β1 ca mediatori ai expresiei induse de încărcare a ARNm de colagen în tendonul șobolanului in vivo (23). Pe baza acestui fapt, se poate specula că o scădere a sarcinii mecanice ar putea influența expresia acestor factori de creștere în țesutul tendinos.

La nivelul mușchilor scheletici, numeroase studii confirmă efecte nocive substanțiale ale descărcării atât la nivel biomecanic, cât și la nivel biochimic (51). În legătură cu modificările exprimării genelor, aceste studii s-au concentrat în principal pe expresia factorilor legați de funcțiile contractile și metabolice, dar există indicii că expresia genelor legate de matrice este, de asemenea, afectată de scăderea nivelurilor de încărcare mecanică (3, 20, 24, 47). Cu toate acestea, reglarea coordonată a ECM musculară și expresia genei țesutului tendinos a fost studiată doar ca răspuns la denervarea pe termen lung (6). Astfel, răspunsul timpuriu la dezutilizare nu a fost studiat simultan în aceste țesuturi. Mai mult, efectul unei perioade ulterioare de reîncărcare asupra expresiei factorilor de creștere și a genelor legate de matrice nu a fost niciodată studiat la nivelul tendonului și, de asemenea, pentru datele musculare sunt rare pe acest subiect.

În studiul de față am folosit modelul de suspensie a membrelor posterioare pentru a investiga efectul unei pierderi a încărcării active a țesutului muscular și tendinos, fără o pierdere concomitentă de stres cardiovascular. O paralelă clinică cu aceasta ar putea fi o situație de leziune, care nu are legătură cu mușchiul și țesutul tendinos, cum ar fi o entorsă a gleznei, în care se evită purtarea greutății piciorului rănit. Suspensia membrelor posterioare a fost urmată de o perioadă de purtare normală a greutății, corespunzătoare unei perioade de reabilitare.

Pe baza studiilor anterioare care indică un efect negativ al descărcării asupra expresiei colagenului de tip I și III în mușchiul scheletic (3, 20, 24, 47), am emis ipoteza că descărcarea membrelor posterioare ar duce la o scădere a expresiei colagenelor fibrilare în mușchi și, eventual, în tendon, urmată de o creștere a expresiei în timpul reîncărcării.

În același model, am studiat efectul asupra expresiei factorilor de creștere legați de reglarea expresiei colagenului, inclusiv variantele de îmbinare TGF-β1, IGF-I [IGF-IEa și factorul de creștere mecanică (MGF)] și CTGF. Având în vedere corelația pozitivă dintre încărcarea mecanică, expresia factorului de creștere și expresia colagenului, s-ar putea specula că descărcarea ar duce la o scădere a acestor factori de creștere receptivi la stres, împreună cu o scădere a expresiei colagenului atât în ​​tendon cât și în mușchi. Cu toate acestea, studiile asupra țesutului osos și al mușchilor scheletici indică faptul că este posibil să nu existe o corelație negativă între descărcarea țesutului și expresia locală a factorilor anabolizanți (2, 7, 18, 19, 24, 41). Astfel, pe baza constatărilor anterioare, nu ne-am așteptat să vedem o scădere a expresiei factorilor de creștere a mușchilor ca răspuns la suspensia membrelor posterioare, în timp ce răspunsul tendonului a fost dificil de prezis. Ca și în cazul expresiei colagenilor, ne așteptam ca perioada de reîncărcare să ducă la niveluri crescute de exprimare a factorului de creștere.

În cele din urmă, am investigat expresia miostatinei, un important regulator negativ al creșterii musculare. Studiile anterioare au arătat o reglare ascendentă a acestui factor în mușchi ca răspuns la suspensia membrelor posterioare (17), în timp ce încărcarea rezistenței pare să reducă expresia miostatinei (29). Astfel, ne-am așteptat să vedem o creștere inițială a expresiei miostatinei musculare în timpul suspendării membrelor posterioare, urmată de o reglare descendentă în timpul reîncărcării. În tendon am observat anterior niveluri relativ scăzute ale transcrierii miostatinei și niciun răspuns la încărcarea crescută. Cu toate acestea, efectul descărcării nu a fost investigat anterior în acest țesut și nu poate fi exclus faptul că acest lucru poate afecta expresia miostatinei.

Suspensia membrelor posterioare și pregătirea țesuturilor.

Suspensia membrelor posterioare (HS) a fost indusă la șobolani Sprague-Dawley femele cu o greutate de 265 ± 2,5 g (înseamnă ± SE) printr-o tehnică neinvazivă de turnare a cozii, așa cum este descris anterior (46). Pe scurt, un sistem de cablaj pivotant, combinat cu o piesă turnată, a fost atașat la un cârlig din partea superioară a cuștii. Acest lucru a împiedicat șobolanii să atingă pământul cu membrele posterioare, dar le-a permis animalelor să se miște în cușcă folosind membrele lor anterioare. Suspendarea a continuat timp de 14 zile, după care au fost îndepărtate turnările și au urmat 16 zile de reîncărcare (RL). Șobolanii au urmat un ciclu de lumină-întuneric de 12: 12 ore și au avut acces ad libitum la chow și apă standard de șobolan. Studiul a fost realizat în conformitate cu Societatea Fiziologică Americană „Principiile directoare în îngrijirea și utilizarea animalelor”, iar protocolul a fost aprobat de către Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea din California, Irvine.

Mușchiul soleului, inclusiv tendonul lui Ahile, a fost îndepărtat bilateral după o perioadă de suspendare de 7 zile (ziua 7 HS) sau 14 zile (ziua 14 HS), sau după 2 (ziua 2 RL), 4 (ziua 4 RL), 8 (ziua 8 RL) sau 16 (ziua 16 RL) zile de reîncărcaren = 8 în fiecare grup). Comenzi potrivite vârstei pentru ziua 0 (ziua 0 con), ziua 14 HS (ziua 14 con), și ziua 16 reincarca (ziua 16 RL con) au fost inclusen = 8 pentru fiecare grup). Țesutul a fost înghețat rapid și depozitat la -80 ° C până la utilizare ulterioară.

Extracția ARN-ului.

ARN-ul a fost extras din țesuturile provenite din abdomenul mușchiului soleului și din tendonul lui Ahile cu utilizarea reactivului TRI (MRC), conform metodei descrise de Chomczynski și Sacchi (10). După izolarea fazei apoase, ARN a fost precipitat folosind izopropanol. Peleta de ARN a fost apoi spălată în etanol și ulterior dizolvată în apă fără RNază. Toate probele au fost cântărite înainte de extracția ARN. Concentrațiile de ARN au fost determinate prin spectroscopie la 260 nm. O bună calitate a ARN-ului a fost asigurată prin electroforeză pe gel.

RT PCR în timp real.

asupra

FIG. 1.Randament ARN (μg/mg) din tendonul lui AhileA) și mușchiul solei (B) după suspensia membrelor posterioare (HS) și reîncărcare (RL) (bare deschise) în comparație cu șobolanii martor (bare gri). Șobolanii femele Sprague-Dawley au fost supuși HS timp de 7 sau 14 zile (D 7 HS sau D 14 HS), urmat de 2, 4, 8 sau 16 zile de RL (D 2 RL, D 4 RL, D 8 RL, sau D 16 RL). Ziua 0, ziua 0 Control. Valorile sunt medii ± SE. *P

tabelul 1. Primeri PCR

COL1A1 și COL3A1, colagen I și respectiv colagen III; TGF-β1, factor de creștere transformant -β1; CTGF, factor de creștere a țesutului conjunctiv; IGF-IEa, factor de creștere asemănător insulinei I-Ea; MGF, factor de creștere mecanică; RPLP0, proteină ribozomală mare P0.

Numărul de probe din fiecare grup.

Opt șobolani au fost incluși în fiecare grup. Pentru tendon, s-au realizat analize satisfăcătoare de ARNm pentru toți șobolanii, cu excepția ziua 14 Grupul HS și ziua 16 Grupul RL con, în care tendoanele a șapte șobolani au fost analizate cu succes. În mod similar pentru mușchi, datele pentru ziua 14 Grupul HS și ziua 16 Grupul RL con se bazează pe șase și respectiv șapte șobolani, în timp ce toate celelalte grupuri includ date de opt șobolani.

Statistici.

Toate datele ARNm au fost transformate în log înainte de analize statistice și sunt prezentate ca mijloace geometrice ± SE transformate înapoi. Datele rămase sunt prezentate ca mijloace aritmetice ± SE. Efectele tratamentului au fost analizate prin ANOVA unidirecțională și atunci când a fost efectuat un test post-hoc Bonferroni cu următoarele comparații relevante: 1) comparații între grupurile de control (ziua 0 con, ziua 14 con, și ziua 16 RL con); 2) comparații între fiecare grup de intervenție (HS și RL) și cel mai relevant grup de control (ziua 7 HS vs. ziua 0 con; ziua 14 HS, ziua 2 RL, ziua 4 RL și ziua 8 RL vs. ziua 14 con; ziua 16 RL vs. ziua 16 RL con); și 3) comparații între punctele de timp adiacente (de ex., ziua 14 HS comparativ cu ziua 7 HS și cu ziua 2 RL). Un test neparametric Kruskal-Wallis a fost aplicat pentru datele de ARNm de miostatină tendinoasă, deoarece aceste date nu au fost distribuite în mod normal. Toate testele statistice au fost efectuate utilizând pachetul software Prism 4.01 (GraphPad San Diego, CA, SUA). Diferențele au fost considerate semnificative atunci când P

masa 2. Masa umedă a mușchiului solei, a tendonului lui Ahile și a întregului corp

Valorile sunt mijloace ± SE; n = 8 pentru toate grupurile, cu excepția ziua 14 suspensia membrelor posterioare (HS), unde n = 7. RL, reîncarcă; con, control.

* Semnificativ diferit de ziua 0.

† În mod semnificativ diferit de ziua 14 con.

‡ În mod semnificativ diferit de ziua 16 RL con.

§ Semnificativ diferit de momentul anterior. Nivelul de semnificație, P 0,05) (Fig. 1A). Cu toate acestea, la mușchi, randamentul ARN a scăzut după 7 zile de HS [de la 1,13 ± 0,03 μg/mg la ziua 0 la 0,86 ± 0,07 μg/mg la ziua 7 HS (P 0,05) (Fig. 1B).

Gene de referință.

După cum sa menționat în secțiunea metodelor, ARNm RPLP0 a fost destinat să servească drept factor de normalizare pentru genele de interes, iar ARNm GAPDH a fost inclus în analiză pentru a valida o expresie stabilă a ARNm RPLP0. Cu toate acestea, raportul RPLP0/GADPH nu a fost stabil (datele nu sunt prezentate) și, atunci când s-a normalizat la greutatea țesutului, s-au observat modificări semnificative pentru ambele gene atât la nivelul tendonului, cât și la nivelul mușchilor ca răspuns la suspendare și reîncărcare (P

FIG. 2.Proteina ribozomală mare P0 (RPLP0; A, B) și GAPDH (C, D) ARNm normalizat la greutatea țesutului, prezentat ca modificări ale pliurilor față de ziua 0 control, în tendonul lui Ahile (A, C) și mușchiul solei (B, D). Bare gri, grupuri de control; bare deschise, grupuri HS și RL. Valorile sunt medii geometrice ± SE. Diferență semnificativă față de cel mai relevant grup de control: *P

Expresia colagenului.

În țesutul tendinos, nu s-a observat nicio modificare ca răspuns la suspensie, fie pentru ARNm colagen I, fie III (P > 0,05) (Fig. 3, A și C). Cu toate acestea, după 4 zile de reîncărcare, s-a observat o creștere semnificativă (de 2 până la 3 ori) pentru ambele tipuri de colagenP 0,05) (Fig. 3, A și C).

FIG. 3.Colagen I (COL1A1; A, B) și colagen III (COL3A1; C, D) ARNm normalizat la greutatea țesutului, prezentat ca modificări ale pliurilor față de ziua 0 control, în tendonul lui Ahile (A, C) și mușchiul solei (B, D). Bare gri, grupuri de control; bare deschise, grupuri HS și RL. Valorile sunt medii geometrice ± SE. Diferență semnificativă față de cel mai relevant grup de control: *P

ARNm de colagen de tip I muscular nu s-a modificat ca răspuns la HS, în timp ce reîncărcarea a dus la creșterea semnificativă a nivelurilor de expresie la ziua 2 RL, ziua 4 RL și ziua 8 RL (de până la 13 ori în comparație cu ziua 14 con, P 0,05) (Fig. 3B). Pentru colagenul de tip III din mușchi, modificările observate au fost foarte asemănătoare cu cele ale colagenului de tip I și, deși expresia colagenului III pare să scadă după 7 zile de HS, aceasta nu a fost semnificativă (P > 0,05) (Fig. 3D).

Expresia IGF-IEa și MGF.

O creștere extrem de semnificativă de 2 ori a fost observată atât în ​​ARNm IGF-IEa cât și MGF la ziua 7 HS în țesutul tendinos comparativ cu ziua 0 (P 0,05). În mușchi, expresia ARNm IGF-IEa nu a fost influențată de HS (P > 0,05), în timp ce MGF a crescut moderat după 14 zile de suspendare (P 0,05) (Fig. 4, B și D). Reglarea ascendentă ca răspuns la reîncărcare a fost marcată în special pentru MGF (de -9 ori) (Fig. 4D).

FIG. 4.Factor de creștere asemănător insulinei I-Ea (IGF-IEa; A, B) și factorul de creștere mecanică (MGF; C, D) ARNm normalizat la greutatea țesutului, prezentat ca modificări ale pliurilor față de ziua 0 control, în tendonul lui Ahile (A, C) și mușchiul solei (B, D). Bare gri, grupuri de control; bare deschise, grupuri HS și RL. Valorile sunt medii geometrice ± SE. Diferență semnificativă față de cel mai relevant grup de control: *P

Expresia TGF-β1.

Expresia TGF-β1 nu s-a modificat în țesutul tendinos (P > 0,05) (Fig. 5A), în timp ce o creștere semnificativă de două până la trei ori a fost observată la nivelul mușchilor la ziua 2 RL [relativ la ziua 14 con și to ziua 14 HS (P

FIG. 5.Transformarea factorului de creștere-β1 (TGF-β1) mARN normalizat la greutatea țesutului, prezentat ca modificări ale pliurilor față de ziua 0 control, în tendonul lui Ahile (A) și mușchiul solei (B). Bare gri, grupuri de control; bare deschise, grupuri HS și RL. Valorile sunt medii geometrice ± SE. * Diferență semnificativă față de cel mai relevant grup de control: ***P

Expresia CTGF.

Nu s-au observat modificări specifice în expresia CTGF în tendon, deși a existat un efect general al tratamentului (ANOVA cu o singură cale, P

FIG. 6.Factorul de creștere a țesutului conjunctiv (CTGF) mARN normalizat la greutatea țesutului, prezentat ca modificări ale pliurilor față de ziua 0 control, în tendonul lui Ahile (A) și mușchiul solei (B). Bare gri, grupuri de control; bare deschise, grupuri HS și RL. Valorile sunt medii geometrice ± SE. Diferență semnificativă față de cel mai relevant grup de control: **P

Expresia miostatinei.

Nu s-au observat modificări semnificative nici la nivelul expresiei ARNm a miostatinei musculare, nici a tendonului (P > 0,05) (Fig. 7) și, după cum sa constatat anterior, nivelul transcrierii ARNm de miostatină a fost foarte scăzut (datele nu sunt prezentate) și foarte variabil în țesutul tendinos (23).

FIG. 7.ARNm de miostatină s-a normalizat la greutatea țesutului, prezentat ca modificări ale pliurilor față de ziua 0 control, în tendonul lui Ahile (A) și mușchiul solei (B). Bare gri, grupuri de control; bare deschise, grupuri HS și RL. Valorile sunt medii geometrice ± SE. Nu s-au observat modificări semnificative.

Prezentul studiu este primul care a investigat răspunsul simultan al tendonului și țesutului muscular scheletic la descărcare, urmat de reîncărcare. Rezultatele noastre arată o diferență clară în tendon vs. răspunsul muscular și indică o reacție surprinzător de moderată în țesutul tendinos la descărcare în ceea ce privește expresia genelor legate de matrice. Mai mult decât atât, descoperirile noastre confirmă rezultatele anterioare ale mușchilor scheletici și osului, care arată că descărcarea țesuturilor nu are ca rezultat o expresie scăzută a factorilor anabolici despre care se știe că sunt induși de încărcarea mecanică.

Masa musculară și tendinoasă.

Expresia colagenului.

După cunoștințele noastre, singurul studiu publicat asupra expresiei mARN-ului colagenului tendinos ca răspuns la nefolosire indică o posibilă, deși nesemnificativă, scăderea nivelului de mARN al colagenului I și III la tendonul anterior tibial la șobolan la 5 săptămâni după denervarea mușchilor membrului posteriorn = 4) (6). Nu am văzut niciun efect semnificativ al 14 zile de suspensie a membrelor posterioare asupra expresiei colagenului tendinos, dar datele noastre nu sunt ușor de comparat cu lucrările lui Arruda și colab. (6) din cauza diferenței în intervalul de timp al neutilizării tendonului. În plus, există indicații că efectul denervării asupra expresiei colagenului, cel puțin în țesutul muscular, este semnificativ diferit de efectul de neutilizare pură (42). Mai multe studii pe animale și un studiu recent asupra oamenilor au constatat o creștere atât a sintezei, cât și a defalcării proteinelor de colagen ca răspuns la descărcarea tendonului (5, 11, 21). Aceste descoperiri susțin că descărcarea tendonului nu reduce transcripția genelor de colagen și că modificările observate în proprietățile mecanice ale tendonului (4, 34) ar putea fi legate de o creștere a fluctuației de colagen, posibil asociată cu o dimensiune scăzută a fibrelor de colagen (36, 38).

La mușchiul scheletic, s-a demonstrat o scădere substanțială a expresiei colagenului III după 48 de ore de neutilizare musculară la om (47), iar la șobolani atât suspensia membrelor posterioare, cât și imobilizarea au dus la o scădere a expresiei colagenului I și/sau a colagenului III (20, 24 ). Cu toate acestea, în aceste studii la șobolani, scăderea a fost observată după doar 3 zile de descărcare, iar la 7 zile de descărcare, nivelurile de ARNm de colagen au revenit la normal. Astfel, o scădere a expresiei colagenului ar fi putut fi prezentă la un moment dat înaintea primei noastre măsurători la 7 zile de suspendare. Mai mult, trebuie remarcat faptul că nivelul expresiei colagenului III a avut tendința de a scădea la ziua 7 HS în prezentul studiu și atunci când se compară doar acest punct de timp cu ziua 0 grup de control folosind un simplu t-test, se observă o diferență semnificativă la nivelul ARNm colagen III (P = 0,01). Cu alte cuvinte, o slăbiciune a prezentului proiect de studiu este că numeroasele puncte de timp conduc la un număr mare de comparații post hoc și, astfel, la o severitate ridicată. Acest lucru poate duce la erori de tip 2 și diferențele reale pot fi trecute cu vederea.

Expresia IGF-I și MGF.

Intuitiv, o scădere a expresiei factorilor de creștere anabolici, cum ar fi IGF-I și MGF, ar putea fi de așteptat ca răspuns la uzarea mușchilor scheletici. Cu toate acestea, studiul de față nu a arătat nicio modificare a expresiei ARNm IGF-IEa în mușchi, iar pentru MGF s-a observat o creștere moderată după 14 zile de HS. Aceste rezultate confirmă dovezi anterioare că descărcarea musculară atât la animale cât și la oameni nu schimbă neapărat expresia isoformelor IGF-I sau chiar duce la creșterea expresiei IGF-I (2, 12, 18, 19). Acest lucru indică faptul că răspunsul la descărcarea țesutului muscular nu este doar opusul unui răspuns de încărcare și că pierderea pronunțată a masei musculare este probabil cauzată de alte mecanisme decât un nivel de expresie modificat al factorilor anabolici (13, 51).