Abstract

杆菌 枯草 芽孢 杆菌 B10 高脂 高脂 日粮 诱导 的 小鼠 脂肪 代谢 及 氧化 应激 的 改善 作用, 并 初步 探讨 其 作用 机制。

杆菌 了 枯草 芽孢 杆菌 B10 可以 有效 改善 高脂 日粮 诱导 的 小鼠 脂肪 代谢 和 氧化 应激, 且 发现 此 作用 主要 与 B10 脂肪 脂肪 代谢 基因PPARα 、DHCR24、HMGCS2) 及 氧化 应激 基因 (XO、p53) GS 和) 过氧化物 GS (GSH-Px) 酶 有关。

将 ICR 日粮 分为 对照 组 (饲喂 高脂 日粮) 和 实验 组 (饲喂 添加 枯草 芽孢 杆菌 菌粉 的 高脂 日粮)。 饲喂 30 天后, 收集 小鼠 的 血清 及 肝脏 样品。 采用中 盒) 抗 氧化 及 脂肪 代谢 相关 指标 和 中 中 8- 羟基 脱氧 鸟 苷 (8-OHdG) 含量。 使用 荧光 定量 聚合酶 链式 反应 (PCR) 测定 小鼠 肝脏 中 脂肪 代谢 和 氧化 应激 相关 基因表达 表达 水平。

杆菌 含有 枯草 芽孢 杆菌 B10 的 高脂 日粮 能够 有效 降低 小鼠 的 体重 (表 2), 降低 血清 中 葡萄糖 和 甘油三酯 含量 及 谷草 转氨酶 和 谷 丙 转氨酶 活力 (表 3 和 4); 10 肝脏 中 脂肪 合成 相关 基因 量, 但 上调 脂肪 分解 相关 基因 表达 图 (图 1), 并 提高 肝脏 中 抗 氧化 相关 基因 表达 量 (图 2)。 综上所述, 枯草 芽孢 杆菌 B10 量 有效 调节 代谢脂肪 代谢, 并 改善 其 氧化 应激。

1. Introducere

Au fost utilizate mai multe strategii pentru prevenirea obezității, inclusiv controlul dietei, exercițiile fizice, terapia comportamentală și medicația. Probioticele, care sunt definite ca „microorganisme vii care, atunci când sunt administrate în cantități adecvate, conferă gazdei un beneficiu pentru sănătate” (Araya și colab., 2002), ar putea modula flora intestinală și ar avea unele capacități anti-oxidative și de scădere a lipidelor (Endo și colab., 2013; Everard și colab., 2014). Bacillus subtilis este un microorganism intestinal care poate crește în intestin și poate consuma oxigen pentru a menține un mediu anaerob pentru prevenirea sau terapia tulburărilor gastro-intestinale (Hu și colab., 2014). în plus, Bacillus subtilis este preferat datorită rezistenței sale mai mari la medii dure și capacității de depozitare pe termen lung la temperatura ambiantă (Hong și colab., 2005). Anterior, am raportat că Bacillus subtilis B10 poseda efecte pozitive asupra apărării anti-oxidative a celulelor in vitro (Li și colab., 2013) și aceste constatări ne determină să investigăm în continuare efectul de reglementare al Bacillus subtilis B10 asupra capacităților anti-oxidative și de scădere a lipidelor la șoarecii obezi induși de HFD.

2. Materiale și metode

2.1 Tulpina bacteriană

Bacillus subtilis Pulberea B10 (10 8 unități de formare a coloniilor (CFU)/g) a fost preparată de Laboratorul de Microbiologie și Inginerie genetică, Institutul de Științe Alimentare, Universitatea Zhejiang, China. Tulpina B10 a fost cultivată pe mediu Luria-Bertani, menținută la 37 ° C timp de 24 de ore și agitată la 180 r/min. Celulele bacteriene pure au fost colectate după centrifugare la 5000g timp de 10 min la 4 ° C și răcire. Ulterior, aceste celule au fost spălate de două ori cu soluție sterilă de clorură de sodiu 0,85% (8,5 g/L). În cele din urmă, puritatea culturii și identificarea au fost verificate constant prin metoda plăcii de împrăștiere (Nikoskelainen și colab., 2003).

2.2 Animale și diete

Treizeci de șoareci masculi ICR (7-8 săptămâni, n= 15 per grup) au fost obținute de la Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea Zhejiang, China. Toți șoarecii au fost adăpostiți în cuști de plastic standard (trei șoareci pe cușcă) și au fost menținuți într-un ciclu lumină-întuneric de 12 ore la temperatură și umiditate constante (23 ± 1) ° C și (55 ± 5)%, respectiv). Un grup de șoareci a fost hrănit cu HFD (92,8% dietă normală, 2% colesterol, 5% untură de porc și 0,2% colat) și celălalt a fost ținut pe un HFD suplimentat cu 0,1% (g/g) B10 pulbere timp de 30 de zile . Dieta normală a fost asigurată de Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (Shanghai, China) și nivelul componentelor sale nutritive este listat într-un material suplimentar Tabelul S1. În timpul preparării pulberii B10, amidonul a fost utilizat pentru a dilua B10 și aceeași cantitate de amidon a fost, de asemenea, adăugată la grupul HFD pentru a compensa diferența în compoziția nutrienților din diete. Toți șoarecii au fost hrăniți ad libitum iar consumul de alimente a fost înregistrat. Experimentul a fost aprobat și realizat în conformitate cu liniile directoare ale comitetului de etică local.

2.3 Colectarea probelor

După 30 de zile, șoarecii (n= 6) din fiecare grup (HFD și B10) au postit 12 ore și apoi au fost anesteziați cu dietil eter. Șoarecii au fost uciși prin dislocare cervicală și probele de sânge au fost prelevate din vena cavă inferioară. După incubare la 4 ° C timp de 30 min și centrifugare la 2000g timp de 20 min, s-a obținut serul (Centrifuga 5804R, Eppendorf, Germania). Probele de ficat au fost disecate și plasate în azot lichid. Probele au fost în cele din urmă înghețate și menținute la -80 ° C timp de cel mult 2 luni până la o analiză ulterioară.

2.4 Analize biochimice ale serului

Conținutul de glucoză, trigliceride (TG), colesterol total (TC), colesterol lipoproteic cu densitate mică (LDL-C), colesterol lipoproteic cu densitate mare (HDL-C), azot din uree din sânge (BUN), transaminază oxaloacetică glutamică (GOT) )) și transaminaza pirutică glutamică (GPT) în ser au fost determinate prin spectrofotometrie în conformitate cu instrucțiunile producătorului kitului. Metodele acestor kituri sunt prezentate în materialul suplimentar Data S1. Materialele de măsurare a glucozei au fost achiziționate de la Rongsheng Bio-Pharmaceutical Co., Ltd., Shanghai, China. Kituri pentru serul TG și TC au fost achiziționate de la Saike Bio-technology Co., Ltd., Ningbo, China. Kituri pentru serul BUN, GOT și GPT au fost cumpărate de la Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China. Materialele pentru serul LDL-C și HDL-C au fost achiziționate de la Beihuakangtai Clinical Reagent Co., Beijing, China.

2.5 Analize biochimice ale ficatului

Probele de ficat au fost omogenizate cu ser fiziologic răcit cu gheață (1:10, v/v) și centrifugate la 2000g timp de 10 min (Centrifuga 5804R, Eppendorf, Germania). Supernatantul a fost colectat pentru determinarea capacității anti-oxidante totale (T-AOC), a activității anionului anti-superoxid (ASOA), a concentrațiilor de TC, TG, LDL-C, HDL-C, 8-hidroxi-2'-deoxiguanozină (8OHdG ), glutation (GSH) și tioredoxin reductază (TrxR) și activitățile de superoxid dismutază (SOD), catalază (CAT), glutation peroxidază (GSH-Px) și xantină oxidază (XO). Kituri pentru TC și TG hepatice au fost obținute de la Saike Biological Technology Co., Ltd., Ningbo, China. Kituri pentru LDL-C hepatic și HDL-C au fost achiziționate de la Beihuakangtai Clinical Reagent Co., Beijing, China. Kituri pentru SOD, CAT, GSH-Px, XO, T-AOC, ASOA și GSH au fost achiziționate de la Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China. Toți parametrii de mai sus au fost determinați prin spectrofotometrie în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Kituri de testare imunosorbentă enzimatică (ELISA) pentru 8-OHdG și TrxR au fost achiziționate de la Bioleaf Biological Co., Ltd., Shanghai, China.

2.6 Extracția ARN și reacția în lanț cantitativă în timp real a polimerazei (PCR)

Pentru extracția ARN s-au utilizat țesuturi hepatice de aproximativ 100 mg. ARN a fost extras folosind metoda RNAiso plus (TaKaRa, Dalian, China) conform instrucțiunilor producătorului. Analizele cantitative și calitative ale ARN-ului izolat au fost evaluate din raportul de absorbanță la 260 și 280 nm prin spectrofotometru NanoDrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE, SUA) și electroforeză pe gel de agaroză (Sangon Biotech, Shanghai, China). ADN complementar (ADNc) a fost sintetizat din 1 μg de ARN total utilizând transcriptaza inversă M-MLV (TaKaRa, Dalian, China). Modificările transcripționale au fost apoi identificate prin PCR cantitativ (qPCR), care a fost efectuat folosind Premix Ex Taq ™ cu SYBR Green (TaKaRa, Dalian, China) conform instrucțiunilor producătorului și sistemul ABI 7500 Fast Real Time PCR (Applied Biosystems), Carlsbad, CA, SUA). Protocolul de termociclu a durat 30 s la 95 ° C, urmat de 40 de cicluri de 5 s de denaturare la 95 ° C, 34 s de recoacere/extindere la 60 ° C și apoi o analiză finală a curbei de topire pentru a monitoriza puritatea produsului PCR . Secvențele Primer pentru genele șoarecilor au fost proiectate și selectate de programele Primer 5.0 și Oligo 7.0, iar secvențele sunt prezentate în Tabelul 1.

metoda a fost utilizată pentru a estima abundența ARNm. ΔCq este Cq, țintă-Cq, referință și ΔΔCq este ΔCq, tratament-ΔCq, control. Nivelurile relative de expresie genică au fost normalizate la cele ale genelor de referință eucariote gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază (GAPDH) și β-actină.

alimentare

Grunduri utilizate pentru PCR în timp real

2.7 Analiza statistică

Datele sunt exprimate ca medie ± deviație standard (SD) și au fost analizate utilizând procedura de analiză unidirecțională a varianței (ANOVA) a SPSS 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, SUA) pentru Windows prin testul Tukey și variabila utilizată este administrarea de B10. Diferențele au fost considerate semnificative statistic la P

3. Rezultate

3.1 Efectele suplimentării alimentare a Bacillus subtilis B10 privind greutatea corporală și aportul alimentar al șoarecilor

În timp ce greutatea corporală finală și creșterea medie zilnică în greutate pentru grupul HFD + B10 în mod semnificativ (P masa 2

Efectele suplimentării alimentare a Bacillus subtilis B10 privind greutatea corporală și aportul alimentar al șoarecilor

3.2 Efectele suplimentării alimentare a Bacillus subtilis B10 pe profilul lipidic în serul și ficatul șoarecilor

TC hepatic și TG de șoareci hrăniți cu HFD au fost efectiv (P Tabelul 3

Efectele suplimentării alimentare a Bacillus subtilis B10 pe profilurile lipidice din ficat și serul șoarecilor

Efectele suplimentării alimentare a Bacillus subtilis B10 privind parametrii biochimici serici ai șoarecilor

3.3 Efectele suplimentării alimentare a Bacillus subtilis B10 pe șoareci expresie de ARNm hepatic de gene asociate cu metabolismul lipidic al șoarecilor

Administrarea de B10 a reglat în jos nivelurile de transcriere ale 3β-hidroxisteroid-Δ24 reductazei (DHCR24) semnificativP FIG. 1

Efectul suplimentării alimentare a Bacillus subtilis B10 privind expresia ARNm asociat cu metabolismul lipidic la ficatul șoarecilor din HFD (dietă bogată în grăsimi) și HFD + B10 cu dietă bogată în grăsimi cu 0,1% Bacillus subtilis B10) grupuri

3.4 Efectele suplimentării alimentare a Bacillus subtilis B10 asupra valorilor biochimice antioxidante hepatice și deteriorarea ADN-ului șoarecilor

După cum se arată în Tabelul 5, administrarea de B10 a scăzut în mod remarcabil concentrațiile de 8-OHdG hepatice (P Tabelul 5

Efectele suplimentării alimentare a Bacillus subtilis B10 asupra stresului oxidativ indus de HFD în ficatul șoarecilor

3.5 Efectele suplimentării alimentare a Bacillus subtilis B10 pe expresia ARNm hepatică a genelor asociate cu stresul oxidativ al șoarecilor

S-a constatat că nivelurile de transcriere ale GR, XO și Hsp90 genele din ficat au fost mult mai puține pentru grupul B10 decât pentru grupul HFD (P FIG. 2

Efectul suplimentării alimentare a Bacillus subtilis B10 privind expresia ARNm asociat cu anti-oxidare la ficatul șoarecilor din HFD (dietă bogată în grăsimi) și HFD + B10 cu dietă bogată în grăsimi cu 0,1% Bacillus subtilis B10) grupuri

4. Discutie

Genele sintezei lipidelor (PPARγ, DHCR24, PPARβ), lipoliza (HMGCS2, CAT I) și metabolismul energetic (PPARα) sunt implicate în metabolismul lipidelor. Șoarecii obezi induși de HFD au asociere cu metabolismul lipidic anormal în ficat, inclusiv acetil-CoA carboxilaza 1 modificată (ACC1), acizi grași sintetaza (FAS), factor adipos indus de post (FIAF), și PPARγ expresia genei (Kang și colab., 2013; Xin și colab., 2014). În studiul nostru, HFD a indus, de asemenea, metabolismul lipidic anormal în comparație cu șoarecii hrăniți cu o dietă normală (date neprezentate), inclusiv reglarea în sus a genelor de sinteză a lipidelor și reglarea în jos a lipolizei. Pentru grupul HFD + B10, expresia mARN a hepaticului PPARα și HMGCS2 este crescut în timp ce DHCR24 Expresia ARNm scade (Fig. 1). Astfel, s-ar putea deduce că efectul pozitiv al B10 asupra reducerii lipidelor se poate datora reglării în sus a lipolizei și reglării în jos a sintezei lipidelor. Acest lucru este în concordanță cu studiul lui Kang și colab. (2013) și Park și colab. (2013), în care nivelul de transcriere a PPARα a fost, de asemenea, crescută și expresia unor gene de sinteză și lipoliză a lipidelor a fost reglată de probiotice.

5. Concluzii

In concluzie, Bacillus subtilis B10 ar putea scădea creșterea în greutate a șoarecilor obezi induși de dietă prin îmbunătățirea metabolismului lipidic și a stării de stres oxidativ.

Respectarea ghidurilor de etică

Kai LEI, Ya-li LI, Yang WANG, Jing WEN, Hong-zhao WU, Dong-you YU și Wei-fen LI declară că nu au niciun conflict de interese.

Au fost respectate toate orientările instituționale și naționale pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator.