Departamentul de afiliere pentru pediatrie, Școala postuniversitară de științe medicale, Universitatea de Medicină Prefecturală din Kyoto, orașul Kyoto, Japonia

homeostazia

Departamentul de Pediatrie, Facultatea de Științe Medicale, Universitatea Prefecturală de Medicină din Kyoto, orașul Kyoto, Japonia, Departamentul de Pediatrie, Spitalul municipal Ayabe, orașul Ayabe, Japonia

Departamentul de afiliere pentru pediatrie, Școala postuniversitară de științe medicale, Universitatea de Medicină Prefecturală din Kyoto, orașul Kyoto, Japonia

Departamentul de afiliere pentru pediatrie, Școala postuniversitară de științe medicale, Universitatea de Medicină Prefecturală din Kyoto, orașul Kyoto, Japonia

Departamentul de afiliere pentru pediatrie, Școala postuniversitară de științe medicale, Universitatea de Medicină Prefecturală din Kyoto, orașul Kyoto, Japonia

Departamentul de afiliere pentru pediatrie, Școala postuniversitară de științe medicale, Universitatea de Medicină Prefecturală din Kyoto, orașul Kyoto, Japonia

Departamentul de afiliere pentru pediatrie, Școala postuniversitară de științe medicale, Universitatea de Medicină Prefecturală din Kyoto, orașul Kyoto, Japonia

Departamentul de Afiliere pentru Gastroenterologie Moleculară și Hepatologie, Școala Absolventă de Științe Medicale, Universitatea de Medicină Prefecturală din Kyoto, Kyoto City, Japonia

Departamentul de afiliere pentru pediatrie, Școala postuniversitară de științe medicale, Universitatea de Medicină Prefecturală din Kyoto, orașul Kyoto, Japonia

Departamentul de afiliere pentru pediatrie, Școala postuniversitară de științe medicale, Universitatea de Medicină Prefecturală din Kyoto, orașul Kyoto, Japonia

  • Kazuki Kodo,
  • Satoru Sugimoto,
  • Hisakazu Nakajima,
  • Jun Mori,
  • Ikuyo Itoh,
  • Shota Fukuhara,
  • Keiichi Shigehara,
  • Taichiro Nishikawa,
  • Kitaro Kosaka,
  • Hajime Hosoi

Cifre

Abstract

Citare: Kodo K, Sugimoto S, Nakajima H, Mori J, Itoh I, Fukuhara S și colab. (2017) Eritropoietina (EPO) ameliorează obezitatea și homeostazia glucozei, promovând termogeneza și funcția endocrină a țesutului adipos brun clasic (BAT) la șoarecii obezi induși în dietă. PLoS ONE 12 (3): e0173661. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0173661

Editor: Jonathan M. Peterson, East Tennessee State University, STATELE UNITE

Primit: 17 decembrie 2016; Admis: 17 februarie 2017; Publicat: 13 martie 2017

Disponibilitatea datelor: Toate datele relevante se află în hârtie și în fișierele sale de informații de suport.

Finanțarea: O parte din această lucrare a fost susținută de JSPS KAKENHI Grant Number 24650427 (H. N. primit) (https://kaken.nii.ac.jp/ja/search/?kw=24650427).

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Obezitatea și bolile sale comorbide, inclusiv diabetul, bolile cardiovasculare, accidentul vascular cerebral și unele tipuri de cancer, au crescut dramatic și sunt acum o problemă de sănătate la nivel mondial. Eritropoietina (EPO), un hormon peptidic derivat din rinichi necesar pentru a produce globule roșii în măduva osoasă, este prescris pacienților cu anemie care suferă de anemie renală și anemie de prematuritate [1]. Recent, s-a acordat multă atenție EPO datorită efectelor sale neritiroidiene, inclusiv reglarea metabolismului grăsimilor, glucozei și energiei [2-14]. Cu toate acestea, mecanismele din spatele acestor efecte rămân neclare. Studiile anterioare care au investigat mecanismul efectului anti-obezitate și anti-diabet al EPO s-au concentrat în principal pe țesutul adipos alb, mușchi și ficat [7-16]. Studiul nostru a investigat mecanismul care stă la baza efectelor anti-obezitate și anti-diabetice ale EPO asupra țesutului adipos brun clasic (BAT).

BAT crește cheltuielile de energie prin inducerea termogenezei la mamifere și a primit multă atenție ca țintă în combaterea obezității și a diabetului [17-20]. Adipocitele termogene sunt împărțite în două categorii: adipocite maro clasice și adipocite bej (denumite și brite), fiecare cu trăsături anatomice și de dezvoltare distincte [21,22]. Recent, funcția BAT ca organ endocrin, pe lângă funcția sa termogenă, a atras atenția. BAT eliberează factorul de creștere a fibroblastelor 21 (FGF21), un hormon peptidic care poate atenua obezitatea și diabetul în experimentele pe animale [23-25] și care crește sensibilitatea la insulină și reduce gluconeogeneza în ficat [26-30].

Acest studiu a urmărit să descopere dacă EPO acționează asupra BAT clasice pentru a exercita efectul anti-obezitate și anti-diabetic la șoarecii hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi. Demonstrăm că EPO a crescut masa BAT interscapulară (iBAT, care este partea principală a BAT clasică) și termogeneză prin îmbunătățirea căii de diferențiere a adipocitelor brune. În plus, demonstrăm că EPO a facilitat secreția de FGF21 în BAT, ceea ce contribuie la atenuarea homeostaziei glucozei. Aceste descoperiri susțin potențialul EPO ca agent terapeutic pentru obezitate și diabet.

Materiale și metode

Animale și proceduri experimentale

Parametrii plasmatici

Glicemia a fost determinată folosind un analizor compact de glucoză (Antsense II; Horiba, Kyoto, Japonia). Nivelurile de insulină plasmatică au fost măsurate cu un kit ELISA (Institutul de Științe Biologice Morinaga, Kanagawa, Japonia, Nr. Cat. M1104). Nivelurile trigliceridelor plasmatice (TG) și ale colesterolului total (T-Cho) au fost măsurate folosind reactivi de la Wako (Osaka, Japonia). Hematocritul a fost măsurat manual în fiecare săptămână după administrarea tratamentelor. Nivelurile de plasmă FGF21 au fost măsurate cu un kit ELISA (Mouse/Rat FGF-21 Quantikine ELISA Kit; R&D Systems, Minneapolis, MN, Nr. Cat. MF2100). Toate testele au fost efectuate conform instrucțiunilor producătorului.

Test de toleranță la glucoză

După tratamentul EPO sau cu soluție salină de control timp de patru săptămâni, șoarecii au fost postiti peste noapte și injectați intraperitoneal cu glucoză (1,0 g/kg greutate corporală). Nivelurile de glucoză din sânge și insulină aspirate din vena cozii au fost monitorizate la 0, 30, 60 și 120 de minute după această injecție de glucoză.

Consumul de oxigen

Consumul de oxigen (VO2) a fost analizat printr-un sistem de măsurare a metabolismului O2/CO2 (model MK-5000, Muromachi-Kikai, Tokyo, Japonia), care constă din două camere independente de 560 ml (pentru măsurarea simultană a două animale), o pompă de aspirație și un computer pentru analiza datelor. După patru săptămâni de tratament, șoarecii au fost așezați în camere la 23 ° C și lăsați să se aclimatizeze în mediu timp de mai mult de două ore. Pompa extrage aer dintr-una din camere timp de un minut la o rată de 650 ml/min pentru a măsura concentrația de O2 la fiecare trei minute. VO2 a fost calculat ca [Oa-Oc] vm −1 t −1, unde Oa este concentrația atmosferică de oxigen (%) care curge în cameră, Oc este concentrația de oxigen din cameră (%), v este debitul 650 ml/min), m este masa mouse-ului în kg, iar t este timpul în ore [31].

Temperatura interscapulară

Șoarecii au fost posti timp de 6 ore și apoi au fost anesteziați utilizând 30 mg/kg pentobarbital de sodiu, administrat i.p. Temperatura pielii din jurul iBAT a fost înregistrată cu o cameră cu imagini termice (FLIR i3, FLIR Systems, Tokyo, Japonia) și analizată cu software-ul FLIR QuickReport [31].

Activitatea locomotorie

Activitatea locomotorie a fiecărui șoarece a fost determinată folosind un Supermex (Muromachi Kikai, Tokyo, Japonia), după cum s-a descris anterior [32], timp de 24 de ore după patru săptămâni de experimentare. Pe scurt, mișcările fiecărui șoarece au fost determinate prin detectarea mișcării folosind radiații infraroșii. Activitatea a fost măsurată în unități în care un singur număr a constat în mișcarea unui animal dintr-o secțiune a zonei de măsurare, care a fost separată optic de mai multe lentile, către o secțiune vecină.

Histologie

Țesutul adipos alb subcutanat (sWAT), țesutul adipos alb epididimal (eWAT) și iBAT au fost fixate în 10% formalină tamponată. Secțiunile (5 μm) au fost colorate cu hematoxilină și eozină (H&E). Diapozitivele au fost examinate și fotomicrografiile au fost realizate folosind un microscop de fluorescență All-In-One BZ-X710 (Keyence, Osaka, Japonia) la o mărire de 40 ×. Dimensiunea medie a celulei și distribuția celulară a WAT ​​au fost determinate din 1600 adipocite ale fiecărui șoarece utilizând software-ul BZ Analyzer (Keyence). Numărul de nuclee din adipocite maro pe o zonă aleasă aleatoriu (320 μm × 270 μm) de la fiecare șoarece a fost numărat de software pentru a evalua acumularea de lipide în adipocite maro.

Cuantificări ARNm și microARN prin PCR cantitativă în timp real

Analiza Western blot

analize statistice

Toate datele sunt exprimate ca medie ± SEM. Testul t Student a fost utilizat pentru a compara mijloacele a două grupuri. S-au efectuat măsurători repetate ale analizei varianței (ANOVA) cu testele post hoc Tukey-Kramer pentru comparații multiple. Diferențele au fost considerate semnificative statistic la valori ale P mai mici de 0,05.

Rezultate

EPO a redus creșterea în greutate corporală, însoțită de reducerea țesutului adipos alb (WAT), rezistența la insulină ameliorată și intoleranța la glucoză la șoarecii obezi cu conținut ridicat de grăsimi

Greutatea corporală a șoarecilor hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi (HFD) (denumiți în continuare șoareci HFD-Con) a fost semnificativ mai mare la sfârșitul perioadei experimentale decât cea a șoarecilor hrăniți cu un chow normal (NC) (denumit în continuare Șoareci NC-Con). Greutatea corporală a șoarecilor hrăniți cu HFD și injectați cu eritropoietină (EPO) (șoareci HFD-EPO) a fost semnificativ mai mică decât cea a șoarecilor HFD-Con, chiar dacă nu a existat nicio diferență în aportul caloric sau activitatea locomotorie între cele două grupuri. Șoarecii hrăniți cu chow normal cu tratament EPO (șoareci NC-EPO) au prezentat o greutate corporală ușor, dar semnificativă, mai mică decât cea a șoarecilor NC-Con, în ciuda faptului că nu există nicio diferență în aportul de calorii alimentare între cele două grupuri (Tabelul 1, Fig. 1). WAT epididimal (eWAT) al șoarecilor HFD-EPO părea să fie mai mic decât cel al șoarecilor HFD (Fig. 2A). Masa eWAT și WAT subcutanat (sWAT) la șoarecii HFD-EPO a fost mai mică decât la șoarecii HFD-Con (Tabelul 1). Examenul histologic a relevat că diametrul mediu atât al adipocitelor albe subcutanate, cât și al epididimului alb la șoarecii HFD-Con a fost mai mare decât al ambelor adipocite la șoarecii NC-Con și NC-EPO. Modelele de distribuție ale celulelor mai mari către o dimensiune mai mică atât în ​​adipocitul alb subcutanat, cât și în cel epididimal au fost evidente și la șoarecii tratați cu EPO sub o dietă bogată în grăsimi (Fig. 2B și 2C).

(A) Schimbarea greutății corporale. (B) Consumul săptămânal de alimente. (C) Aportul total de alimente. (D) Activitatea locomotorie. Valorile sunt medii ± SE pentru 5-10 șoareci. a P aa P b P bb P c P cc P Fig 2. Efectul eritropoietinei (EPO) asupra țesutului adipos alb (WAT).

Histologia WAT ​​subcutanat (sWAT) și epididimal WAT (eWAT) au fost examinate prin colorare HE. (A) Imagini macroscopice ale eWAT la șoarecii hrăniți cu dietă normală de tip chow (NC-Con), șoarecii hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi singuri (HFD-Con) și la șoareci cu o dietă bogată în grăsimi plus EPO (HFD-EPO). Săgeata albă indică eWAT. (B) Histologie reprezentativă a șoarecilor NC-Con, HFD-Con și HFD-EPO la sWAT și eWAT. Bară de scară = 50 μm. (C) Distribuția perimetrelor adipocitelor în sWAT și eWAT au fost analizate pentru fiecare grup.

Nivelurile de glucoză din sânge au avut tendința de a fi mai mici la șoarecii HFD-EPO decât la șoarecii HFD-Con. Nivelul de insulină plasmatică nu a fost semnificativ diferit între cele patru grupuri. Indicele HOMA-IR, un indicator al rezistenței la insulină, a fost semnificativ mai mic la șoarecii HFD-EPO decât la șoarecii HFD-Con (Tabelul 1). Un test de toleranță la glucoză intraperitoneală (IPGTT) pentru a evalua toleranța la glucoză și sensibilitatea la insulină a arătat că nivelurile de glucoză din sânge la șoarecii HFD-EPO au fost în mod semnificativ mai mici decât cele ale șoarecilor HFD-Con după provocarea glucozei și nivelurile de glucoză din sânge în HFD- Șoarecii EPO au fost similari cu cei de la șoarecii NC-Con și NC-EPO (Fig. 3A). În timpul IPGTT, modificarea nivelurilor de insulină plasmatică nu a diferit între șoarecii HFD-Con și HFD-EPO (Fig. 3B).

Șoarecii în vârstă de patru săptămâni au fost tratați cu ser fiziologic sau cu EPO (200 U/kg) timp de patru săptămâni. Testele de toleranță la glucoză intra-peritoneală (IPGTT) (1 g/kg) au fost efectuate după post peste noapte. (A) și (B) prezintă nivelurile de glucoză din sânge și respectiv nivelurile de insulină. (C) arată săptămânal Ht. Valorile afișate sunt medii ± SE pentru 7-10 șoareci. a P aa P b P bb P c P cc P d P dd P Fig 4. Efectul eritropoietinei (EPO) asupra consumului de oxigen și BAT interscapulare.

(A) 22-h Consumul de oxigen. (B) Consumul de oxigen în fazele întunecate și luminoase. (C) Imagini termice cu infraroșu reprezentative ale șoarecilor cu dietă normală Chow (NC-Con), șoarecilor cu dietă normală Chow (NC-EPO), șoarecilor cu dietă bogată în grăsimi (HFD-Con) și șoarecilor cu dietă bogată în grăsimi (HFD-EPO) tratați cu EPO ). (D) Temperatura interscapulară a suprafeței. Valorile prezentate sunt medii ± SE pentru 8-9 șoareci. a P aa P b P bb P c P cc P Fig 5. Efectul eritropoietinei (EPO) asupra genelor legate de diferențiere în BAT interscapulară (iBAT).

Histologia iBAT a fost examinată prin colorare HE (Bară de scală = 50 μm). (A) Imagini macroscopice ale iBAT. (B) Histologie reprezentativă a iBAT la șoarecii cu dietă normală (NC-Con), șoarecii cu dietă bogată în grăsimi (HFD-Con) și șoarecii cu dietă bogată în grăsimi (HFD-EPO) tratați cu EPO. (C) S-a numărat numărul de celule/zonă din iBAT. (D) Experimente PCR în timp real. (E) Analiza Western blot. Valorile sunt medii ± SE pentru 4-8 șoareci. a P aa P b P bb P c P cc P Fig 6. Efectul eritropoietinei (EPO) asupra expresiilor PGC1α și UCP1 în BAT interscapulară (iBAT).

(A) Experimente PCR în timp real. (B) Analiza Western blot. (C) Unitate arbitrară înmulțită cu greutatea iBAT. Valorile indicate sunt medii ± SE pentru 4-8 șoareci. a P aa P b P bb P c P cc P Fig 7. Efectul eritropoietinei (EPO) pe axa EpoR/STAT3 în BAT interscapulară.

(A) Analiza Western blot. (B) Au fost calculate rapoartele pEpoR/EpoR și pSTAT3/STAT3. Valorile date sunt media ± SE pentru 6 șoareci. a P aa P b P bb P c P cc P Fig 8. Efectul eritropoietinei (EPO) asupra receptorului β-adrenergic/calea Mef2/miR-133 în BAT interscapulară.

(A) Experimente PCR în timp real. (B) Analiza Western blot. (C) Experimente PCR în timp real. (D) experimente de analiză microARN. Valorile date sunt medii ± SE pentru 4-8 șoareci. a P aa P b P bb P c P cc P Fig 9. Efectul eritropoietinei (EPO) asupra genelor legate de diferențiere, lipoliză și termogeneză în țesutul adipos alb (WAT).

(A) Experimente PCR în timp real în WAT subcutanat (sWAT). (B) Experimente PCR în timp real în WAT epididim (eWAT). Valorile date sunt medii ± SE pentru 4-8 șoareci. a P aa P b P bb P c P cc P Fig 10. Efectul eritropoietinei (EPO) asupra exprimării/secreției FGF21 în BAT interscapulară (iBAT) și a ficatului și a genelor legate de gluconeogeneză în ficat.