Contribuție de Seymour Benzer

prin

Abstract

Raportăm că hrănirea Drosophila pe tot parcursul maturității cu 4-fenilbutirat (PBA) poate crește semnificativ durata de viață, fără a diminua vigoarea locomotorie, rezistența la stres sau capacitatea de reproducere. Tratamentul pentru o perioadă limitată, fie devreme, fie târziu în viața adultă, este, de asemenea, eficient. Muștele hrănite cu PBA arată o creștere globală a acetilării histonelor, precum și un model dramatic modificat de exprimare a genelor, inclusiv inducerea sau reprimarea a numeroase gene. Întârzierea îmbătrânirii poate rezulta din starea fiziologică modificată.

Îmbătrânirea este un fenomen biologic comun împărtășit de animale și plante (1), dar înțelegerea noastră de ce și cum îmbătrânim rămâne limitată. Ar fi de mare interes biologic și de importanță practică dacă am putea obține o perspectivă asupra bazei moleculare a îmbătrânirii, să învățăm să întârzie procesul de îmbătrânire și să menținem vigoarea tinerilor.

Studii recente arată că longevitatea poate fi modificată prin manipulări genetice la diferite organisme. Mutațiile de vârstă-1 (2), daf-2 (3, 4) și clk-1 (5) în Caenorhabditis elegans cresc longevitatea viermelui. În drojdie, genele Sir extind durata de viață a celulei mamă în devenire (6). Durata de viață a drosofilei este crescută de mutații ale unui receptor cuplat cu proteina G din Metuselah (7), un cotransportor de dicarboxilat de sodiu în Indy (8), un substrat al receptorului de insulină în chico (9) sau un receptor asemănător insulinei în InR (10) . Studiile cu Drosophila prin metode transgenice au fost recent revizuite (11). Evident, este de mare interes să descoperiți medicamente care pot prelungi durata de viață printr-o simplă hrănire. S-a demonstrat că mimeticele superoxidului dismutază și catalazei prelungesc durata de viață în C. elegans (12). În timp ce studiem mecanismul acțiunii medicamentului asupra mutanților neurodegenerativi (13), am descoperit că 4-fenilbutiratul de sodiu (PBA) poate crește atât durata mediană, cât și durata maximă de viață a Drosophila.

Prezentăm mai jos constatarea extinderii duratei de viață în Drosophila prin hrănirea PBA, împreună cu date despre modificările în acetilarea histonei și spectrul genelor induse și suprimate de PBA.

Materiale și metode

Tulpini de muște și fenilbutirat.

Au fost utilizate tulpinile Drosophila w 1118 și Canton-S de tip sălbatic. Acidul PBA, sarea de sodiu, a fost un dar generos de la Joseph Cooper din Medicis, Scottsdale, AZ. Puritatea substanței chimice a fost raportată a fi de 99,6%.

Determinarea duratei de viață.

Muștele nou închise au fost colectate și crescute în mediu agar de porumb standard (28). Pentru fiecare experiment, 10 flacoane, fiecare conținând 20 de muște, au fost menținute fie la 29 ° C, fie la 25 ° C și au fost transferate în flacoane proaspete la fiecare 3 zile. Numărul muștelor moarte a fost numărat în fiecare zi.

Hibridizarea membranei.

Kitul inteligent de sinteză ADNc PCR (CLONTECH) a fost utilizat pentru sintetizarea sondelor pentru hibridizare. ARN-ul total a fost preparat din muște hrănite timp de 10 zile la 29 ° C cu mediu conținând 10 mM PBA sau cu mediu simplu. După sinteza catenelor de ADNc de către Maloney Murine Leucemia Murine (MMLV) -verscriptază inversă, ADNc a fost amplificat prin PCR, reacția constând din 95 ° C timp de 1 min, urmată de 24 de cicluri de 15 secunde la 95 ° C, 30 de secunde la 65 ° C și 6 min la 68 ° C. Probele au fost preparate printr-o metodă de etichetare a ADN-ului cu amorsare aleatorie cu [α- 32 P] dCTP. Filtrele conținând 7.500 de clone unice Drosophila EST (Research Genetics, Huntsville, AL) au fost prehibridizate timp de 4 ore, apoi s-au adăugat sonde pentru a hibridiza timp de 16 ore la 58 ° C într-un tampon conținând 1 M NaCl, 0,05 M Tris (pH 8,0), EDTA 5 mM, 1% SDS și 10% sulfat de dextran. După hibridizare, filtrele au fost spălate de mai multe ori și expuse la film cu raze X pentru a identifica genele care au fost induse sau reprimate de PBA.

Revers-Northern Blots.

Pentru modificări cantitative în abundența transcrierilor individuale, 00500 perechi de baze ale fiecărei gene candidate au fost sintetizate prin PCR și 100 ng au fost montate pe o membrană de transfer din nylon (hybond-N +, Amersham Pharmacia). Muștele adulte nou apărute au fost hrănite cu alimente standard cu muște care conțin 10 mM PBA, sau alimente simple, timp de 10 zile la 29 ° C. ARN Messenger a fost extras și utilizat pentru a sintetiza ADNc prin MMLV-transcriptază inversă, iar sondele au fost preparate prin amorsare aleatorie și [α- 32 P] dCTP. Membrana de nylon care conține gene candidate a fost hibridizată cu sonda preparată din muștele martor și expusă la un ecran PhosphorImager (Molecular Dynamics). După expunere, sonda a fost dezlipită în 10 mM EDTA/0,1% SDS la 80 ° C și expusă la un ecran PhosphorImager timp de 18 ore, pentru a confirma că nu a rămas nicio sondă reziduală. Membrana a fost apoi hibridizată din nou cu a doua sondă, preparată din muște hrănite cu PBA. Nivelul de expresie al fiecărei gene a fost cuantificat utilizând programul IMAGE QUANT (Molecular Dynamics).

Western Bloting of Histones.

Loturi de 100 de muște au fost folosite pentru a prepara histone (29). Omogenatele muștelor întregi au fost centrifugate la 2.500 × g timp de 10 minute într-un mediu conținând 0,05 M glicină, 10 mM maleat de potasiu Tris, 5 mM MgCl2 și 10 mM mercaptoetanol (pH 7,3) pentru a scăpa de resturile celulare. S-a adăugat HCl la supernatant la o concentrație finală de 0,25 M, care a fost menținută pe gheață timp de 1 oră. Proteinele solubile în acid au fost recuperate prin centrifugare la 13.000 rpm timp de 10 minute la 4 ° C, apoi acidul tricloracetic (TCA) a fost adăugat la proteinele precipitate. Probele de zece micrograme de proteine ​​au fost încărcate pe un gel de poliacrilamidă de 16,5% pentru electroforeză, apoi transferate într-o membrană poli (viniliden difluorură) (PVDF), urmată de hibridizare cu anticorpi împotriva H3 și H4 acetilate și nonacetilate, NY). Pentru a verifica dacă orice PBA rezidual din corpurile de muște nu ar afecta acetilarea histonelor în timpul purificării lor, am adăugat 30 mM PBA în tamponul de omogenizare înainte de izolarea nucleelor ​​și histonelor și nu am găsit nicio diferență.

Rezultate si discutii

Pentru a testa acțiunea PBA in vivo, am hrănit cu muște nou închise ale tulpinii w 1118, pe tot parcursul vieții lor, cu mediu de muște standard (făină de porumb, agar, dextroză, drojdie; ref. 28) conținând diferite concentrații ale medicamentului (0, 0,1, 1, 2,5, 5, 10, 20 și 40 mM). Durata de viață a fost măsurată atât la 29 ° C, cât și la 25 ° C. Zece PBA milimolare au arătat o extensie izbitoare atât a medianei cât și a duratei maxime de viață (Fig. 1 a și c). La concentrațiile mai mari, 20 mM și 40 mM, PBA a fost aparent toxic, reducând supraviețuirea; există o gamă restrânsă de concentrație de PBA care este eficientă pentru extinderea duratei de viață. Pentru a determina dacă medicamentul este eficient și pe o tulpină diferită de Drosophila, am măsurat, de asemenea, efectul PBA asupra duratei de viață a tulpinei de tip sălbatic Canton-S (C-S), folosind 0, 2, 5 și 10 mM PBA. Cinci milimolari au crescut durata de viață la fel de mult ca 10 mM cu tulpina w 1118 (Fig. 1b), în timp ce 2 mM nu au avut efect și 10 mM au fost toxici. Astfel, concentrația optimă de PBA pare să varieze în funcție de fundalul genetic. Așa cum se arată mai jos, gradul de inhibare a histonei deacetilază a diferit, de asemenea, în același mod între aceste două tulpini.

Extinderea duratei de viață prin alimentarea PBA. Muștele adulte nou apărute au fost hrănite continuu cu mediu standard de făină de porumb/drojdie/agar, cu sau fără PBA adăugat, iar curbele de supraviețuire au fost măsurate. Fiecare populație inițială era de 400 de muște. Datele au fost combinate de la două grupuri separate de 100 de bărbați plus două grupuri separate de 100 de femele virgine. (a) cu 1118 tulpină la 29 ° C. Zece PBA milimolare extind supraviețuirea mediană cu 33% (supraviețuirea medie cu 36%, supraviețuirea maximă cu 52%). (b) Tulpină de tip sălbatic Canton-S la 29 ° C. Cinci PBA milimolare extind supraviețuirea mediană cu 36% (supraviețuirea medie cu 40%, maxim cu 41%). (c) cu 1118 tulpină la 25 ° C. PBA este, de asemenea, eficient la temperaturi mai scăzute.

S-a sugerat că evenimentele timpurii din viață pot întârzia apariția îmbătrânirii, extinzând astfel longevitatea (1). Prin urmare, am fost curioși să știm dacă o perioadă limitată de tratament PBA, timpuriu sau târziu, poate prelungi longevitatea. Adulți nou-născuți cu 1118 muște au fost hrăniți cu PBA, la concentrația optimă de 10 mM, de la apariție până la 12 zile (înainte ca supraviețuirea să înceapă orice declin rapid), apoi transferați în mediu simplu pentru restul vieții lor. Alternativ, muștele au fost hrănite cu mediu simplu pentru primele 12 zile, apoi cu mediu care conține medicamentul pentru restul vieții. În ambele cazuri, muștele tratate cu PBA au prezentat o durată de viață crescută în comparație cu muștele netratate (Fig. 2a și b). La femei, tratamentul inițiat la o vârstă ulterioară a fost chiar mai eficient decât aceeași durată a tratamentului la o vârstă fragedă. Rezultatele sugerează că stabilirea unui mediu celular modificat de către PBA, deși pentru o perioadă limitată, poate prelungi durata de viață a muștelor, posibil prin inhibarea acumulării de daune și/sau stimularea mecanismelor de reparare.

PBA extinde durata de viață, indiferent dacă este hrănită devreme sau târziu în viață. Nou apărute cu 1118 muște s-au hrănit cu mediu plus 10 mM PBA timp de 12 zile, apoi au fost transferate în mediu normal pentru tot restul vieții lor. Grupul Converse a fost alimentat pe mediu normal în primele 12 zile, apoi cu PBA pentru restul vieții. Săgețile indică ziua 12. Fiecare populație inițială avea 200 de muște. (a) Femele virgine; (b) masculi.

Pentru a testa problema posibilelor efecte de restricție calorică, am comparat muștele pentru greutate și dimensiune după 10 zile de hrănire la 25 ° C, cu sau fără PBA și nu s-a observat nicio diferență. Am măsurat numărul de ouă produse, procentul de ouă care produc descendenți adulți și greutatea și dimensiunea descendenților. În toate aceste măsurători, nu a existat niciun prejudiciu datorat alimentării cu PBA (Tabelul 1). Observațiile calitative privind ingestia de colorant alimentar au fost în concordanță cu această concluzie.

Comparația greutății, dimensiunii și capacității de reproducere a mușchilor w 1118 după ce a fost menținută pe alimente cu sau fără 10 mM PBA timp de 10 zile la 25 ° C

Am testat alți parametri pentru a determina dacă, asociată cu prelungirea duratei de viață, a existat și o menținere extinsă a vigoarei. Capacitatea locomotorie, măsurată prin urcare în răspunsul geotactic negativ (Fig. 3a), rezistența la înfometare (Fig. 3b) și rezistența la paraquatul generatorului de radicali liberi (Fig. 3c) toate au arătat extinderea duratei de viață sănătoase, în comparație cu comenzile care nu au fost alimentate cu PBA.

PBA inspiră menținerea capacității locomotorii și rezistența la stres. Pentru fiecare experiment, n = 80 w 1118 muște, repetate de patru ori. (Stânga) Femele virgine; (Drept) bărbați. În toate aceste paradigme, muștele tratate cu PBA de sex masculin și feminin au prezentat performanțe superioare. (a) Capacitatea locomotorie testată prin testul de urcare pentru trei transferuri într-un „aparat de distribuție contracurent” (41) ținut vertical. Muștele care au urcat la tubul superior de trei ori din trei studii au fost considerate pozitive. Muștele au fost menținute la 29 ° C timp de 10 zile cu sau fără PBA înainte de testare. (b) Rezistența la foamete uscată. Muștele crescute timp de 10 zile la 25 ° C cu sau fără PBA 10 mM au fost puse în flacoane goale pentru a testa supraviețuirea lor măsurată vs. timp. (c) Rezistența la paraquat, un generator de radicali liberi. Muștele crescute timp de 10 zile la 25 ° C cu sau fără 10 mM PBA au fost mai întâi private de apă într-un flacon gol timp de 3 ore, apoi transferate într-un flacon conținând hârtie de filtru udată cu 350 μl de paraquat 20 mM în zaharoză 5%. Valorile reprezintă media ± SD pentru cele patru curse. Testul t al studentului a fost folosit pentru a analiza diferența semnificativă dintre martori și muștele tratate cu PBA.

Deoarece PBA, un inhibitor al histonei deacetilazei, este cunoscut pentru a spori acetilarea cozilor histonelor H3 și H4, am investigat nivelul de acetilare a histonei la muște cu și fără hrănire cu PBA, folosind anticorpi specifici pe Western blots. Așa cum se arată în FIG. 4a și b, formele neacetilate ale acestor histone au fost predominante la muștele netratate, dar alimentarea cu PBA a crescut proporțiile formelor lor acetilate. Rezultate similare au fost obținute atât pentru bărbați, cât și pentru femei (Fig. 4c). Aceste modificări în acetilarea histonelor au sugerat posibile modificări ale structurii cromatinei, care ar putea schimba reglarea transcripției.

Efectul hrănirii PBA asupra acetilării histonelor H3 și H4. w 1118 muște au fost crescute timp de 10 zile la 29 ° C pe mediu conținând diferite concentrații de PBA. Histonele preparate din muște întregi au fost sondate pe Western blots cu anticorpi specifici pentru formele acetilate sau neacetilate ale cozilor histonelor H3 și H4. Zece micrograme de histonă au fost utilizate pe bandă. La muștele tratate cu PBA, formele acetilate atât ale H3 cât și ale H4 au fost crescute, în timp ce formele neacetilate au scăzut. (a) Histona H3 în w 1118 zboară. Abundența formei acetilate crește odată cu concentrația de PBA adăugată alimentelor. Forma neacetilată scade (masculi și femele virgine mixte). (b) Rezultate similare pentru histona H4 la w 1118 muște (masculi amestecați și femele virgine). (c) w 1118 masculi și femele virgine testate separat. Efectul PBA este similar la ambele sexe. (d) Creșterea acetilării histonei H3 în tulpina de tip sălbatic Canton-S (masculi și femele virgine mixte).

Pentru a investiga modelele diferențiale ale activității genice rezultate în urma tratamentului cu PBA, au fost utilizate matrici de membrane cu densitate ridicată care conțin aproximativ 7.500 de clone unice Drosophila EST (Research Genetics, Huntsville, AL). ARN Messenger a fost preparat din muște menținute la 29 ° C pe alimente care conțin 10 mM PBA de la apariție până la vârsta de 10 zile și un preparat similar a fost făcut din muște netratate. Acestea au fost etichetate cu 32 P și utilizate ca sonde pe membrane.

FIG. 5a prezintă o porțiune de probă a matricei hibridizate cu fiecare dintre cele două sonde diferite, pentru a ilustra alegerea a 100 de gene care au fost induse de PBA, pe baza intensității crescute a hibridizării. În schimb, am ales 48 de gene care au fost suprimate de tratament, după cum s-a judecat prin dispariția unui loc vizibil. Modelele au fost reproductibile cu două preparate independente de ARNm fiecare de la muște tratate și netratate și cu două perechi independente de membrane pentru fiecare preparat.

Cele 100 de gene induse au inclus 3 care anterior au fost implicate în detoxifiere, 3 chaperone, 2 implicate în mașini de traducere, 3 factori de transcripție, 7 implicați în căile de transducție a semnalului, 25 implicate în metabolism, 11 proteine ​​ribozomale, 11 proteaze, 4 kinaze, 13 gene care funcționează ca transportatori sau purtători și alți 18 implicați în alte funcții diverse. Dintre cele 48 de gene reprimate, au fost 21 implicate în metabolism, 4 proteaze, 2 proteine ​​ribozomale și 21 altele care au alte funcții diverse.

Pentru a verifica modificările nivelurilor de transcripție indicate pe microarrays, am folosit pete revers-nordice pe un subset de gene candidate. Șapte dintre genele induse au fost alese datorită implicării lor putative în îmbunătățirea longevității: superoxid dismutază, factor de alungire1α, glutation S-transferază, citocrom P450 și trei chaperone. În Drosophila, muștele transgenice cu gene superoxid dismutază au raportat o durată medie de viață extinsă (30-32). Factorul de alungire 1α joacă un rol critic în menținerea nivelului de sinteză a proteinelor, care în mod normal scade odată cu vârsta (33). Glutationul S-transferază și citocromul P450 sunt implicate în detoxifiere, unul dintre factorii determinanți ai îmbătrânirii (1, 34). Proteinele de șoc termic sporesc rezistența la stres și extind durata de viață (35, 36). Toate aceste gene au fost induse de PBA, după cum se confirmă în Fig. 5b. Rețineți că expresia superoxid dismutazei (SOD), în special, a fost dramatic crescută.

Nouăsprezece gene suplimentare au fost alese la întâmplare, 6 din grupul indus și 13 din grupul reprimat. Toate au fost confirmate prin revers-Northern blot, susținând metoda de screening a membranei utilizată în identificarea genelor. Genele sunt enumerate în Tabelul 2, grupate în funcție de funcțiile lor supuse.

Lista parțială a genelor induse sau reprimate la w 1118 zboară după 10 zile de hrănire cu PBA la 29 ° C

Indiferent dacă modificările observate în transcrierea genei, sau un subset al acestora, sunt responsabile pentru longevitatea crescută, va fi necesară testarea fiecărei gene candidate în mod individual prin supraexprimare la muștele transgenice sau prin inhibare specifică. De asemenea, care sunt primare și care sunt efectele din aval ale PBA rămâne de determinat. Va fi o provocare să definim constelațiile de gene și rețelele lor care pot fi responsabile pentru creșterea duratei de viață.

Este fascinant faptul că tratamentul cu PBA târziu în viața muștelor adulte poate fi încă eficient. Oricare ar fi mecanismele, observația noastră conform căreia hrănirea simplă a unui medicament poate spori durata de viață, împreună cu o menținere îmbunătățită a vigoarei, sugerează cu tărie fezabilitatea screeningului cu randament ridicat, pentru care Drosophila reprezintă un organism model convenabil. De asemenea, va fi de interes să se determine dacă tratamentul cu PBA al altor animale le poate afecta durata de viață.