Dijun Wu

1 Departamentul de Radioterapie, Nantong First People’s Hospital, Nantong, Jiangsu 226000, China,

expresia

Ning Ji

1 Departamentul de Radioterapie, Nantong First People’s Hospital, Nantong, Jiangsu 226000, China,

Lei Zhang

1 Departamentul de Radioterapie, Nantong First People’s Hospital, Nantong, Jiangsu 226000, China,

Liang Zhang

2 Departamentul de Oncologie, Nantong First People’s Hospital, Nantong, Jiangsu 226000, China,

Abstract

Cancerul de sân a devenit cele mai populare tumori maligne la femei. Celulele stem ale cancerului de sân (BCSC) joacă un rol important în metastază și recurență. Studiul anterior a arătat o strânsă corelație între miR-200c și reglarea comportamentală a celulelor stem ale cancerului mamar. Acest studiu a avut ca scop investigarea expresiei diferențiale a miR-200c în celulele stem ale cancerului de sân și rolul său în reglarea proprietății formării tumorii. Testul microcipului ADN și qRT-PCR au analizat expresia diferențială a microARN-ului între BCSC și formarea non-tumorală a celulelor NTG. Testul genei raportor de bioinformatică și luciferază a determinat locul vizat al miR-200c. Imitatorul și inhibitorul MiR au fost transfectați pentru a modifica nivelul de expresie miR-200c, urmat de Western Blot pentru detectarea expresiei genei BMI1. Testul clonal celular a determinat proliferarea celulară, în timp ce xenogrefa tumorală a fost efectuată pentru a analiza potența formării tumorii. MiR-200c a fost reglementat în jos în BCSC comparativ cu celulele NTG (P Cuvinte cheie: Celule stem de cancer mamar, MicroRNA-200c, proliferarea celulelor, formarea tumorii

Introducere

Statisticile au arătat cancerul de sân ca fiind cele mai populare tumori maligne specifice femeilor și ocupă aproximativ 29% din toate cazurile de cancer feminin [1]. Chirurgia este în continuare strategia majoră de tratament, pe lângă chimioterapie și înlocuirea hormonilor, chimioterapia fiind abordarea majoră [2]. Reactivii obișnuiți de chimioterapie, inclusiv docetaxel și adriamicină, duc frecvent la rezistența la medicamente, ceea ce compromite grav eficacitatea tratamentului și crește sarcina pacientului [3,4]. Prin urmare, studiul mecanismului care stă la baza rezistenței medicamentoase la cancerul de sân are o importanță critică pentru îmbunătățirea eficacității tratamentului și scăderea sarcinii pacientului.

Celulele stem tumorale sunt un anumit subtip de celule din tumorile solide, cu potență de auto-reînnoire care determină eterogenitatea tumorilor [5]. Celulele stem tumorale au mai multe caracteristici similare cu cele ale celulelor stem normale. Studiile au arătat rolul important al celulelor stem tumorale în patologia multiplă și comportamentele celulare ale tumorilor maligne [6]. Auto-reînnoirea și potența de proliferare rapidă a celulelor stem tumorale sunt critice pentru întreținerea și reapariția tumorii. Între timp, mai multe mecanisme în interiorul celulelor stem tumorale sunt strâns corelate cu rezistența la medicamente după tratamentul de rutină al tumorii [7,8]. Prin urmare, studiul reglării comportamentale a celulelor stem tumorale maligne și mecanismul aferent sunt de o importanță critică pentru identificarea tratamentului eficient împotriva tumorilor maligne, inclusiv a cancerului de sân.

MiR-200c aparține familiei de microARN. Studiul anterior a arătat că microARN ar putea afecta comportamentele celulare multiple prin intermediul mecanismului de interferență ARN [9]. Analizând profilul expresional al microARN al celulelor tumorale maligne, s-a constatat că joacă un rol important în reglarea comportamentelor celulelor tumorale maligne [10]. Recent, un studiu a arătat roluri importante ale microARN-ului în reglarea celulelor tumorale maligne, deoarece miR-200c și miR-222 au avut niveluri de expresie anormale în liniile celulare ale cancerului de sân cu rezistență la medicamente [11,12]. Acest studiu a avut ca scop investigarea expresiei diferențiale a miR-200c în celulele stem ale cancerului de sân (BCSC) și mecanismul conex.

Materiale și metode

Materiale

BCSC și celule NTG cu formare non-tumorală celulă NTG, plus celule HEK293 au fost achiziționate de la Academia Medicală Chineză. Mediul de cultură DMEM, penicilina și streptomicina au fost achiziționate de la Gibco (SUA). Trusa de extracție ARN a fost achiziționată de la Qiagen (SUA). Un mediu DMEM îmbunătățit a fost achiziționat de la Invitrogen (SUA). Scanerul de microcip model GCS3000 și matricea de testare miRNA4.0 au fost achiziționate de la Affymetrix (SUA). Trusele de testare miVNA qRT-PCR MirVanat au fost achiziționate de la Ambion (SUA). PCR în timp real a fost achiziționat de la Bio-Rad (SUA).

Analiza profilului culturii celulare și a expresiei miARN

BCSC au fost cultivate în mediu de cultură îmbunătățit DMEM conținând 15% FBS. Celulele NTG și HEK293 au fost cultivate în mediu de cultură dual-rezistent conținând 10% FBS. Celulele au fost cultivate la 37 ° C cu 5% CO2.

BCSC și celulele HEK283 au fost colectate și cultivate. Trusa de extracție a ARN-ului a fost utilizată pentru a colecta ARN-ul total. Trusa de test FlashTagBiotinHSR (Affymetrix) a fost utilizată pentru adăugarea etichetei de coadă și a etichetei biotinei pe miARN de ARN eșantion. MiRNA4.0 microarray a fost utilizat pentru reacție după spălare și clătire. Datele colectate au fost analizate prin software-ul ExpressionConsole pentru obținerea valorilor medii și a deviației standard (SD).

qRT-PCR

Primerii qRT-PCR au fost proiectați mai întâi pe baza secvenței miR-200c (numărul de acces GeneBank,> NR_029779) așa cum se arată în Tabelul 1. Folosind ARN total extras din celulele HEK293 ca control, qRT-PCR a fost utilizat pentru a testa nivelul de expresie miR-200c în celulele HTB-106. Pentru testul qRT-PCR a fost utilizat kitul de testare miRNA MirVanat qRT-PCR. Software-ul încorporat al instrumentului (versiunea 2.02) a fost utilizat pentru analiza nivelului de expresie prin metoda 2 -ΔΔCt folosind secvența U6 ca control intern [13].

tabelul 1

Secvențe de primer qRT-PCR

NumeSecvență
miR-200-F5’-GGTTCTTCCCTGGGCTTC-3 ’
miR-200-R5’-GAGTAGGAGCTCCGGATGTG-3 ’
U6-F5’CTCGCTTCGGCAGCACA3 ’
U6-R5’AACGCTTCACGAATTTGCGT3 ’

Predicția funcțională a miR-200c

TargetScan Release 5.1 (www.Targetscan.org) a fost folosit pentru a prezice gena funcțională vizată a miR-200c. Testul genei reporter al luciferazei a fost utilizat pentru a demonstra posibile ținte ale miR-200c. Pe baza secvențelor 3’UTR ale IMC1 (număr de acces Genebank,> NM_005180), primerii au fost sintetizați ca 5’-TATATC TAGAT TCTTG TTATT ACGCTG TTTTG-3 ’și 5’-AGATT CTAGA ATGTCA TATACC AATATG GC-3’. Secvența 3-UTR de ARNm BMI1 a fost obținută prin amplificare PCR, urmată de inserarea în situsul din aval al regiunii de codificare a genei luciferazei a plasmidei pmiRGLO pentru a construi plasmida pmirGLO-BMI1 și pmirGLO. Acele celule cu transfecție reușită au fost transfectate cu miR-200c mimică pentru a ridica nivelul miR-200c așa cum este descris mai jos. La 48 de ore după transfecție, celulele au fost analizate pentru intensitate fluorescentă. Pentru analiza intensității fluorescente au fost folosite sistemul dual de testare a genei reporterului luciferazei (Promega) și spectrometria MicroLumatPlus LB96V (Berthold).

Transfecția miR-200c

Secvența mimică sau inhibitoare MiR-200c a fost transfectată în BCSC pentru a ridica sau suprima nivelul de expresie miR-200c. Secvența mimică și inhibitor MiR-200c au fost achiziționate de la Gimma (China). Pentru transfecția celulară a fost utilizat kitul de transfecție pentru lipozomi INTERFERinTM (transfecția Polyplus). După cultură, digestie, celulele au fost numărate și inoculate în placă cu 96 de godeuri pentru incubare de 24 de ore. Transfecția a fost efectuată conform instrucțiunilor manuale ale kitului de testare.

Analiza Western blot

BCSC cu transfecție reușită au fost colectate și lizate pentru extragerea proteinelor totale, care au fost testate pentru exprimarea IMC1 în celule prin Western Blot. S-au utilizat anticorp primar (anticorp BMI1 anti-om de șoarece la 1: 1000 sau β-actină anti-umană la 1: 1000) și anticorp secundar (IgG anti-capră la șoarece la 1: 200). Rezultatele Western Blot au fost analizate de un sistem de imagistică cu gel asistat de computer pentru a calcula expresia SMI pe diferite linii celulare.

Testul formării clonei celulare

Linia celulară BCSC cu transfecție reușită a fost cultivată până la faza de creștere a logului. Celulele au fost digerate în tripsină și resuspendate în mediu de cultură proaspăt. Celulele au fost apoi inoculate în 10 ml mediu proaspăt la o concentrație de 100 celule în triplicate. Celulele au fost incubate timp de 10 zile. După aceea, mediul de cultură a fost îndepărtat și celulele au fost fixate în paraformaldehidă pentru colorare în violet de cristal. Tamponul de colorare a fost îndepărtat și clonele au fost numărate pe vasul de cultură inversat cu peliculă plasată pentru a calcula rata de formare clonală = (numărul clonei/100) × 100%.

Xenogrefă pentru celulele cancerului de sân uman

Testul xenogrefei celulelor canceroase de sân a fost efectuat pentru a testa efectul miR-200c asupra potenței formării tumorilor BCSC. Acele celule cu transfecție reușită au fost cultivate la 37 ° C timp de 2 ore și au fost resuspendate pentru numărare. Folosind șoareci NOD/SCID ca obiecte de cercetare, 12 șoareci adulți (vârsta de 6 săptămâni, greutatea corporală la 32,6 ± 2,5 g, 6 bărbați și 6 femele) au fost repartizați aleatoriu în trei grupuri. Fiecare șoarece a primit 105 celule și a fost hrănit cu o dietă normală. Animalele au fost cultivate la 25 ° C cu 60 ± 10%. Protocoalele animale au urmat liniile directoare ale experimentelor pe animale stipulate de NIH.

analize statistice

Fiind cea mai frecventă tumoare malignă specifică femeilor, cancerul de sân amenință grav sănătatea femeilor [1]. Recurența, metastazele și rezistența la medicamente a cancerului de sân depind în principal de BCSC. Prin urmare, inhibarea BCSC este de o importanță critică pentru tratarea cancerului de sân. Acest studiu a găsit expresia miR-200c suprimată în mod semnificativ în BCSC, care poate regla expresia genei BMI1 prin suprimarea expresiei miR-200c, facilitând astfel capacitatea de proliferare și formare a tumorilor BCSC. Această concluzie poate oferi perspective noi pentru tratamentul viitor al cancerului de sân. Prin abordarea biologiei moleculare, se poate ridica expresia miR-200c în BCSC, inhibând astfel recurența și metastaza cancerului mamar.

Concluzie

MiR-200c este reglat în jos în BCSC, ridicând astfel nivelul de expresie al genei țintă IMC1 și sporind proliferarea și potența formării tumorilor BCSC.

Mulțumiri

Cercetări susținute de Fundația Națională pentru Științe Naturale din China (# 81895576).