Bolile inflamatorii cronice sunt asociate cu modificări ale speciei și compoziției genomice a microbiotei intestinale.

emulgatorii

Emulsifianții dietetici polisorbat 80 (P80) și consumul de carboximetilceluloză (CMC) are ca rezultat intrarea microbiotei în mucus, modificări ale compoziției microbiotei și dezvoltarea inflamației cronice.

Inflamația în sine poate avea un impact asupra compoziției microbiotei, ceea ce face foarte dificilă discernerea măsurii în care acești compuși acționează direct asupra microbiotei față de promovarea inflamației gazdei, care ulterior se remodelează.

Care sunt noile descoperiri?

CMC și P80 nu au impact asupra microbiotei intestinale și nici asupra gazdei la șoareci care adăpostesc o microbiotă fără patobionți.

Utilizarea simulatorului de mucoasă al ecosistemului microbian intestinal uman (M-SHIME) relevă faptul că atât P80 cât și CMC modifică direct microbiota, crescând potențialul său proinflamator.

Când sunt transplantate la șoareci fără germeni, suspensiile M-SHIME tratate cu CMC și tratate cu P80 promovează fenotipuri asociate inflamației de grad scăzut care indică faptul că efectele directe ale acestor emulgatori asupra microbiotei sunt suficiente pentru a determina inflamația de grad scăzut și boala metabolică.

Cum ar putea avea impact asupra practicii clinice în viitorul previzibil?

Observația că emulgatorii CMC și P80 au un impact direct asupra microbiomilor umani într-o manieră care amintește de efectele lor la șoareci susține utilizarea acestui model ca mijloc practic de testare a siguranței aditivilor alimentari.

Rezultatele noastre demonstrează utilitatea sistemului M-SHIME ca instrument de explorare a mecanismelor de bază ale oricăror modificări ale gazdei/microbiotei.

Introducere

Prin urmare, obiectivul central al acestui studiu a fost de a investiga măsura în care CMC și P80 ar putea modifica direct microbiota folosind un simulator de mucoasă al modelului ecosistemului microbian intestinal uman (M-SHIME), care permite menținerea stabilă a unei microbiote umane complexe în in vitro în absența celulelor gazdă.13-16 Am observat că P80 și CMC au modificat microbiota în modelul M-SHIME într-un mod care amintește și este capabil să recapituleze efectele lor observate anterior la șoareci, sugerând astfel că microbiota poate fi o țintă directă cheie a CMC și P80.

Metode

Șoarecii C57BL/6 au fost menținuți în condiții gnotobiotice într-o stare GF sau alterată a florei Schaedler (ASF) într-un izolator Park Bioservices, așa cum s-a descris anterior. locuințe. Toți șoarecii au fost crescuți și adăpostiți la Georgia State University (Atlanta, Georgia, SUA) în conformitate cu protocoale aprobate instituțional (IACUC # A14033). Șoarecii au fost hrăniți cu LabDiet Rodent Chow # 5021 autoclav sau au o dietă bogată în grăsimi purificată iradiată (20-40 kGy) D12492-1.5V de la Research Diet (New Brunswick, New Jersey, SUA) (vezi tabelul suplimentar S1 online). Experimentele au folosit atât șoareci masculi, cât și femele (comparații la un sex), cu excepția figurilor 7 și 8 care au folosit șoareci femele. Șoarecii ASF au fost stabiliți prin colonizarea șoarecilor WT C57BL/6 GF cu ASF complet (opt tulpini) folosind fecale cumpărate de la ASF Taconic (Hudson, New York, SUA) și resuspendate în apă potabilă.

tabel suplimentar

Măsurarea glicemiei la jeun

Șoarecii au fost așezați într-o cușcă curată și au postit timp de 5 ore sau 15 ore. Concentrația de glucoză din sânge a fost apoi determinată folosind un glucometru Nova Max Plus și exprimată în mg/dL.

Tratamentul emulgator al sistemului M-SHIME

Analiza metatranscriptomică M-SHIME

Transplant de microbiota a suspensiei M-SHIME tratate cu emulgator

Simulatorul de mucoasă tratat cu carboximetilceluloză (CMC) și tratat cu P80 al ecosistemului microbian intestinal uman (M-SHIME) suspensiile promovează încălcarea microbiotei atunci când este transplantat la șoareci receptori fără germeni. Un sistem M-SHIME cu opt nave a fost creat și inoculat cu fecale umane proaspete în ziua −7. După o perioadă de stabilizare de 7 zile, vasele au fost tratate cu apă, CMC 1% sau P80 1% timp de 13 zile. Șoarecii C57BL/6 fără germeni (vârsta de 3-4 săptămâni) au fost îndepărtați din izolator și au fost administrați oral cu 200 μL de suspensie luminală M-SHIME (probă de ziua 11). Șoarecii transplantați au fost apoi adăpostiți în cuști izolate ventilate, Isocages (Techniplast). (A) Analiza microscopică confocală a localizării microbiotei: Muc2 (verde), actină (violet), bacterii (roșu) și ADN (albastru). Bară = 20 μm. (B) Distanțele dintre cele mai apropiate bacterii de celulele epiteliale intestinale (IEC) pe afecțiune pe trei câmpuri de mare putere pe șoarece. Datele sunt mijloacele ± SEM (N = 5). Fiecare grup de tratament a fost comparat cu grupul de control (tratat cu apă), iar semnificația statistică a fost determinată folosind testul t Student.

analize statistice

Distribuția normală a datelor a fost evaluată folosind testul omnibus D'Agostino-Pearson. Semnificația a fost determinată utilizând testul t sau analiza de varianță a grupului bidirecțional (ANOVA) cu testul de comparații multiple al lui Bonferroni (software GraphPad Prism, V.6.01). Diferențele au fost observate ca semnificative * p≤0,05 pentru testul t și # p≤0,05 pentru ANOVA cu două căi. Pentru analiza grupării pe graficele principale de coordonate, categoriile au fost comparate, iar semnificația statistică a clusterizării a fost determinată prin Permanova.

Rezultate

CMC și P80 nu afectează microbiota intestinală sau gazda la șoarecii ASF

Pentru a investiga măsura în care CMC și P80 ar putea avea impact asupra gazdei și/sau microbiotei la șoareci cu o microbiotă definită limitată fără patobionți, am administrat CMC și P80 șoarecilor colonizați exclusiv cu ASF. Așa cum se arată în figurile 1 și 2, nici CMC și nici P80 nu au avut un impact semnificativ asupra unei game de parametri gazdă sau microbieni la șoareci ASF. Pe scurt, indiferent dacă a fost evaluat la nivel global prin analiza coordonatelor principale sau prin compararea speciilor individuale (Tabelul 1), testarea nivelurilor relative ale celor opt componente ASF prin q-PCR a indicat faptul că nici CMC și nici P80 nu au afectat compoziția microbiotei șoarecilor ASF și nici nu au modificat nivelurile fecale ale receptorilor Toll-like (TLR) -agoniști LPS și flagelină (figurile 1 și 2). Mai mult, la șoareci ASF, administrarea CMC și P80 nu a dus la atingerea microbiotei (figura 2L, M), subțierea mucusului sau caracteristici ale inflamației/sindromului metabolic de grad scăzut care sunt induse de acești compuși la șoarecii cu o microbiotă complexă., aceste rezultate argumentează împotriva noțiunii că acești emulgatori au un efect direct puternic asupra gazdei și sugerează mai degrabă posibilitatea ca efecte mai subtile asupra unei microbiote complexe să fie mediatori proximali ai efectelor acestor compuși.

Carboximetilceluloza (CMC) și P80 nu au impact asupra compoziției microbiotei intestinale la șoarecii alterați din flora Schaedler (ASF). Șoarecii ASF C57BL/6 de șase săptămâni au fost expuși la CMC sau P80 diluați în apă potabilă (1,0%) timp de 11 săptămâni. (A - I) ADN-ul fecal total a fost extras și supus q-PCR folosind primerii specifici pentru 16S rARN (A), Clostridium sp. (ASF 356) (B), Lactobacillus intestinalis (C), Lactobacillus murinus (D), Mucispirillum schaedleri (E), Eubacterium plexicaudatum (F), Firmicutes bacterium (G), Clostridium sp. (ASF 502) (H) și Parabacteroides sp. (Eu). Rezultatele sunt exprimate ca număr de bacterii pe mg de scaun (A), utilizând o curbă standard sau ca valori relative (B - I). (J - M) Analiza coordonatelor principale a fost efectuată utilizând distanța euclidiană cu cei opt membri ASF în săptămâna 6 (J), săptămâna 8 (K), săptămâna 10 (L) și săptămâna 17 (M). Datele sunt mijloacele ± SEM (N = 3-6). Pentru analiza clusterelor pe graficele principale de coordonate, categoriile au fost comparate și semnificația statistică a clusterizării a fost determinată folosind metoda Perman.

Carboximetilceluloza (CMC) și P80 nu induc inflamații intestinale, nici sindrom metabolic, nici încălcare a microbiotei la șoareci alterați din flora Schaedler (ASF). Șoarecii ASF C57BL/6 de șase săptămâni au fost expuși la CMC sau P80 diluați în apă potabilă (1,0%) timp de 11 săptămâni. (A) Greutatea corporală finală, (B) greutatea tamponului de grăsime, (C) 5 ore concentrația de glucoză în sânge, (D) greutatea splinei, (E) greutatea colonului, (F) lungimea colonului, (G) greutatea caecului,) ficatul greutate, (I) fecale Lcn2, (J) lipopolizaharidă (LPS) și (K) niveluri de flagelină (FliC) la 4 și 12 săptămâni. (L) Analiza microscopică confocală a localizării microbiotei; Muc2 (verde), actină (violet), bacterii (roșu) și ADN (albastru). Bară = 20 μm. (M) Distanțele celor mai apropiate bacterii de celulele epiteliale intestinale (IEC) per afecțiune pe trei câmpuri de mare putere pe șoarece. Datele sunt mijloacele ± SEM (N = 3-6). Fiecare grup de tratament a fost comparat cu grupul de control (tratat cu apă), iar semnificația statistică a fost determinată folosind testul t Student.

P80 modifică compoziția microbiotei în modelul M-SHIME

P80 modifică simulatorul de mucoasă al compoziției microbiote a ecosistemului microbian intestinal uman (M-SHIME). Un sistem M-SHIME cu opt nave a fost creat și inoculat cu fecale umane proaspete în ziua −7. După o perioadă de stabilizare de 7 zile, vasele au fost tratate cu apă (N = 2), carboximetilceluloză (CMC) 1% (greutate/volum, N = 3) sau P80 1% (volum/volum, N = 3) timp de 13 zile. Compoziția de microbiotă luminală a fost analizată utilizând secvențierea Illumina a regiunii V4 a genelor ARNr 16S. (A - C) Analiza principală a coordonatelor matricii ponderate a distanței UniFrac în zilele −6 și 11 (A), ziua −6 (B) și ziua 11 (C). (D și E) Media distanței ponderate UniFrac în cadrul grupului (apă, CMC și P80) și între grup (apă vs CMC și apă vs P80) a fost calculată în zilele −6 (D) și 11 (E). Datele sunt mijloacele ± SEM (N = 2-3). Pentru analiza clusterelor pe graficele principale de coordonate, categoriile au fost comparate, iar semnificația statistică a clusterizării a fost determinată folosind metoda Permanova.

cifre suplimentare

date suplimentare

Atât CMC, cât și P80 modifică expresia genei microbiene în modelul M-SHIME

Carboximetilceluloza (CMC) și P80 cresc potențialul proinflamator al simulatorului de mucoasă al microbiotei ecosistemului microbian intestinal uman (M-SHIME). Un sistem M-SHIME cu opt nave a fost creat și inoculat cu fecale umane proaspete în ziua −7. După o perioadă de stabilizare de 7 zile, vasele au fost tratate fie cu apă (N = 2), CMC 1% (g/v, N = 3), fie cu P80 1% (v/v, N = 3) timp de 13 zile. (A) Suspensia Luminal M-SHIME Nivelurile de flagelină (FliC) în zilele −7, −6, −3, −2, 1, 4, 6, 8, 11 și 13. (B) Suspensia Luminal M-SHIME a fost injectată intraperitoneal la șoareci Rag -/- și IL-6 a fost măsurată în ser la 2 ore după injectare. Datele sunt mijloacele ± SEM (N = 3). Fiecare grup de tratament a fost comparat cu grupul de control (tratat cu apă), iar semnificația statistică a fost determinată folosind testul t Student.

Am urmărit apoi să investigăm dependența de concentrație a efectelor CMC și P80 în modelul M-SHIME. M-SHIME au fost tratați cu 0,00%, 0,10%, 0,25%, 0,50% sau 1,00% CMC sau P80 (v/v și, respectiv, g/v). Aparatul relativ complex necesar pentru a menține fiecare unitate M-SHIME ca un ecosistem independent ne-a împiedicat să rulăm replici paralele. Mai mult, deși aceste experimente au folosit același donator uman folosit mai sus pentru a inocula vasele M-SHIME, posibilitatea ca microbiomul acestui donator să fi diferit în zilele în care au fost furnizate probele pentru acest lucru și experimentele descrise mai sus nu pot fi eliminate. Cu toate acestea, avertismente, am observat că toate dozele testate de P80 și toate, cu excepția celei mai mici doze de CMC, au determinat o creștere a nivelurilor de flagelină în mai multe puncte de timp, deși nu afișează o relație liniară clară dependentă de doză (figura 6A, C). Tratamentul cu P80 a dus, de asemenea, la o creștere clară a nivelurilor LPS-agonist TLR4, în special la doze mai mari (figura 6B, D). Împreună, aceste rezultate au indicat faptul că CMC și P80 pot acționa direct asupra unei microbiote complexe într-un mod care ar putea crește potențialul său de a promova inflamația în gazdă.

Carboximetilceluloza (CMC) și P80 cresc potențialul proinflamator al simulatorului de mucoasă al microbiotei ecosistemului microbian intestinal uman (M-SHIME). Un sistem M-SHIME cu nouă nave a fost creat și inoculat cu fecale umane proaspete în ziua −11. După o perioadă de stabilizare de 11 zile, vasele au fost tratate fie cu apă, CMC (0,10%, 0,25%, 0,50% sau 1,00%) sau P80 (0,10%, 0,25%, 0,50% sau 1,00%) timp de 10 zile. (A și B) Lipopolizaharidă suspensie Luminal M-SHIME (LPS) (A) și Flagellin (FliC) (B) niveluri de M-SHIME tratate cu CMC în zilele −10, −7, −4, −2, 0, 1, 2, 3, 5, 7 și 10. (C și D) Lipopolizaharidă luminală M-SHIME (LPS) (C) și niveluri de flagelină (FliC) (D) de M-SHIME tratate cu CMC și tratate cu P80 la zile - 10, −7, −4, −2, 0, 1, 2, 3, 5, 7 și 10. Datele sunt exprimate ca valori relative cu ziua −1 definită ca 1 (N = 1).

Suspensiile M-SHIME tratate cu CMC și tratate cu P80 promovează fenotipuri asociate inflamației de grad scăzut la șoareci

Se știe că unele modificări ale microbiotei predispun la creșterea în greutate la expunerea la un HFD obezogen.29-31 Prin urmare, am analizat măsura în care inocularea cu suspensie M-SHIME tratată cu emulgator ar avea impact asupra șoarecilor care primesc GF la hrănirea animalelor colonizate HFD. Am observat că la hrănirea HFD, șoarecii care primeau suspensii M-SHIME tratate cu emulgator au câștigat mai multă greutate decât cei care primeau M-SHIME tratate cu apă. O astfel de creștere în greutate crescută s-a corelat cu niveluri crescute de glucoză din sânge în repaus alimentar (vezi figura suplimentară online S13C) și inflamație, cum ar fi o scurtare a colonului (vezi figura suplimentară online S13F) și splenomegalie (vezi figura suplimentară online S13H). Împreună, aceste rezultate sugerează că efectele directe ale CMC și P80 asupra microbiotei joacă un rol în conducerea fenotipurilor inflamometabolice induse de acești compuși in vivo.

Discuţie

Acel transfer al M-SHIME-urilor tratate cu CMC și tratate cu P80 la șoareci transferați caracteristici ale sindromului inflamator/metabolic de grad scăzut susține ideea că acțiunile directe ale acestor compuși observate în modelul M-SHIME joacă un rol central în medierea lor. efecte dăunătoare asupra gazdei. Am emis ipoteza că trăsătura cheie a microbiotelor M-SHIME tratate cu emulgator care le-au condus capacitatea de a promova inflamația după transplant a fost capacitatea lor mai mare de a invadă celulele gazdă, după care produsele lor (de exemplu, LPS și flagelină) ar induce expresia genelor proinflamatorii, inclusiv producția de citokine care pot desensibiliza încrucișat semnalizarea receptorilor metabolici.12, 38

Diferențele în parametrii microbiotei și gazdei între șoarecii GF care primesc M-SHIME tratate cu apă și emulsificatoare au persistat timp de multe săptămâni după transplantul M-SHIME. Cu toate acestea, având în vedere că orice CMC rezidual sau P80 prezent în timpul transplantului ar fi spălat rapid la transferul la șoareci GF, ar fi putut fi rezonabil să presupunem că microbiota ar reveni rapid la starea sa netratată. Speculăm că o astfel de persistență reflectă faptul că răspunsul inițial al gazdei la M-SHIME modificate menține și/sau îmbunătățește modificările expresiei genei microbiotei și duce la alte modificări ale compoziției. Lipsa reversiei benefice a microbiotei la șoarecii care primesc M-SHIME tratate cu CMC și P80 ar putea fi, de asemenea, o consecință a abordării noastre care nu permite unei microbiote normale de șoarece să concureze cu un microbiom uman perturbat, care poate fi mai dificil pentru intestin coral. Indiferent, aceste observații evidențiază importanța interacțiunilor timpurii gazdă - microbiotă în a avea un impact durabil asupra relației gazdă - microbiotă și, în consecință, asupra sănătății gazdelor.

În concluzie, deși nu credem că M-SHIME sau orice microbiotă fără gazdă poate defini pe deplin modul în care un agent ar avea impact asupra microbiotei în cadrul gazdei sale, rezultatele noastre demonstrează că acest sistem poate fi un instrument foarte util pentru explorarea mecanismelor de bază. Modelul M-SHIME ne-a permis să concluzionăm că observația noastră conform căreia emulgatorii CMC și P80, care au fost observați anterior ca au impact asupra microbiomului șoarecelui, au un impact asupra microbiomilor umani, cel puțin în acest model ex vivo. Această observație ar trebui să ne permită să proiectăm mai bine studii clinice la om pe emulgatori alimentari, pe care sperăm să le inițieze în curând. Mai mult, rezultatele noastre descrise aici sugerează cu tărie că microbiota este o țintă directă importantă a aditivilor alimentari CMC și P80. Presupunem că acest model ar putea permite o investigație mecanicistă ulterioară asupra modului în care acești compuși modifică direct microbiota. Mai mult, rezultatele noastre sugerează că astfel de modele pot fi un mijloc util de a dezvolta aditivi alimentari și vehicule medicinale care își mențin funcțiile dorite fără a afecta negativ microbiomul.

Mulțumiri

Autorii îi mulțumesc dr. Amanda Ramer-Tait pentru secvențele primerilor specifici ai membrilor ASF.39