A contribuit în mod egal la această lucrare cu: Jorge Molina-López, María Antonieta Quispe Ricalde, Basilio Valladares Hernández, Elena Planells

efectul

Conceptualizare roluri, curatarea datelor, analiză formală, investigație, metodologie, scriere - schiță originală, scriere - revizuire și editare

Departamentul de Fiziologie, Facultatea de Farmacie, Universitatea din Granada, Granada, Spania, Institutul de nutriție și tehnologia alimentară, Centrul de cercetare biomedicală, Parcul tehnologic al științelor sănătății, Universitatea din Granada, Granada, Spania

A contribuit în mod egal la această lucrare cu: Jorge Molina-López, María Antonieta Quispe Ricalde, Basilio Valladares Hernández, Elena Planells

Conceptualizare roluri, curatarea datelor, investigație, metodologie, resurse, scriere - schiță originală, scriere - revizuire și editare

Afiliere Institutul Universitar de Boli Tropicale și Sănătate Publică din Insulele Canare, Universitatea din La Laguna, La Laguna, Tenerife, Insulele Canare, Spania

A contribuit în mod egal la această lucrare cu: Jorge Molina-López, María Antonieta Quispe Ricalde, Basilio Valladares Hernández, Elena Planells

Investigarea rolurilor, metodologie, resurse, supraveghere, scriere - revizuire și editare

Afiliere Institutul Universitar de Boli Tropicale și Sănătate Publică din Insulele Canare, Universitatea din La Laguna, La Laguna, Tenerife, Insulele Canare, Spania

Roluri Curarea datelor, Analiza formală

Autori ‡ Acești autori au contribuit, de asemenea, în mod egal la această lucrare.

Unitatea de afiliere pentru studii sociale a apărării, secretar general tehnic, Ministerul Apărării, Madrid, Spania

Roluri Curarea datelor, Analiza formală

Autori ‡ Acești autori au contribuit, de asemenea, în mod egal la această lucrare.

Departamentul de statistică pentru afiliere. Facultatea de Științe Sociale și Juridice, Universitatea Carlos III, Getafe, Madrid, Spania

A contribuit în mod egal la această lucrare cu: Jorge Molina-López, María Antonieta Quispe Ricalde, Basilio Valladares Hernández, Elena Planells

Investigații de roluri, metodologie, resurse, scriere - schiță originală, scriere - recenzie și editare

Departamentul de Fiziologie, Facultatea de Farmacie, Universitatea din Granada, Granada, Spania, Institutul de nutriție și tehnologie alimentară, Centrul de cercetare biomedicală, Parcul tehnologic al științelor sănătății, Universitatea din Granada, Granada, Spania

  • Jorge Molina-López,
  • María Antonieta Quispe Ricalde,
  • Basilio Valladares Hernández,
  • Antonio Planells,
  • Roberto Otero,
  • Elena Planells

Cifre

Abstract

Scop

S-a făcut un studiu cu privire la modificările exprimării genelor la sportivii de handbal de elită, comparând modularea genică înainte, după și în absența unei intervenții nutriționale de 8 săptămâni cu suplimente multivitamine/minerale.

Metode

Au fost incluși 13 sportivi de handbal de elită (cu vârsta de 22,9 ± 2,7 ani) și 13 controale sedentare (cu vârsta de 20,9 ± 2,8 ani). Au fost stabilite trei puncte de timp: T0 (condiții de bază); T8 (după 8 săptămâni de suplimentare cu un complex multivitaminic/mineral); și T16 (după 8 săptămâni în absența suplimentării). Expresiile unui total de 112 de gene au fost evaluate prin analiza RT-qPCR cu sistemul QuantStudio ™ 12K Flex Real-Time PCR System.

Rezultate

Analiza a relevat diferite profiluri de reglare a genelor ale genelor implicate în comunicarea celulară, metabolismul energiei celulare, inflamația și sistemul imunitar, stresul oxidativ și funcția musculară la sportivi comparativ cu controalele sedentare în condiții de odihnă (gene reglate în sus: dimensiunea efectului = mare, ƞ2 = 1,011 la 1.398, p Tabelul 1. Conținutul sesiunilor de antrenament săptămânal la sportivii de handbal.

Criteriile de includere au fost: promovarea unei evaluări medicale de recrutare constând dintr-un examen clinic, evaluarea istoricului medical, statutul de nefumător și absența utilizării medicamentelor. Criteriile de excludere au fost: consumul de suplimente nutritive de orice fel în 6 săptămâni înainte și în timpul studiului și lipsa dorinței de a participa la studiu. Studiul a fost aprobat de Comitetul de Etică al Universității din Granada și a fost realizat în conformitate cu Declarația de la Helsinki. Scopul studiului și posibilele sale riscuri și disconforturi au fost explicate participanților înainte de obținerea consimțământului lor scris. Studiul a fost înregistrat la Institutul Național de Sănătate al SUA (ClinicalTrials.gov) NCT03672786. Titlu: Expresia genelor la sportivii interveniți.

Proiectare experimentală

SED = controale sedentare; MÂNĂ = Jucători de handbal de elită.

Caracteristicile participanților

Prelevarea de sânge și izolarea și cuantificarea ARN-ului

Participanții au raportat la laborator luni dimineață între 8 a.m. și 10 a.m. după ce s-a abținut de la exerciții fizice cel puțin 24 de ore. După o perioadă de repaus în decubit dorsal de 10 minute, s-au recoltat probe de sânge venos din vena antecubitală utilizând tehnici standard. Mai exact, probele au fost colectate în tuburi speciale (tub de ARN din sânge PAXgene, Becton Dickinson, Germania) pentru a determina expresia ARN și au fost depozitate la -80 ° C până la analiză.

Tuburile de ARN din sânge PAXgene au fost incubate timp de două ore la temperatura camerei pentru a realiza liza completă a celulelor sanguine. Apoi, 2,5 ml de sânge integral uman în tuburile de ARN din sânge PAXgene au fost centrifugate timp de 10 minute la 5000 g. După centrifugare, supernatantul a fost aruncat și peleta a fost spălată cu 4 ml de apă fără RNază și vortexată și centrifugată timp de 10 minute la 5000 g. După spălare, peleta a fost dizolvată în 350 μl tampon de resuspendare și incubată cu 300 μl tampon de legare și 40 μl proteină K timp de 10 minute la 55 ° C într-un agitator-incubator. Lizatul a fost transferat într-o coloană de centrifugare PAXgene și centrifugat la 18.000 g timp de trei minute. Fracția de curgere a fost amestecată cu 350 pl de etanol și transferată într-o coloană de rotire ARN PAXgene. După spălarea coloanei cu tamponul de spălare 1, probele au fost incubate cu 10 pl de DNază I timp de 15 minute. Coloanele de rotire ARN PAXgene au fost spălate cu tampon de spălare și ARN eluat cu 40 pl tampon de eluare. Eficacitatea tratamentului cu DNază a fost evaluată în probe RT-negative.

Randamentul ARN a fost estimat prin măsurarea absorbanței la 260 nm într-un spectrofotometru NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific). Puritatea ARN a fost calculată din raportul de absorbție la 260 nm și 280 nm. Raportul OD 260/280 a fost între 1,9 și 2,2 pentru toate probele. Integritatea ARN-ului a fost evaluată utilizând testul Eucaryote Total RNA Nano pe un bioanalizator Agilent 2100 (Agilent Technologies). Calitatea ARN a fost evaluată în funcție de numărul de integritate ARN (RIN) folosind 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). Eșantioanele de înaltă calitate (RIN ≥ 9) și eșantioanele de calitate standard (RIN = 7) au fost incluse în studiu pentru a asigura o abordare mai realistă.

PCR cantitativ în timp real cu randament ridicat (RT-qPCR)

Transcrierea inversă a fost efectuată cu hexameri aleatori utilizând trusa de transcripție inversă cDNA de mare capacitate (Life Technologies, Carlsbad, CA, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. Două μg din ARN-ul total a fost transcris invers cu hexameri aleatori folosind trusa de transcripție inversă cDNA de mare capacitate. Condițiile ciclului termic au fost setate să funcționeze timp de două ore la 37 ° C și timp de 10 minute la 75 ° C, urmate de o răcire rapidă la 4 ° C.

Un studiu anterior a fost efectuat pentru a selecta cele mai adecvate gene de menaj (S3 Tabel). Un total de 52 de gene au fost incluse în analiză pentru a determina valoarea stabilității (M) și coeficientul de variație a nivelurilor normalizate de expresie a genei de referință utilizând software-ul qBasePLUS (Biogazelle, Ghent, Belgia). Valoarea Cq a fiecărei probe a fost încărcată în software-ul qBasePLUS în trei exemplare, cu valori limită setate de M 0,8) - dimensiunile efectului sub 0,2 fiind considerate banale [35]. S-a utilizat analiza de varianță cu măsuri repetate bidirecționale (ANOVA) pentru a determina efectul timpului (tratament sau fără tratament) și interacțiunea dintre grupul timp *. Mărimea efectului a fost estimată utilizând parțial eta pătrat (η2, proporția de varianță a rezultatului explicată). După Cohen, am interpretat valorile η2 estimate astfel: mic = 0,01; moderat = 0,06; mare = 0,14 [35].

Rezultate

Participanți

Treizeci și două de persoane au fost inițial eligibile pentru includere în studiu. Dintre aceștia, doi care corespund grupului de control sedentar au fost excluși, deoarece au raportat că sunt activi fizic (S1 FIG). Dintre cei 14 sportivi alocați intervenției, unul a fost exclus în timpul urmăririi din cauza accidentării. La rândul lor, doi dintre subiecții sedentari au fost excluși, deoarece nu au urmat intervenția multivitaminică/minerală, iar un participant a fost exclus din cauza problemelor de angajare în timp. Astfel, 13 sportivi de handbal de elită și 13 controale sedentare au fost în cele din urmă înscriși în studiu.

În medie, sportivii de handbal de elită au ingerat mult mai multă energie decât controalele sedentare (2974,5 ± 211,1 față de 2177,4 ± 488,1 Kcal; p 1,5 în condiții de bază la sportivi. Un test comparativ separat pentru probe independente având în vedere sportivii și controalele sedentare a arătat ITGB1, IL6R, MAPKAPK2, ACVR1B și SOD2 urmează să fie reglate în sus la sportivi în condiții de odihnă (dimensiunea efectului = mare; ƞ2 = 1,011 până la 1,398; p 1,5, acest lucru nu a fost semnificativ statistic între grupuri.

Comparația modelelor de expresie genică după intervenția multivitamine/minerale

Fig. 2 prezintă variația în timp a nivelurilor de ARN corespunzătoare celor 78 de gene analizate, precum și genele care prezintă diferențe semnificative în timpul perioadei de studiu. Sportivii au arătat o tendință de a regla în sus unele gene cheie la momentul T8 în comparație cu controalele sedentare. Spre deosebire, sportivii de handbal au arătat o tendință spre exprimarea descendentă la T16, în timp ce controalele au prezentat o variabilitate mai mare în răspunsul la expresia genei în același punct de timp.

Modificări relative ale pliurilor în nivelurile de ARN de 78 de gene la martorii sedentari (A) și la sportivii de handbal (B) după 8 săptămâni de intervenție multivitaminică/minerală (linii albastre - T8) și după 8 săptămâni în absența intervenției nutriționale (linii verzi - T16 ).

Modificările procentuale în nivelurile de ARN corespunzătoare celor 78 de gene analizate în controalele sedentare comparativ cu valorile inițiale nu au fost semnificative nici la momentul T8, nici la punctul T16 (variația mediană la T8 și T16: 1,61% și respectiv 6,33%).Fig 3). În cazul sportivilor de handbal, răspunsul genetic total nu a prezentat modificări semnificative la T8 (variație mediană la T8: 1,97%). Cu toate acestea, analiza generală a expresiei genelor de la momentul inițial până la momentul T16 (8 săptămâni în absența intervenției nutriționale) a arătat o scădere semnificativă (variație mediană la T16: -11,49%).

Modificări procentuale în expresia genelor la controalele sedentare (A) și la sportivii de handbal (B) de la momentul inițial (T0) până la 8 săptămâni de intervenție nutrițională (T8) și după 8 săptămâni în absența intervenției nutriționale (T16).

S-au efectuat măsuri repetate ANOVA pentru a compara modulația în expresia genelor înainte și după suplimentarea cu multivitamine/minerale și a analiza interacțiunea dintre timp și grupuri. Tabelul 4 prezintă profilurile de reglementare ale ARN la momentul inițial (T0) versus intervenția nutrițională (T8) și după 8 săptămâni, în absența intervenției nutriționale (T16), atât la controalele sedentare, cât și la sportivii de elită. Efectul principal al timpului a fost dezvăluit pentru gene cheie precum ITGB1, PDHA2 și ACVR1B, implicate în funcții de performanță sportivă, cum ar fi metabolismul energiei celulare și creșterea musculară/dimensiunea/funcția corpului (ηp2 = 0,102, p. Tabelul 4. Profiluri de reglementare distincte ale ARN-ului prin grup pe tot parcursul perioadei de studiu.

Interacțiunea Time x Group a existat pentru genele de performanță sportivă IRAK1, CD81, ITGB1, ACADS, PDHA2 și GPX1 (ηP2 = 0,070 până la 0,092; p Fig 4.

(A) Modificarea procentuală a expresiei genelor pentru genele de top la sportivii de handbal și controalele sedentare de la momentul inițial până la 8 săptămâni de intervenție nutrițională (T8) și (B) după 8 săptămâni în absența intervenției nutriționale (T16).

Discuţie

Există un argument celular care sugerează că gena ACVR1B este legată de forță [41] și sprint/putere [42] la sportivi. Capacitățile de forță și putere joacă un rol cheie în performanța sportului în echipă, iar pe baza literaturii științifice, antrenamentul fizic specific include antrenamentul de forță și putere care influențează semnificativ performanța săriturilor și aruncării, precum și confruntările fizice din handbalul în echipă [43]. ACVR1B face parte din superfamilia TGF-β, un set de factori de creștere care reglează nivelul de expresie al anumitor gene implicate în creșterea musculară [44]. Deși literatura existentă s-a concentrat pe studiul legăturii genei ACVR1B pentru a determina variațiile fenotipurilor de forță musculară la sportivi [41], studiul nostru îmbunătățește înțelegerea unui profil mai mare de exprimare a acestei gene la sportivii de elită ca răspuns la solicitările exercițiilor fizice. La nivelul comunicării celulare și al inflamației, gena ITGB1 a prezentat o modificare procentuală între 53,9-65,2%. În conformitate cu studiul nostru, Lui și colab. [11] a constatat că antrenamentul la exerciții poate induce în mod cronic modificări transcripționale ale sângelui periferic. Aceste gene pot fi cruciale în modificarea stării imunologice la indivizii cu înaltă pregătire.

Al doilea obiectiv al nostru a fost explorarea posibilei modulații în expresia genelor după o intervenție nutrițională care combina multivitamine și minerale. Sportivii noștri au prezentat efecte maxime de reglare a genelor după 8 săptămâni de suplimentare (Fig. 2). Cele două gene principale afectate de schimbările de timp au fost PDHA2 și ACADS - ambele fiind implicate în metabolismul energetic celular. Complexul piruvat dehidrogenază catalizează conversia generală a piruvatului în acetil coenzima A și CO2 și, prin urmare, leagă calea glicolitică de ciclul tricarboxilic. Până în prezent, unii autori [50] au sugerat că subiecții instruiți la exercițiu prezintă o capacitate maximă crescută de a utiliza carbohidrați ca urmare a unei expresii crescute a complexului piruvat dehidrogenază în mușchiul scheletic. În mod similar, gena ACADS este esențială pentru oxidarea acizilor grași - procesul cu mai multe etape care descompune grăsimile și le transformă în energie. În acest sens, Zoladz și colab. [51] au raportat niveluri crescute de ACADS (până la

aproximativ 65%) în mitocondriile izolate de la șobolani instruiți. Acest lucru sugerează că antrenamentul de rezistență duce la reglarea în sus a capacității oxidative mitocondriale musculare în condiții fiziologice. Cu toate acestea, merită subliniat faptul că în studiul de față, gena ACADS părea supraexprimată de aproximativ 37% la sportivi comparativ cu valoarea inițială și reglată în jos cu aproximativ 90% după încetarea intervenției nutriționale (timepoint T16 versus timepoint T8). Acest lucru ar putea explica expresia crescută a genei și ar putea consolida beneficiile rezultate din modificările adaptive implicate în procesele metabolice și fiziologice specifice la sportivi [7] și efectul pozitiv al suplimentării, confirmat de semnificația statistică a grupului de timp observat * interacțiune (Tabelul 4).

Concluzii

Pe scurt, am înregistrat un profil de expresie diferit al genelor cheie din celulele sanguine care sunt implicate în funcții majore de performanță sportivă la jucătorii de handbal de elită, comparativ cu controalele sedentare. Intervenția multivitaminică/minerală a arătat un efect limitat asupra câtorva gene metabolice nutriționale. Cu toate acestea, intervenția a modulat reglarea crescută sau descendentă coordonată a genelor cheie legate de căi specifice și ar putea avea influențe pozitive semnificative asupra funcțiilor de performanță sportivă, cum ar fi funcția mitocondrială, comunicarea celulară, creșterea musculară, răspunsul la stres oxidativ și inflamația acută.