Maria Wiese

1 Departamentul de Știința Alimentelor, Universitatea din Copenhaga, Rolighedsvej 26, 1958, Frederiksberg, Danemarca

licopenului

Yuriy Bashmakov

2 Lycotec Ltd., Granta Park, Cambridge, CB21 6GP, Marea Britanie

Natalia Chalyk

3 Universitatea Medicală de Stat, Institutul de Cercetare în Cardiologie, Str. Chenyshevskogo nr. 12, 410028 Saratov, Rusia

Dennis Sandris Nielsen

1 Departamentul de Știința Alimentelor, Universitatea din Copenhaga, Rolighedsvej 26, 1958, Frederiksberg, Danemarca

Łukasz Krych

1 Departamentul de Știința Alimentelor, Universitatea din Copenhaga, Rolighedsvej 26, 1958, Frederiksberg, Danemarca

Witold Kot

4 Departamentul de Științe ale Mediului, Universitatea Aarhus, Danemarca

Victor Klochkov

3 Universitatea Medicală de Stat, Institutul de Cercetare în Cardiologie, Str. Chenyshevskogo nr. 12, 410028 Saratov, Rusia

Dmitry Pristensky

2 Lycotec Ltd., Granta Park, Cambridge, CB21 6GP, Marea Britanie

Tatyana Bandaletova

5 DiagNodus Ltd., Granta Park, Cambridge, CB21 6GP, Marea Britanie

Marina Chernyshova

2 Lycotec Ltd., Granta Park, Cambridge, CB21 6GP, Marea Britanie

Nigel Kyle

2 Lycotec Ltd., Granta Park, Cambridge, CB21 6GP, Marea Britanie

Ivan Petyaev

2 Lycotec Ltd., Granta Park, Cambridge, CB21 6GP, Marea Britanie

Date asociate

Rezultatele de susținere vor fi afișate pe site-ul public Lycotec.com. Mai mult, datele care susțin rezultatele acestui studiu sunt disponibile de la autorul corespunzător, Dr. Ivan M Petyaev, la cerere rezonabilă.

Abstract

1. Introducere

Carotenoizii sunt micronutrienți esențiali, care nu pot fi sintetizați de oameni și trebuie să fie obținuți din alimente. Licopenul, pigmentul roșu al roșiilor, al pepenelui verde și al altor fructe, este unul dintre carotenoizi. Aportul de alimente bogate în licopen a fost legat de o prevalență mai scăzută a bolilor cardiovasculare, accident vascular cerebral [1] și a unor forme de cancer [2, 3]. Studiile clinice intervenționale limitate au indicat capacitatea sa terapeutică de a încetini dezvoltarea aterosclerozei carotide [4], a proprietăților antiinfecțioase și antiinflamatorii [5], îmbunătățirea parametrilor asociați cu hiperplazia de prostată [6], beneficii în gestionarea cancerului de prostată [ 7] și ajută la protejarea pielii de daunele UV [8, 9].

Concentrația licopenului în sânge și țesuturile corpului este foarte variabilă și depinde de obiceiurile alimentare și de vârstă și a fost, de asemenea, legată de starea de sănătate. De exemplu, concentrația plasmatică sau serică poate varia de la aproximativ 60 ng/ml, sau mai jos, la 600 ng/ml sau mai mare [10]. Un nivel redus în organism s-ar putea datora a trei motive majore: fie aportul alimentar scăzut, absorbția afectată a licopenului și prelucrarea de exemplu la persoanele în vârstă sau cei cu sindrom metabolic, ceea ce are ca rezultat o biodisponibilitate slabă a acestui carotenoid sau datorită epuizării sale accelerate ca un rezultat al patologiilor continue ale radicalilor liberi în organism.

Consensul actual cu privire la efectele benefice largi ale licopenului asupra sănătății există în ceea ce privește proprietățile sale antioxidante puternice și protecția aferentă a lipoproteinelor și a altor structuri lipidice împotriva deteriorării oxidative, care sunt de obicei asociate cu o serie de condiții patologice [1, 11].

2. Metode

Design de studiu. În total, 30 de voluntari au fost recrutați pentru a participa la studiu, 15 bărbați și 15 femei, toți caucazieni cu vârsta cuprinsă între 40-68 și mediana 55 ± 5,7 ani. Au fost randomizate și împărțite în cinci grupuri de dimensiuni egale. Grupul I a primit o doză zilnică de 10 g ciocolată neagră cu 7 mg licopen printr-un protocol propriu care garantează încorporarea sa maximă în partea lipidică a ciocolatei, L-Tug și pe o altă acoperire optimă de licopen cu cristale de ciocolată și formarea coco-licozomilor, DCL [16]. Grupul II a primit zilnic o capsulă de 7 mg licopen GA formulată cu acizi grași saturați medii, GAL-MSFA, grupa III o capsulă zilnic de 30 mg GAL-MSFA, grupa IV o capsulă zilnic 30 mg de licopen GA formulată cu acizi grași polinesaturați, GAL-PUFA și grupați V 10 g de ciocolată neagră martor zilnic. Trei grupuri GAL au primit capsule de licopen orbite, în timp ce alte două grupuri au primit produse DC orbite.

Produse. Toate produsele pentru test au fost dezvoltate și realizate de Lycotec Ltd. (Cambridge, Regatul Unit). Produsul a fost special conceput pentru a îmbunătăți biodisponibilitatea licopenului la persoanele de vârstă mijlocie, cu vârsta de 50 de ani sau peste sau la cei care au afecțiuni precum sindromul metabolic, ficatul gras etc. [17]. Acesta conținea fosfatidilcolină, care servește ca element principal de schelă pentru încorporarea licopenului în timpul reasamblării intracelulare a lipoproteinelor, procesul esențial pentru transportul licopenului, dar afectat la persoanele de mai sus.

Au existat două formulări de GAL, pentru două aplicații nutraceutice diferite, care au fost aplicate în acest studiu. Primul a fost cu un amestec de MSFA pentru a facilita formarea de chilomicroni mici-mijlocii, care ar fi transportați de vena portă pentru ficatul care vizează livrarea licopenului. Al doilea a fost un amestec cu PUFA pentru a facilita formarea de chilomicroni mai mari, care ar fi transportați de canalul toracic pentru circulația sistemică a sângelui ocolind ficatul. Toate produsele GAL au fost fabricate în capsule de gelatină.

Pentru control DC și DCL s-a folosit ciocolată neagră 70% Green & Black. A fost fabricat din boabe de cacao Trinitario și conținea 42% grăsimi, din care saturații erau 25%; glucide 36,5%, dintre care zaharurile au fost 28,5%; fibre 10%, proteine ​​9,1%, sare 0,13%. Fiecare bară de 10 g conținea 1,5 mg de catechine, 6,6 mg de epicatechine, 1,9 mg de dimer-B2, 7,5 mg de cafeină, 75 mg de teobromină, 75 μg de feniletilamină, 55 μg de serotonină și ≤ 0,1 μg de resveratrol.

Atât capsulele, cât și produsele din ciocolată au fost sfătuite să fie luate o dată pe zi după masa principală.

Durata procesului a fost de 1 lună.

Partea de tratament a studiului și analiza sângelui au fost efectuate la Institutul de Cardiologie, Ministerul Sănătății al Federației Ruse (Saratov, Federația Rusă) de către Lycotec Ltd. (Cambridge, Regatul Unit). Protocolul a fost aprobat de Comitetul local de etică (FGBU SarNIIK18.02.2014). Numărul de înregistrare a procesului a fost ACTRN12618000715279. Toți pacienții au fost informați cu privire la scopul și obiectivele studiului și au semnat un formular de consimțământ înainte de înscrierea și participarea la studiu.

Analiza microbiotei scaunelor a fost făcută de Departamentul de Știința Alimentelor din Secțiunea de Microbiologie Alimentară, de la Universitatea din Copenhaga din Danemarca.

Probele de piele au fost analizate de Lycotec la Cambridge.

2.1. Criterii de includere/excludere

Criteriile de incluziune au fost următoarele:

capacitatea de a semna un consimțământ informat,

nefumători sau fumători ușori până la moderate (≤ 10 țigări zilnic),

moderat obezi cu IMC între 30 și 35 kg/m 2,

cu markeri serici crescuti ai afectarii oxidative inflamatorii, IOD ≥ 40 μM/mL si stres oxidativ, LDL-Px, ELISA × 10 3 ≥ 200,

nicio participare la alte studii dietetice în ultimele 3 luni înainte de înscriere și durata studiului,

disponibilitatea și capacitatea de a se conforma protocolului de studiu pe durata studiului.

Criteriile de excludere au fost următoarele:

refuzul de a semna consimțământul informat,

incapabil să respecte protocolul pe durata studiului,

antecedente de infarct miocardic în cele 3 luni care preced studiul, fracția de ejecție (EF) 10 băuturi pe săptămână),

sau expunerea regulată la alte substanțe de abuz,

participarea la alte studii nutriționale sau farmaceutice,

ritm cardiac în repaus> 100 bătăi pe minut sau 2. Rata pulsului, tensiunea arterială sistolică și diastolică, SBP și DBP au fost înregistrate de trei ori pe brațul stâng al pacientului așezat după 15 minute de odihnă. Timpul dintre măsurători a fost mai mare de 2 minute. S-a calculat rezultatul mediu pentru fiecare parametru. Toți parametrii corporali și vasculari au fost înregistrați dimineața între orele 8-10.

Oxigenarea țesuturilor. Eminența Thenar și mușchii antebrațului pacienților au fost folosiți ca țintă tisulară pentru evaluarea saturației oxigenului, StO2 sau a nivelurilor combinate de hemoglobină oxigenată și mioglobină. StO2 a fost evaluat prin spectroscopie cu lungime de undă continuă în infraroșu apropiat, NIRS, cu derivat secundar cu spațiu larg (In Spectra, Hutchinson Technology, MN, SUA). Măsurătorile au fost luate în diferite momente de timp. Înregistrarea a fost inițiată după 15 minute de repaus în decubit dorsal înainte de ocluzia arterei brahiale. A fost apoi continuat în timpul ischemiei stagnante induse prin umflarea rapidă a manșetei la 50 mm Hg peste TA sistolică. Ischemia a durat 3 minute, iar perioada de înregistrare a durat încă 5 minute după aceea până când StO2 a fost stabilizat. Zona de sub curba hiperaemică, ASC, a semnalului înregistrat pentru timpul de decantare în perioada de postocluzie a fost apoi calculată așa cum s-a descris anterior în% O2/minut [17, 18].

Colecția de mostre. Sângele a fost recoltat prin flebotomie dimineața, în spital și din venele brațelor pacienților după postul de noapte. Serul a fost separat de restul masei coagulate prin centrifugare; alicote au fost apoi stocate în tuburi marcate cu cod pentru analize orbite și stocate la -80 ° C până la utilizare.

Pentru colectarea probelor de pe suprafața pielii feței și a probelor de cerumen, toți participanții la studiu au fost rugați să evite manipulările igienice ale feței și urechii timp de 24 de ore înainte de prelevare, care a fost efectuată dimineața în paralel cu recoltarea probelor de sânge. Colectarea și pregătirea probelor de suprafață a pielii au fost efectuate așa cum s-a descris anterior [19]. Pe scurt, probele au fost colectate folosind tampoane din poliester de pe suprafața pielii feței (părțile laterale ale nasului). În timpul procedurii au fost prelevate două probe (un tampon pe fiecare parte). Fiecare probă colectată a fost plasată pe suprafața unui diapozitiv pentru microscop. Un al doilea diapozitiv de microscop a fost apăsat pe suprafața primului. Această procedură a furnizat o pereche de frotiuri identice. Toate diapozitivele cu probe colectate au fost codificate pentru a furniza anonimatul probei pentru analize orbite și stocate la -20 ° C până la o analiză ulterioară.

Probele de scaun au fost colectate fie dimineața, fie seara înainte de ziua vizitei la spital. Participanții au făcut această colecție ei înșiși, la confortul casei lor, dimineața în ziua vizitei clinicii. Un kit special și recipiente pentru probe au fost furnizate de echipa de testare. Probele colectate au fost etichetate și depozitate la -80 ° C până la analiză.

2.3. Bună analiză a microbiomei

2.3.1. Extragerea ADN-ului

ADN-ul genomic a fost extras din material fecal cu stomac de 200 mg (stomacher 2x 60 sec la viteză medie) utilizând protocolul Power Soil Kit (Laboratoarele MoBio). Etapa FastPrep de bile a fost efectuată în 3 cicluri de câte 15 s fiecare la o viteză de 6,5 M/s într-un omogenizator FastPrep-24TM (MP). Cantitatea și calitatea ADN-ului au fost măsurate utilizând un NanoDrop 1000 (Thermo Scientific), preparat de bibliotecă genică ARNs 16S. Compoziția microbiotei fecale a fost determinată folosind secvențierea de mare randament pe bază de genă MiSeq bazată pe MiSeq (Illumina, CA, SUA) a genei ARNr 16S Pe scurt, regiunea V3 a genei ARNr 16S a fost amplificată folosind primerii compatibili cu Nextera Index Kit (Illumina) NXt_338_F: 5′- TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGACACACCACCACACGGGGGGGTCAGCAG -3GTGCGGGG reacțiile PCR și pregătirea bibliotecii au fost efectuate așa cum este descris în [21].

2.3.2. Secvențierea și tratarea datelor cu randament ridicat

Biochimie. Glucoza, colesterolul total, trigliceridele, colesterolul cu densitate ridicată, colesterolul cu densitate mică și proteina C reactivă au fost determinate folosind truse analitice disponibile în comerț conform instrucțiunilor producătorilor (ByoSystems, R&D Systems).

Analiza cantitativă a licopenului. Concentrația de licopen din toate probele de ser a fost măsurată în duplicat prin cromatografie lichidă de înaltă performanță [26] cu modificări. Pe scurt, 400 μl de ser a fost amestecat cu 400 μl de etanol și a fost extras de două ori cu 2 ml de hexan. Straturile combinate de hexan au fost evaporate la sec în vid (centrifugă Scan Speed ​​32) și reziduul reconstituit la un volum de 100 μl în soluție de probă (etanol absolut - clorură de metilen, 5: 1, v/v). Probele au fost centrifugate din nou (15 minute la 10.000 g) și supernatantul clar a fost transferat în flacoane HPLC. Cinci microlitri de extract au fost injectați într-o coloană Acquity HSS T3 75x 2,1 mm 1,8 μm (Waters, SUA) precedată de o precolumnă VanGuard Acquity HSS T3 1,8 μm (Waters, SUA) și eluată izocratic la 45 ° С cu faza mobilă acetonitril - Soluție de acid fosforic 0,08% - terț-butil metil eter, 70: 5: 25, v/v/v) la un debit de 0,5 ml/min. Vârful licopenului a fost detectat de un detector de matrice fotodiodă (Waters, SUA) la 474 nm. Zona de vârf a fost măsurată utilizând software-ul Empower 3 (Waters, MA). Concentrația de licopen în probele de ser a fost calculată prin referire la un standard analitic (licopen de la tomate, L9879, Sigma, SUA).

Daune oxidative inflamatorii (IOD). Probele de ser au fost incubate peste 0,05 M tampon acetat de PBS (pH 5,6) peste noapte, pentru a imita tipul de daune oxidative care apare în timpul eliberării lizozomilor după degradarea neutrofilelor. În dimineața următoare reacția a fost oprită folosind acid tricloracetic. Concentrația produselor finale, cum ar fi malondialdehida (MDA) și alte posibile substanțe reactive ale acidului tiobarbituric (TBARS), a fost apoi măsurată prin colorimetrie [27] folosind reactivi și truse de la Cayman Chemical (MC, SUA).

LDL-Px și Lipoproteina O 2. Activitatea serică a proteinelor LDL peroxidazei, care includ IgG cu activitate superoxid dismutază, a fost măsurată așa cum s-a descris anterior [28]. Oxigenul plasmatic, care este transportat de lipidele/lipoproteinele din sânge, a fost măsurat prin catalitrie [29].