Yann Ravussin

1 Filiala Diabet, endocrinologie și obezitate, Institutul Național de Diabet și Boli Digestive și Rinice, Institutele Naționale de Sănătate, Bethesda, Maryland, Statele Unite ale Americii,

expunerii

Cuiying Xiao

1 Filiala Diabet, endocrinologie și obezitate, Institutul Național de Diabet și Boli Digestive și Rinice, Institutele Naționale de Sănătate, Bethesda, Maryland, Statele Unite ale Americii,

Oksana Gavrilova

2 Mouse Metabolism Core, Institutul Național de Diabet și Boli Digestive și Renale, Institutele Naționale de Sănătate, Bethesda, Maryland, Statele Unite ale Americii,

Marc L. Reitman

1 Filiala Diabet, endocrinologie și obezitate, Institutul Național de Diabet și Boli Digestive și Rinice, Institutele Naționale de Sănătate, Bethesda, Maryland, Statele Unite ale Americii,

Conceput și proiectat experimentele: YR OG MLR. Au efectuat experimentele: YR CX OG. Analiza datelor: YR CX OG MLR. A scris lucrarea: YR MLR.

Abstract

Introducere

Inspirați de efectele benefice ale exercițiilor fizice, un proces intrinsec intermitent, explorăm efectele expunerii intermitente la frig. Experimentele intermitente de expunere la frig au fost efectuate la rozătoare, dar multe dintre aceste experimente au evaluat modificările toleranței la frig, parametrii pierderii de căldură [16], [17] și comportamentului de hrănire, nu în mod specific dacă frigul ameliorează consecințele negative asupra stării obeze asupra sănătății. Nu se cunoaște dacă creșterea activării endogene a BAT prin stimuli de mediu (de exemplu, expunerea la frig) poate determina îmbunătățiri metabolice într-un model murin obez indus de dietă (DIO).

Modularea temperaturii ambiante pentru a afecta metabolismul este o idee atractivă care a câștigat recent tracțiune. S-a sugerat că temperaturile mai scăzute din spațiile de locuit ale oamenilor ar putea reduce greutatea corporală și ameliora comorbiditățile obezității [6] prin creșterea cantității și/sau a activității BAT. Scopul prezentului studiu a fost de a evalua efectele metabolice ale expunerii intermitente la frig la șoarecii DIO C57BL/6J.

Materiale și metode

Animale și dietă

Au fost achiziționați șoareci masculi PART C57BL/6J de paisprezece săptămâni care au fost hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi începând cu vârsta de 6 săptămâni (D12492, 60% kcal grăsime, 5,24 kcal metabolizabil/g; Research Diets, New Brunswick, NJ) au fost achiziționați de la Laboratorul Jackson (Bar Harbor, ME). La NIH, animalele au fost adăpostite individual la 22-24 ° C cu un ciclu de lumină întunecată de 12-12 ore (luminile aprinse la 0600h) într-o instalație convențională curată, în stilouri din plastic, cu așternut din așchii de lemn și acces ad-libitum la D12492 dietă și apă. Protocolul a fost aprobat de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor NIDDK.

Design de studiu

ICE # 1 și ICE # 2

După o perioadă de aclimatizare de 4 săptămâni, șoarecii au fost clasificați în funcție de greutate și distribuiți în trei grupuri (8 șoareci/grup) cu greutate corporală medie egală. În zilele de expunere la frig (luni, miercuri, vineri), s-au măsurat greutatea corporală și aportul de alimente și cuștile au fost transferate într-o cameră de 4 ° C pentru numărul indicat de ore (expunere intermitentă la rece: ICE). Șoarecii martori au fost mutați în mod similar într-o cameră nouă la 22 ° C timp de 1 oră (ICE # 1) sau 4 ore (ICE # 2). Compoziția corpului (masa grasă și masa fără grăsimi) a fost măsurată în funcție de domeniul Echo RMN 3-în-1 (Echo Medical Systems, Houston, TX) la fiecare 2 săptămâni dimineața devreme.

După o perioadă de aclimatizare de 4 săptămâni, șoarecii au fost clasificați în funcție de greutate și distribuiți în patru grupuri (6 șoareci/grup) cu greutate corporală medie egală. Două grupuri au fost expuse la 4 ° C timp de 4 ore de trei ori pe săptămână în timp ce 2 grupuri de control au fost tratate în mod similar la 22 ° C (control: CON). Șoarecii au fost tratați zilnic fie cu vehicul, fie cu AM251 (3 mg/kg în 5% DMSO/5% Tween 80 în soluție salină; Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) prin gavaj oral. Greutatea corporală și aportul de alimente au fost măsurate zilnic înainte de gavaj.

La sfârșitul studiilor, șoarecilor li s-a administrat ketamină (100 mg/kg) și xilazină (10 mg/kg) prin injecție ip, sângele a fost obținut prin sângerare retro-orbitală, iar țesuturile au fost îndepărtate, cântărite și congelate la -80 ° C până la testare.

Cheltuieli totale de energie

Cheltuiala medie totală de energie (TEE) a fost calculată utilizând tehnica echilibrului energetic (aportul caloric minus schimbarea în depozitele de energie corporală) [18]. Pe scurt, echivalenții calorici ai compoziției corpului (masa grasă, 9,4 kcal/g; masa fără grăsimi, 1,0 kcal/g) sunt folosite pentru a corecta modificările compoziției corpului. Creșterea conținutului de kcal corporal este scăzută din aportul total de energie metabolizabilă, rezultând TEE, care este împărțit la durata experimentului (ICE # 1 - 77 zile; ICE # 2 - 74 zile; ICE # 3 - 28 zile) pentru a da media TEE zilnică.

> Tratamentul CL316243

> CL316243, a fost utilizat un agonist β3-adrenoceptor selectiv pentru a stimula maxim termogeneza facultativă în timpul calorimetriei indirecte [19]. Aceste experimente au fost efectuate la termoneutralitate (30 ° C) pentru a elimina activarea endogenă a BAT. Șoarecii au fost plasați într-un CLAMS controlat de mediu cu 12 camere (Columbus Instruments, Columbus, OH) dimineața devreme (0645h), aclimatizați timp de aproximativ 4 ore, tratați cu> CL316243 (100 µg/kg în soluție salină, ip) și energie cheltuielile au fost măsurate pentru încă 5 ore. Șoarecii au avut acces ad libitum la alimente și apă pe întreaga perioadă de testare.

Test de toleranță intra-peritoneală la glucoză (ipGTT)

Șoarecii au fost postiti peste noapte, glucoza (1 g/kg greutate corporală, ip) injectată la 0900h, iar glicemia din coadă măsurată (Glucometer Contour, Bayer, Mishawaka, IN) la 0, 15, 30, 60 și 120 minute după injectare . IPGTT a fost efectuat într-o zi după expunerea la frig în ICE # 1 și ICE # 3 și la două zile după expunerea la frig în ICE # 2 pentru a testa durata efectelor expunerii la frig. În ICE # 2, concentrațiile de insulină au fost, de asemenea, determinate la 0, 15 și 120 de minute de RIA (Millipore, St. Charles, MO).

Test de toleranță la insulină (ITT)

Șoarecii fără post au fost injectați cu 0,75 U/kg de insulină în greutate corporală (Humulin, Eli Lilly, Indianapolis, IN) la ora 09:00. Concentrațiile de glucoză din sânge au fost măsurate la 0, 15, 30, 45, 60 și 120 de minute după injectare.

Absorbția glucozei

În ICE # 1, absorbția in vivo a glucozei a fost măsurată prin injecția ip de [1-14 C] 2-deoxiglucoză (10 uCi, Perkin Elmer, Boston MA) cu o oră înainte de terminarea șoarecilor. Șoarecii au fost injectați la inițierea expunerii la frig în grupul de 1 oră și la 3 ore după începerea expunerii la frig în grupul de 4 ore. La șaizeci de minute după injecție, doi mușchi (cvadriceps și gastrocnemius), două tampoane de grăsime (inghinale și epididimale), BAT interscapulară și splina au fost îndepărtate, cântărite, omogenizate și [14 C] 2-deoxiglucoză 6-fosfatul a fost extras folosind Coloane de cromatografie preumplute Poly-Prep (Bio-Rad Laboratories, Cat: 731-6211, Hercules, CA) și cuantificate folosind Beckman Liquid Scintillation Counter [20].

Profilul hormonului seric și al metaboliților

Sângele provenit de la sângerarea retro-orbitală a fost introdus în tuburile de separare a serului Microtainer BD (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ), a fost lăsat să se coaguleze timp de 10 minute la temperatura camerei, s-a rotit la 10.000 rpm timp de 6 minute, iar serul a fost înghețat până analizat. Acizi grași liberi (Roche Diagnostics Gmbh, Mannheim, Germania), trigliceride (Pointe Scientific Inc., Canton, MI), colesterol (Thermo Scientific, Middletown, VA), β-hidroxibutirat (BioVision, Milpitas, CA) și D-lactat (BioVision, Milpitas, CA) au fost măsurate prin teste colorimetrice. Glucoza serică a fost măsurată cu Glucometer Contour. Insulină (Millipore, St. Charles, MO), adiponectină (Millipore, St. Charles, MO), factor de creștere asemănător insulinei 1 (ALPCO, Salem, NH), T3 (DiaSorin Inc, Stillwater, MN) și T4 (DiaSorin Inc, Stillwater, MN) au fost măsurate de RIA. Leptina (R&D Systems, Minneapolis, MN) și factorul de creștere a fibroblastilor 21 (Millipore, St. Charles, MO) au fost măsurate prin ELISA. Toate testele au fost efectuate conform protocolului producătorului.

Analize de expresie genică

ARN a fost extras (Qiagen RNeasy Plus Mini Kit, Germantown, MD), convertit în ADNc (Roche Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit, Indianapolis, IN) și cuantificat prin reacție în lanț în timp real a polimerazei (qRT-PCR, Applied Biosystems 7900HT, Foster City, CA). Au fost utilizate atât sistemele de sonde de grund SYBR pe bază de verde, cât și cele de taqman.

Analize statistice

Datele sunt exprimate ca medie de grup ± SE. Analizele statistice au fost efectuate folosind JMP (versiunea 9; SAS, Carolina de Nord). Pentru ICE # 1 și ICE # 2, ANOVA unidirecționale au fost efectuate folosind grupul de șoareci ca variabile independente (CON, 1 h, 4 h pentru ICE # 1 și CON, 4 h, 8 h pentru ICE # 2). Pentru ICE # 3, ANOVA bidirecționale au folosit expunerea la frig (ICE sau CON) și tratamentul medicamentos (AM sau VEH) ca variabile de grupare. Pentru rezultate semnificative ANOVA, s-a efectuat un test post-hoc Tukey HSD pentru a compara între grupuri. Semnificația statistică a fost definită prospectiv ca P Figura 1A ). Cu toate acestea, greutatea corporală nu a fost afectată de expunerea intermitentă la frig ( Figura 1B ). În mod similar, nu s-au observat diferențe consistente în masa grasă, masa fără grăsimi, WAT inghinală, WAT epididimală, BAT interscapulară sau greutățile hepatice ( Tabelele 1 , 2 ). TEE pe parcursul a ∼10 săptămâni a fost calculat din aportul caloric corectat pentru modificări ale compoziției corpului [18]. Expunerea la rece de 1 și 4 ore a crescut TEE cu 4,5% și respectiv 7,2% (ICE # 1; tabelul 1 ) și 4 și 8 ore au crescut-o cu 7,6% și 12,2% (ICE # 2; masa 2 ). Presupunând că toată creșterea ratei metabolice are loc în timpul expunerii la frig, aceste date indică o dublare aproximativă a ratei metabolice în timpul provocării la rece. Luate împreună, aceste date demonstrează că dozele modeste de expunere intermitentă la frig nu modifică greutatea corporală sau adipozitatea, deoarece creșterea consumului de alimente compensează pe deplin creșterile induse de frig ale cheltuielilor de energie.