Departamentul de Pediatrie, Universitatea Federală din São Paulo, São Paulo, São Paulo, Brazilia, Departamentul de Psihobiologie, Universitatea Federală din São Paulo, São Paulo, São Paulo, Brazilia

timpul

Departamentul de afiliere pentru psihobiologie, Universitatea Federală din São Paulo, São Paulo, São Paulo, Brazilia

Departamentul de afiliere pentru psihobiologie, Universitatea Federală din São Paulo, São Paulo, São Paulo, Brazilia

Departamentul de afiliere pentru psihobiologie, Universitatea Federală din São Paulo, São Paulo, São Paulo, Brazilia

Școala de afiliere a științelor farmaceutice a Universității din Sao Paulo, São Paulo, São Paulo, Brazilia

Centrul de hematologie și oncologie pentru pediatrie de afiliere, Institutul de Științe Biologice, Universitatea de Pernambuco, Recife, Pernambuco, Brazilia

Departamentul de Pediatrie, Universitatea Federală din São Paulo, São Paulo, São Paulo, Brazilia, Departamentul de Psihobiologie, Universitatea Federală din São Paulo, São Paulo, São Paulo, Brazilia

  • Vanessa Cavalcante da Silva,
  • Leandro Fernandes,
  • Eduardo Jun Haseyama,
  • Ana Luiza Dias Abdo Agamme,
  • Elvira Maria Guerra Shinohara,
  • Maria Teresa Cartaxo Muniz,
  • Vânia D'Almeida

Cifre

Abstract

Citare: Silva VCd, Fernandes L, Haseyama EJ, Agamme ALDA, Shinohara EMG, Muniz MTC și colab. (2014) Efectul deprivării vitaminei B în timpul sarcinii și alăptării asupra metabolizării homocisteinei și a metaboliților înrudiți în creierul și plasma plasmatică a șoarecilor. PLoS ONE 9 (4): e92683. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0092683

Editor: Shawn E. Bearden, Idaho State University, Statele Unite ale Americii

Primit: 14 noiembrie 2013; Admis: 25 februarie 2014; Publicat: 2 aprilie 2014

Finanțarea: Această lucrare a fost susținută de FAPESP (Procesul nr. 2010/00075-2 și bursă pentru EJH), CAPES (bursă pentru VCS și LF), CNPq (bursă pentru VDA) și AFIP. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Nivelurile de Hcy pot varia considerabil în rândul indivizilor în funcție de factorii genetici, dietetici și de mediu, iar concentrațiile plasmatice crescute au fost identificate ca fiind un factor de risc pentru bolile neurodegenerative [7], [8]. S-a demonstrat că perturbarea metabolismului Hcy matern și fetal atribuibil lipsei de folat sau de cobalamină joacă un rol în etiologia pierderii recurente precoce a sarcinii, a abrupției placentare și a preeclampsiei [9] - [11]. La descendenți, efectele hiperhomocisteinemiei (hHCY) au fost asociate cu nașterea prematură, întârzierea creșterii intrauterine, defecte ale tubului neural și moartea fetală [12], [13].

Dovezile din studiile observaționale și experimentale sugerează o legătură între expunerile adverse la începutul vieții, în special legate de starea nutrițională (restricție sau supliment) și susceptibilitatea la boli cronice la vârsta adultă. De exemplu, studiile la șobolani au constatat că expunerea la diabetul gestațional matern în perioada fetală sau neonatală poate duce la modificări permanente ale masei grase corporale și a circuitelor neuronale hipotalamice care reglează apetitul în creierul adult [14], [15]. Conform ipotezei originii dezvoltării sănătății și bolii, susceptibilitatea crescută la boală este parțial modelată în timpul programării fetale prin interacțiunea nutriției și mecanismelor epigenetice [16].

Rezultate

Barajele care au primit dieta cu deficit (DDD) au avut, după 20 de zile, o creștere cu aproximativ 50% a concentrațiilor plasmatice de Hcy (13,606 μmol/L) comparativ cu grupul martor (CT) (9,229 μmol/L), P Figura 1. Plasmă Concentrația Hcy la baraje după douăzeci de zile pe o dietă experimentală.

n = 6-8; PND = zi postnatală; CT = control; DDD = baraje în alimentație deficitară. testul t. Datele sunt prezentate ca medie ± eroare standard. * P≤0,05.

Descendenți

După naștere, descendenții au fost separați în trei grupe: control (CT), dieta deficitară în timpul sarcinii și alăptării (DPL) și dieta deficitară în timpul sarcinii (DP). Barajele descendenților CT și DPL au primit, respectiv, o dietă standard și deficitară în timpul sarcinii și alăptării, iar descendenții DP au fost alăptați de către barajele martor care au primit dieta standard în timpul alăptării.

Pentru a evalua efectul deficitului de vitamina B în timpul sarcinii asupra metabolismului metilului cerebral la descendenți, SAM și SAH au fost măsurate după naștere (PND 0) în grupurile DP și CT. Țesutul cerebral al descendenților feminini expuși dietei deficitare a prezentat, în comparație cu CT, o concentrație crescută de SAH (P = 0,014), dar nu a existat o diferență semnificativă în concentrația SAM (P = 0.140; Figura 2). Interesant este că analiza creierului descendenților masculi nu a arătat modificări ale concentrației SAH (P = 0,620), dar a prezentat o scădere a concentrației SAM (P = 0,028, Figura 3). Cu toate acestea, ambele femele (P Figura 2. Efectele unei diete cu deficit de vitamina B în timpul sarcinii asupra concentrațiilor SAM și SAH și a raporturilor SAM/SAM în creierul descendenților feminini la PND 0.

n = 6-8; PND = zi postnatală; CT = control; DP = dieta deficitară în timpul sarcinii; SAM = S-adenosilmetionina; SAH = S-adenosilhomocisteină. testul t. Datele sunt prezentate ca medie ± eroare standard. * P≤0,05.

n = 6-8; PND = zi postnatală; CT = control; DP = dieta deficitară în timpul sarcinii; SAM = S-adenosilmetionina; SAH = S-adenosilhomocisteină. testul t. Datele sunt prezentate ca medie ± eroare standard. * P≤0,05.

n = 6-8; PND = zi postnatală; CT = control; DP = dieta deficitară în timpul sarcinii. testul t. Datele sunt prezentate ca medie ± eroare standard. * P≤0,05.

Rezultatele privind dozarea plasmatică la PND 28 sunt rezumate în Tabelul 2. Când au fost evaluate efectele unei diete deficitare în PND 28 (înțărcare), s-a observat o creștere semnificativă a concentrației plasmatice de Hcy în grupul DPL feminin în comparație cu DP (P Tabelul 2. Efectele unei diete cu deficit de vitamina B în timpul sarcinii și al sarcinii/alăptării asupra parametrilor plasmatici și cortexului cerebral la descendenți la PND 28.

Pentru a investiga dacă o dietă maternă cu deficit de vitamina B în timpul alăptării ar putea afecta metabolismul metilului în cortexul creierului descendenților, am cuantificat concentrațiile de SAM și SAH la PND 28. Concentrațiile cortexului cerebral SAM, SAH și raportul SAM/SAH nu s-au modificat la descendenți fie la femele (P = 0,075, P = 0,0706, respectiv P = 0,588), cât și la mascul (P = 0,930, P = 0,469 și, respectiv, P = 0,565). Cu toate acestea, s-au observat scăderi ale raportului GSH total, GSH redus și GSH/GSSG în cortexul cerebral al bărbaților din grupul DPL în comparație cu DP (P = 0,047, P = 0,013 și respectiv P = 0,028) și CT P = 0,002, P = 0,009 și respectiv P = 0,049) grupuri. Nu s-a observat nicio diferență semnificativă în concentrația GSSG între grupuri (P = 0,200). La femei, s-a observat o creștere a GSH total și a GSH redus în grupul DP în comparație cu DPL (P = 0,003 și P Tabelul 3. Efectele unei diete cu deficit de vitamina B în timpul sarcinii și al sarcinii/alăptării asupra plasmei și a cortexului cerebral parametrii în descendenți la PND 90.

Discuţie

Alte studii au arătat, de asemenea, diferențele de gen ca răspuns la manipularea maternă sau la expunerea la mediu (adică poluare) [39], [40]. Studii recente privind mecanismele epigenetice arată că bărbații pot avea mai multe șanse să prezinte modificări la vârsta adultă decât femeile, datorită semnelor epigenetice care au apărut în perioada embrionară [41]. Mai mult, pe baza teoriilor evolutive, putem spune că diferențele dintre sexe ca răspuns la un „mediu advers” sunt rezultatul presiunilor selective cu beneficii potențiale pentru femele observate la mamifere [42]. Agentul predominant în acest caz este rolul reproductiv al femelei care implică îngrijirea descendenților, activitate care necesită un consum ridicat de energie, în special având în vedere sarcina și alăptarea [43], [44]. Cu toate acestea, la speciile în care masculul are un rol mai mare în îngrijirea descendenților sau dacă insulta este severă, aceste diferențe sunt reduse la minimum [42], [45].

În concluzie, o dietă cu deficit de vitamina B în timpul sarcinii modifică metabolismul SAM și SAH în creierul șoarecilor nou-născuți. Mai mult, această dietă crește Hcy-ul plasmatic și scade capacitățile antioxidante ale cortexului cerebral la descendenții alăptați la sân de barajele care au alimentat dieta deficitară în timpul alăptării. Deficitul nutrițional de cobalamină din cauza deficitului matern ar putea fi o problemă gravă de sănătate la sugari; prin urmare, trebuie luate în considerare screeningul și suplimentarea femeilor însărcinate și care alăptează pentru a preveni deficiența infantilă de cobalamină [46]. Expunerea timpurie la deficiența grupului de metil pare să aibă un impact diferit asupra descendenților feminini și masculi. Mai mult, aceste efecte persistă la descendenți într-o manieră de lungă durată; adică, bărbații de la PND 210 au prezentat o scădere a folatului plasmatic, a cortexului cerebral SAM (DPL) și a concentrațiilor plasmatice totale de GSH (DP și DPL). Prin urmare, concentrația plasmatică scăzută de GSH poate reflecta modificări redox în țesuturi, iar dezechilibrul în disponibilitatea grupurilor metilice poate modifica programarea genelor implicate în etiologia bolilor degenerative legate de vârstă.

Materiale și metode

Protocoale de tratare a animalelor

Experimentele pe animale au fost efectuate pe șoareci elvețieni și efectuate conform Ghidului pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator (ediția a 8-a, National Academy Press, Washington DC, 2011) și au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor din cadrul Universității Federale São Paulo (# 1169/08). Șoarecii adulți femele au fost menținuți în condiții standard de laborator, pe un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore, cu hrană și apă disponibile ad libitum. Cu o lună înainte de sarcină, douăzeci și opt de șoareci femele au fost distribuiți în următoarele grupuri (n = 14 per grup): a) dieta standard (AIN-93M) și, b) o dietă cu deficit de vitamine B12 (2,37 μg/kg), B2 (0,938 mg/kg), folat (0,290 mg/kg) și colină (0,1736 mg/kg), (LabDiet, St. Louis, MO). Șoarecii masculi au fost plasați în cuștile de origine a femelelor pentru împerechere și ziua gestațională zero a fost determinată prin confirmarea prezenței spermei în conținutul frotiului vaginal. Această dietă cu deficit de vitamina B și colină creează un deficit semnificativ de grup metil la făt.

După naștere, descendenții au fost distribuiți în trei grupe: control (CT), dieta deficitară în timpul sarcinii și alăptării (DPL) și dieta deficitară în timpul sarcinii (DP). Barajele descendenților CT și DPL au primit, respectiv, o dietă standard și deficitară în timpul sarcinii și alăptării. Barajele descendenților DP au primit o dietă deficitară în timpul sarcinii, dar barajele de control au adoptat această descendență în timpul alăptării (primind dieta standard). Pentru a normaliza efectul adoptării suferite de grupul DP, maternitățile au fost schimbate în cadrul fiecărui grup, CT și DPL, și au ajustat așternutul pentru n = 8 animale per baraje (n = 4, femele; n = 4, bărbați) în toate grupurile . Toate grupurile de descendenți au fost alăptați până la PND 28 și după înțărcare, toți au primit o dietă standard.

Colectie de mostre

Bărbații și femelele au fost eutanasiați prin decapitare în diferite stadii de dezvoltare (PND 0, 5, 28, 90 sau 210). Analiza acestor puncte de timp ne permite să deducem consecințele deficitului de vitamina B și colină în timpul sarcinii și al sarcinii/alăptării pe termen scurt (PND 0, 5 și 28) și posibilele modificări care apar sau rămân chiar și după introducerea dieta standard (postînțărcare) poate fi observată pe termen mediu și lung, PND 90 și respectiv 210. Având în vedere că diferențele de gen au fost descrise pe larg în literatura de specialitate pentru mai mulți parametri și, de asemenea, după manipularea în timpul sarcinii și a perioadei postnatale, bărbații și femeile au fost analizați separat în acest studiu.

Sângele a fost colectat în tuburi (Becton Dickinson, New England, Marea Britanie) care conțin acid etilendiaminetetraacetic (EDTA) și depozitat pe gheață și până la 90 de minute, centrifugat la 3000 rpm timp de 10 minute la 4 ° C. Alicote de plasmă din toate etapele, cu excepția PND 0, au fost depozitate la -80 ° C pentru măsurătorile Hcy, Cys, GSH, folat și cobalamină. Întregul creier a fost colectat, recoltat rapid și depozitat la -80 ° C pentru SAM, SAH, GSH total și măsurători/cuantificare GSH reduse.

Măsurători plasmatice

Plasma Hcy, Cys și GSH total au fost analizate prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) prin detectarea fluorescenței și eluție izocratică. Metoda a fost dezvoltată de Pfeiffer și colab. [47] cu ușoare modificări: coloana C18 Luna (5 μm, 150 mm × 4,6 mm), fază mobilă (0,06 M acetat de sodiu, 0,5% acid acetic, pH 4,7 (ajustat cu acid acetic), 2% metanol) și debit de 1,1 mL/min. Timpul de retenție a fost de 3,6 minute pentru Cys; 5.2 pentru Hcy și 9.0 pentru GSH [48].

Concentrația plasmatică de cobalamină a fost determinată de ELISA folosind trusa CUSABIO, iar concentrația plasmatică de folat a fost cuantificată prin test microbiologic [49].

Măsurători ale țesuturilor

Creierul total sau cortexul total disecat a fost omogenizat în PBS folosind un omogenizator de țesut (T10 basic IKA, Staufen, Germany).

Pentru măsurătorile SAM și SAH, proteinele și resturile au fost precipitate din țesutul omogen total cu HClO4 și centrifugate. Supernatantul a fost injectat în coloana C18 LiChroCart (5 μm, 250 mm × 4 mm). Faza mobilă a fost aplicată la un debit de 1 ml/min și a constat din 50 mM fosfat de sodiu (pH 2,8), 10 mM heptan sulfonat și 10% acetonitril. Detectorul UV avea o lungime de undă de 254 nm. Timpul de retenție a fost de 8,7 minute pentru SAH și 13,6 minute pentru SAM, o tehnică adaptată de Blaise și colab. [50].

Măsurătorile GSH cerebrale totale au fost efectuate utilizând aceeași metodă descrisă anterior pentru măsurarea GSH total plasmatic. Pentru cuantificarea GSH redusă, agentul reducător nu a fost adăugat, iar concentrațiile au fost calculate.

Analize statistice

Au fost efectuate analize ale barajelor, descendenților la PND 0 și PND 5 și la controlul femelelor și bărbaților folosind testul t pentru grupuri independente. Pentru analiza descendenților la PND 28, PND 90 și PND 210 am efectuat analiza varianței (ANOVA) urmată de testul Fisher post hoc atunci când este necesar. Pentru a afla o relație semnificativă între două variabile, a fost utilizată corelația lui Pearson. Datele au fost prezentate ca medie ± eroare standard. Nivelul de semnificație a fost P≤0,05. Pentru efectuarea analizei a fost utilizat programul STATISTICA 8.0.

Mulțumiri

Mulțumim lui Alberto Jean-Marc pentru asistență tehnică în implementarea măsurătorilor SAM și SAH de către HPLC și Patrícia Mendonça da Silva Amorim pentru asistență tehnică în măsurarea folatului de plasmă.

Contribuțiile autorului

Conceput și proiectat experimentele: VCdS VD MTCM. Au efectuat experimentele: VCdS LF EJH ALDAA. Analiza datelor: VCdS LF. Reactivi/materiale/instrumente de analiză contribuite: VD EMGS. Am scris lucrarea: VCdS LF.