Dr. Mohammad Reza Alipour

visfatină

Centrul de cercetare a tuberculozei și a bolilor pulmonare

Universitatea de Științe Medicale din Tabriz

Trimiteți un e-mail [email protected] sau [email protected]

Articole similare pentru „”

  • Facebook
  • Stare de nervozitate
  • LinkedIn
  • E-mail

Abstract

Semnificația studiului

• Studiul de față a arătat că nivelurile de expresie ale ARNm factorului nuclear-κB (NF-κB) și visfatinei în țesutul traheei au fost semnificativ mai mari la șobolanii sensibilizați la ovalbumină (OVA) obezitate indusă de dietă, comparativ cu șobolanii cu dietă normală sensibilizați la OVA. La fel de importantă, s-a observat o corelație pozitivă semnificativă între expresia ARNm NF-κB și modificările de greutate, precum și ARNm visfatină. Aceste descoperiri indică o cale alternativă de semnalizare în obezitate asociată cu modelul animal sensibilizat la OVA și ar putea fi responsabile de nivelurile de expresie modificate ale adipokinelor și în special de rolul visfatinei și NF-κB în țesutul traheal.

Introducere

Prevalența astmului și obezității a crescut în ultimii ani și numeroase studii clinice au indicat o asociere semnificativă între obezitate și astm [1]. Important, la persoanele supraponderale și obeze, studiile au arătat un răspuns scăzut la corticosteroizii inhalatori [2] sau β-agoniștii cu acțiune îndelungată [3], care sunt medicamentele utilizate în mod obișnuit pentru tratarea astmului. Mecanismul (mecanismele) de bază pentru această legătură nu este clar, deși o serie de studii au explorat unele ipoteze, inclusiv inflamația, factorii mecanici și factorii genetici comuni [1,4].

Materiale și metode

Animale și diete

Douăzeci de șobolani masculi Wistar (în vârstă de 8 săptămâni, cântărind aproximativ 160 g) au fost obținuți de la Animal House, Universitatea de Științe Medicale din Tabriz, Tabriz, Iran. Toți șobolanii au fost așezați în cuști (n = 5 pe cușcă) în condiții controlate de 22 ° C și un ciclu de lumină-întuneric de 12 până la 12 ore. Hrana și apa au fost furnizate ad libitum pe parcursul perioadei de aclimatizare și experimentale.

După o săptămână de aclimatizare, toți șobolanii au fost împărțiți în mod aleatoriu în 4 grupuri (n = 5 în fiecare grup), care a inclus un grup de control alimentat cu o dietă normală (ND), un grup sensibilizat la OVA cu dietă normală (S + ND), un grup de dietă bogată în grăsimi (obezitate indusă de dietă HFD) și un OVA -sensibilizat cu grupa dietă bogată în grăsimi (S + HFD). Dieta bogată în grăsimi urma să inducă obezitatea așa cum s-a descris anterior [15]. Pe scurt, dieta bogată în grăsimi a fost grasă: 42% energie; proteine: 19%; și carbohidrați: 39% dat HFD și S + HFD în timp ce șobolanii ND și S + ND au fost hrăniți cu șobolan standard (grăsimi: 11%; proteine: 28%; și carbohidrați: 61%) (Behparvar Feed Manufacturing Co., Iran).

După 8 săptămâni, sensibilizarea animalelor cu OVA în grupurile S + ND și S + HFD a fost efectuată cu protocolul anterior [16] și a durat 4 săptămâni.

Sensibilizarea animalelor

Pe scurt, 1 mg OVA și 200 mg hidroxid de aluminiu (Sigma) au fost injectate intraperitoneal în zilele 1 și 8. Din ziua 14, animalele au fost plasate într-o cameră închisă (dimensiuni: 30 × 20 × 20 cm) expuse particulelor de aerosoli de 4 % OVA pentru 17-19 zile, 15 min zilnic, folosind un nebulizator (CX3, Omron Health Care Europe BV, Olanda). Șobolanii din grupurile ND și HFD au fost tratați în mod similar cu soluție salină în loc de soluție OVA. Șobolanii sunt ușor sensibilizați folosind OVA și prezintă răspunsuri de sensibilizare imediată și tardivă după o provocare cu alergeni [17]. Studiul a fost aprobat de Comitetul Etic al Universității de Științe Medicale din Tabriz.

Greutate corporala

Animalele au fost cântărite săptămânal la aproximativ 16:00 în timpul experimentului. Toți șobolanii au fost anesteziați și cântăriți și s-a măsurat distanța dintre nasul și anusul șobolanului (lungimea nazală). Greutatea corporală finală, indicele Lee și procentul de grăsime corporală (BF%) au fost, de asemenea, determinate pentru a calcula indicii obezității utilizați la rozătoare [18]. Pe scurt, următoarele formule au fost utilizate pentru a calcula toți indicii obezității [18]:

1. Procentul de modificări ale greutății corporale (%) = (Greutate finală - greutate inițială/greutate inițială) × 100

2. Indicele Lee (mg/mm) = Greutatea finală 0,33/lungimea nazo-anală.

3. Procentul de grăsime corporală (%) = 0,69 (indicele Lee - 274,8).

Pregătirea țesuturilor

Șobolanii au fost anesteziați cu o injecție intraperitoneală de ketamină (50 mg/kg) și xilazină (5 mg/kg); piepturile și gâturile au fost deschise și aproximativ 2 cm din trahee au fost izolate. Traheea a fost împărțită în mai multe segmente de 5 mm (5-6 cartilaje inelare) care au fost așezate imediat între 2 cârlige orizontale din oțel inoxidabil suspendate într-o baie de organe de 20 ml (Schuler Organ Bath Type 809; March-Hugstetten, Germania) conținând Soluție Krebs-Henseleit. Tensiunea inițială a fost de 1 g pe tot parcursul experimentului și perioada de echilibru a fost de 60 min, în care soluția de baie a fost înlocuită la fiecare 15 minute. Răspunsurile de contractilitate au fost măsurate folosind senzor de tip vernier de control 850N (interval de sensibilitate: 0-20 g și rezoluție: 0,2 mm/turație [Hugo-Sachs Elektronik, Germania]) și amplificat cu un amplificator (amplificator de punte ML/118 quad, March- Hugstetten, Germania) și înregistrat pe power lab (ML-750,4channel recorder, March-Hugstetten, Germania).

Evaluarea răspunsului traheal la metacolină

S-a măsurat răspunsul la contractilitate la 1 m M clorhidrat de metacolină (Sigma Chemical Ltd., Marea Britanie), pe măsură ce mărimea contracției a fost măsurată. La sfârșitul experimentelor, țesutul a fost cântărit și apoi forța de contracție a fost indusă de metacolină (la nivelul platoului) a fost calculată pentru a exprima ca g forță/mg greutate țesut (gF/TW) pentru compararea activității spasmogene a acestor spasmogeni între grupuri.

Măsurători biochimice

După ce șobolanii au fost anesteziați cu ketamină și xilazină, probele de sânge (3-5 ml per șobolan) au fost extrase din inima șobolanilor de post în tuburi EDTA. Concentrațiile plasmatice ale colesterolului total (TC), ale trigliceridelor (TG) și ale concentrațiilor de lipoproteine-colesterol (HDL-C) de înaltă densitate au fost măsurate folosind un analizor automat de sânge (Bayer Corp., SUA). Kituri TG, TC și HDL-C au fost obținute de la Pars Azmoon Co., Iran. Lipoproteina-colesterol cu ​​densitate scăzută (LDL-C) a fost evaluată utilizând formula Friedewald: LDL-C = TC - (HDL-C + TG/5) [19].

Prelevarea de țesuturi și măsurarea proteinelor

După extragerea probelor de sânge, șobolanii au fost sacrificați. Apoi, țesuturile traheale au fost îndepărtate și, după înghețarea rapidă cu azot, toate țesuturile au fost depozitate la temperatura de -70 ° C până la măsurarea NF-κB.

Probele de țesut au fost cântărite, conținutul celular a fost extras cu omogenitorul (Potter S, Germania) în PBS (pH 7,2-7,4) și au fost centrifugate timp de 20 min la viteza de 3.000 rpm la 4 ° C. Apoi, supernatanții au fost îndepărtați și moleculele NF-κB (antigene) au fost detectate prin metoda ELISA. Testele ELISA au fost efectuate folosind kituri ELISA comerciale (Hangzhou Eastbiopharm Co., Ltd., catalog: BYEK 1184). Absorbția a fost determinată cu cititorul de absorbanță a microplăcii la 450 nm. Limita inferioară de detecție a fost de 2 pg/ml pentru visfatină (coeficienți de variație; intra-test: 10%, inter-test: 12%).

Reacție în lanț în timp real a polimerazei

Conținutul și puritatea ARN au fost măsurate folosind un spectrofotometru Nanodrop 1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, SUA). Pentru determinarea nivelurilor de expresie a ARNm-ului NF-κB și a visfatinei, trusa de sinteză a ADN-ului prim-catenar Revert Aid (Fermentas GmbH, Leon-Rot, Germania) cu ajutorul primerilor hexamerici aleatori și a transcriptazei inverse MMLV (ca sistem complet pentru sinteza eficientă de ADNc din prima catenă din ARNm sau șabloane de ARN total) a fost utilizat.

Cu SYBR Green Master Mix (Exiqon), fiecare ADNc a fost utilizat ca șablon pentru teste separate pentru mRNA cantitativ în timp real PCR. Seturile de amorseri de acid nucleic blocat înainte și invers (Exiqon) pentru ARNm includ: NF-κB1 (sens: 5′-AATTGCCCCGGCAT-3 ′ și antisens: 3′-TCCCGTAACCGCGTA-5 ′ [XM_342346.4]), visfatină (sens: 5′-CCTCTTGAATTGCTCCTTCA-3 ′ și antisens: 5′-CCGTATGGAGAAGATCATGG-3 ′ [NM_177928]) și β-glucuronidază (sens: 5′-GGCTCGGGGCACAATT-3 ′ și antisens: 3′G-15GCG15). Reacțiile PCR în timp real au fost efectuate pe un instrument Rotor-Gene 6000 (Corbett Life Science, Australia).

Produsele PCR au fost normalizate cu gene β-glucuronidază pentru probe de ARNm. Metoda 2 - (ΔΔ Ct) a fost utilizată pentru a determina nivelurile cantitative relative de ARNm de NF-κB și de visfatină. Rezultatele au fost exprimate ca schimbare de ori față de controalele relevante [20].

Analize statistice

Toate rezultatele au fost date în medie ± SD. Datele au fost comparate între diferite grupuri utilizând o analiză unidirecțională a varianței cu un test post hoc Tukey-Kramer. p valori M metacolină) în grupuri experimentale. ND, control cu ​​dieta normală; S + ND, sensibilizat la ovalbumină cu dietă normală; HFD, grup cu diete bogate în grăsimi; S + HFD, sensibilizat la ovalbumină cu dietă bogată în grăsimi. Diferențe statistice între ND și alte grupuri: * p + p ++ p +++ p ### p + p +++ p ## p ### p