Departamentul de Oftalmologie, Spitalul al nouălea al poporului, Laboratorul cheie din Shanghai de boli orbitale și oncologie oculară, Școala de medicină a Universității Jiao Tong din Shanghai, Shanghai, 200011 China

Departamentul de Inginerie Chimică și Institutul Koch pentru Cercetarea Integrativă a Cancerului, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, 02139 SUA

Departamentul de Inginerie Chimică și Institutul Koch pentru Cercetarea Integrativă a Cancerului, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, 02139 SUA

Institutul de Medicină Moleculară, Laboratorul Cheie de Stat pentru Oncogene și Gene înrudite, Institutul de Cancer din Shanghai, Spitalul Renji, Școala de Medicină a Universității Jiao Tong din Shanghai, Shanghai, 200127 China

Departamentul de Inginerie Chimică și Institutul Koch pentru Cercetarea Integrativă a Cancerului, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, 02139 SUA

Departamentul de Inginerie Chimică și Institutul Koch pentru Cercetarea Integrativă a Cancerului, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, 02139 SUA

Departamentul de Inginerie Chimică și Institutul Koch pentru Cercetarea Integrativă a Cancerului, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, 02139 SUA

Departamentul de Inginerie Chimică și Institutul Koch pentru Cercetarea Integrativă a Cancerului, Divizia de Medicină Comparată, Institutul de Tehnologie din Massachusetts, Cambridge, MA, 02139 SUA

Divizia de Gastroenterologie, Spitalul Brigham and Women, Harvard Medical School, Boston, MA, 02115 SUA

Departamentul de Inginerie Chimică și Institutul Koch pentru Cercetarea Integrativă a Cancerului, Harvard - Divizia MIT de Științe și Tehnologie a Sănătății, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, 02139 SUA

Divizia de Gastroenterologie, Spitalul Brigham and Women, Harvard Medical School, Boston, MA, 02115 SUA

Departamentul de Inginerie Mecanică, Institutul de Tehnologie din Massachusetts, Cambridge, MA, 02139 SUA

Departamentul de Oftalmologie, Spitalul al nouălea al poporului, Laboratorul cheie din Shanghai de boli orbitale și oncologie oculară, Școala de medicină a Universității Jiao Tong din Shanghai, Shanghai, 200011 China

Departamentul de Inginerie Chimică și Institutul Koch pentru Cercetarea Integrativă a Cancerului, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, 02139 SUA

Departamentul de Inginerie Chimică și Institutul Koch pentru Cercetarea Integrativă a Cancerului, Institutul de Tehnologie din Massachusetts, Cambridge, MA, 02139 SUA

Institutul de Medicină Moleculară, Laboratorul Cheie de Stat pentru Oncogene și Gene înrudite, Institutul de Cancer din Shanghai, Spitalul Renji, Școala de Medicină a Universității Jiao Tong din Shanghai, Shanghai, 200127 China

Departamentul de Inginerie Chimică și Institutul Koch pentru Cercetarea Integrativă a Cancerului, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, 02139 SUA

Departamentul de Inginerie Chimică și Institutul Koch pentru Cercetarea Integrativă a Cancerului, Institutul de Tehnologie din Massachusetts, Cambridge, MA, 02139 SUA

Departamentul de Inginerie Chimică și Institutul Koch pentru Cercetarea Integrativă a Cancerului, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, 02139 SUA

Departamentul de Inginerie Chimică și Institutul Koch pentru Cercetarea Integrativă a Cancerului, Divizia de Medicină Comparată, Institutul de Tehnologie din Massachusetts, Cambridge, MA, 02139 SUA

Divizia de Gastroenterologie, Spitalul Brigham and Women, Harvard Medical School, Boston, MA, 02115 SUA

Departamentul de Inginerie Chimică și Institutul Koch pentru Cercetarea Integrativă a Cancerului, Harvard - Divizia MIT de Științe și Tehnologie a Sănătății, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, 02139 SUA

Divizia de Gastroenterologie, Spitalul Brigham and Women, Harvard Medical School, Boston, MA, 02115 SUA

Departamentul de Inginerie Mecanică, Institutul de Tehnologie din Massachusetts, Cambridge, MA, 02139 SUA

Abstract

Elevarea submucoasă, procesul de instilare a materialului în spațiul submucos pentru separarea suprafeței mucoasei și a stratului muscular mai profund, este un aspect semnificativ al rezecției endoscopice a mucoasei leziunilor mari efectuate pentru a facilita îndepărtarea leziunilor și pentru a maximiza siguranța. Injecția submucoasă, atunci când este aplicată, a fost efectuată în mod istoric cu ser fiziologic normal, deși aceasta este limitată de disiparea sa rapidă; soluțiile trebuie în mod ideal să fie ușor injectabile, biocompatibile și să ofere o pernă submucoasă de lungă durată cu o înălțime dorită. Aici, raportat este un nou set de materiale, hidrogeluri subțiri injectabile endoscopic, care îndeplinesc aceste cerințe datorită componentelor lor biocompatibile și capacității de a forma un hidrogel solid la injecție. Aceste descoperiri sunt susținute de evaluarea unui model animal mare și, în cele din urmă, demonstrează potențialul acestor hidrogeli subțiri de forfecare pentru a servi ca fluide eficiente de injecție submucoasă pentru dezvoltarea pernei. Având în vedere aceste caracteristici unice, este anticipată aplicarea lor largă în tehnicile de rezecție a mucoasei.

1. Introducere

2 Rezultate și discuții

2.1 Proiectarea și pregătirea EISH-urilor

endoscopic

2.2 Proprietățile reologice ale EISH-urilor

S-au efectuat măsurători pas-tulpină pentru a verifica tranziția reversibilă gel-sol a EISH-urilor. Deformarea și recuperarea EISH-urilor au fost efectuate la cicluri repetate de 3 min cu o tensiune de magnitudine mică de 0,5% și 2 min cu o tensiune de magnitudine mare de 500% oscilații la 6,3 rad s -1. După aplicarea tulpinilor alternative joase și mari, am monitorizat modulele EISH-urilor în timpul modificărilor tulpinii. Așa cum se arată în Figura 2d, gelurile au suferit o tranziție gel-sol și s-au comportat ca lichide la creșterea tensiunii oscilatorii de la 0,5% la 500%. Invers, EISH-urile au suferit rapid tranziția sol-gel și s-au recuperat imediat la modulele lor inițiale, cu scăderea tulpinii de la 500% la 0,5%. Tranziția gel-sol a fost reversibilă și toate gelurile au fost capabile să se autovindece până la starea lor inițială, fără a arăta semne că fidelitatea mecanică a fost compromisă, indiferent de câte ori au fost tăiate anterior. Aceste date demonstrează reversibilitatea robustă a proprietăților mecanice ale EISH-urilor.

2.3 Evaluarea in vitro a EISH-urilor

Am studiat apoi fezabilitatea injecției EISH-urilor utilizând un ac endoscopic standard de calibru 25 32 care este utilizat pe scară largă pentru injecția submucoasă in vivo în procedurile endoscopice (Figura 3a). Formulările reprezentative ale EISH-urilor cu o concentrație de laponită de 2 mg mL -1 ar putea fi injectate așa cum se arată în Figura 3b. Modulul de stocare a EISH-urilor cu concentrații de laponită de 2, 3 și 4 mg ml -1 a scăzut față de G′ După trecerea printr-un ac de calibru 25 cu o viteză de injecție de 0,25 ml cu -1 până la 23%, 31% și respectiv 43% (Figura 3c). Pentru a elucida capacitatea de recuperare a EISH-urilor, s-au efectuat măsurători de reologie de măturare a timpului oscilator imediat după injectare. Așa cum se arată în Figura 3d, modulul EISH-urilor cu concentrații de laponită de 2, 3 și 4 mg ml -1 a crescut cu 2,9, 2,6 și 1,9 ori în 30 de minute, respectiv. Aceste rezultate demonstrează fezabilitatea injectării de EISH și conversia rapidă a acestora într-un gel solid după injectare.

Am evaluat apoi stabilitatea EISH-urilor prin măsurarea cineticii lor de eroziune într-un mediu fiziologic. Un volum de 0,5 ml de EISH-uri a fost injectat în soluție salină și incubat în continuare la 37 ° C pentru intervale de timp predeterminate. Volumul gelurilor rămase la fiecare moment a fost înregistrat pentru a calcula cinetica eroziunii EISH-urilor. Așa cum se arată în Figura 3e, masa EISH-urilor cu concentrație de laponită de 2 mg ml -1 a rămas constantă în decurs de 1,5 ore. În timp ce masa gelurilor a scăzut la 40% cu prelungirea timpului de incubare la 2 ore, ceea ce ar putea fi explicat prin difuzia pasivă atât a laponitului, cât și a alginatului. Cu toate acestea, EISH-urile cu o concentrație mai mare de laponită de 3 mg ml-1 și-au menținut masa până la 2 ore. Interesant, EISH-urile cu o concentrație ridicată de 4 mg mL -1 s-au umflat treptat și au atins de 1,4 ori masa inițială după 2 ore de incubație. Speculăm că dispersia unui conținut ridicat de laponită de 4 mg mL -1 în soluție apoasă de alginat formează hidrogeli stabili care pot promova absorbția lor de apă. Aceste profiluri de eroziune sugerează potențialul EISH-urilor de a rezista difuziei pasive și de a obține perne submucoase relative pe termen lung.

2.4 Dezvoltarea endoscopică a pernelor submucoase

După ce am confirmat injecția fezabilă și recuperarea rapidă, precum și stabilitatea ridicată a EISH-urilor, le-am testat apoi performanțele pentru dezvoltarea pernei in vivo. Porcii Yorkshire cu greutatea de 40-80 kg au fost folosiți ca model animal mare și injectarea endoscopică a fost utilizată pentru a dezvolta perne submucoase în colon. Așa cum este afișat în Figura 4a, b, o pernă limpede s-a format cu ușurință prin injectarea submucoasă a 1,5 cmc de EISH (2 mg ml -1) printr-un ac endoscopic. Au fost efectuate patru injecții diferite și de fiecare dată a fost observată o pernă bine formată. În plus, a fost utilizată videografia endoscopică pentru a observa durata pernelor formate de EISH-uri. Am constatat că pernele create de soluția salină normală s-au aplatizat dramatic în decurs de 1 minut (Figura 4c, d), în timp ce pernele produse de EISH au rămas aproape neschimbate până la 3,5 minute (Figura 4e, f), arătând durata prelungită a pernelor dezvoltate de aceste geluri.

2.5 Toxicitatea locală a EISH-urilor

Pentru a finaliza evaluarea avantajelor EISH-urilor ca agenți de injecție submucoasă, am evaluat toxicitatea locală a acestora prin analize histologice. 33 Colorarea hematoxilinei și eozinei (H&E) a fost utilizată pentru a evalua toxicitatea EISH-urilor împotriva țesutului colonului porc in vivo. 3 cc de EISH-uri cu o concentrație de laponită de 3 mg mL -1 au fost injectate submucos submucos în colonul unui porc sedat și soluție salină normală a fost utilizată ca martor. La 2 ore după injectare, porcul a fost eutanasiat, iar țesuturile au fost imediat recoltate, fixate de formalină și încorporate în continuare de parafină. Țesuturile rezultate au fost apoi secționate și colorate prin H&E pentru imagistica microscopică. Așa cum se arată în Figura 6a - c, nu s-a observat nicio diferență semnificativă între țesuturile tratate de EISH și țesuturile martor injectate cu ser fiziologic normal. Rezultate similare s-au obținut prin incubarea EISH-urilor plasate pe vârful mucusului timp de 2 ore (Figura 6d - f), susținând toxicitatea locală scăzută a acestor geluri folosind ca agenți de dezvoltare a pernei. Pentru o traducere umană viitoare cu succes va fi necesară o evaluare suplimentară a efectelor locale, precum și a impactului pe termen lung asupra regiunilor adiacente, inclusiv a ganglionilor limfatici drenatori.

3 Concluzii

În rezumat, raportăm dezvoltarea și aplicarea hidrogelurilor subțiri de forfecare ca soluții sigure și injectabile endoscopic capabile să stabilească perne submucoase durabile. Arătăm că acești hidrogeli subțiri de forfecare pot fi preparați rapid prin dispersarea Laponitei disponibile comercial într-o soluție apoasă de alginat și proprietățile lor reologice pot fi ușor reglate prin variația concentrațiilor de Laponite. Arătăm, de asemenea, că acești hidrogeli pot fi injectați printr-un ac endoscopic standard și demonstrează în continuare toxicitatea lor scăzută, precum și duratele semnificativ îmbunătățite ale pernelor ridicate de aceste geluri. Pe scurt, materialele hidrogel dezvoltate aici prezintă 1) resurse disponibile comercial și ieftine; 2) forfecare reglabilă - proprietăți de subțiere și capacitate injectabilă endoscopic; 3) o bună biocompatibilitate și o stabilitate îmbunătățită semnificativ pentru dezvoltarea de perne submucoase durabile. Toate aceste caracteristici fac din EISH un set promițător de materiale hidrogel pentru aplicare largă în tehnicile de rezecție a mucoasei și constricția potențială a luminii, administrarea medicamentelor și ingineria țesuturilor.

4 Secțiunea experimentală

Materiale: Alginat de sodiu, laponit, carmin indigo, albastru de metilen și alți reactivi chimici au fost cumpărați de la Sigma și utilizați ca primiți, cu excepția cazului în care se menționează altfel. Apa Nanopure (18 MΩ cm) a fost achiziționată prin intermediul unui sistem de filtrare a apei Milli-Q, Millipore (St. Charles).

Măsurători TEM: Experimentele TEM au fost efectuate pe un instrument JEOL 2100 FEG la o tensiune de accelerație de 200 kV. Eșantionul TEM a fost preparat prin aruncarea soluțiilor exfoliate de laponită pe o rețea de cupru acoperită cu carbon de 300 mEISH. Probele au fost șterse după 30 de minute de incubare la temperatura camerei și apoi spălate de două ori cu apă distilată și uscate la aer înainte de imagistică.

Pregătirea EISH-urilor: Soluție apoasă de alginat de sodiu 0,2% a fost preparată ca soluție stoc. Laponitul a fost adăugat în soluția stoc cu diferite concentrații și apoi sonicat pentru aproximativ 2-5 min pentru a obține EISH-uri. EISH-urile cu concentrații de laponită de 2, 3, 4 și 5 mg ml -1 au fost preparate corespunzător și utilizate direct pentru măsurători ulterioare.

Măsurători ale proprietăților reologice ale EISH-urilor: Timpul oscilator dinamic, frecvența și măturarea tensiunii au fost efectuate folosind un reometru controlat de tensiune AR2000 (TA Instruments, New Castle, DE) cu geometrie a plăcii de oțel de 25 mm la o distanță de 27 mm. Laponitul a fost dispersat în soluție de alginat 0,2% în greutate prin sonicare pentru a forma EISH-uri cu compoziții specificate și gelurile au fost aplicate între cele două plăci ale reometrului. Placa superioară a fost coborâtă la o distanță de 27 mm și excesul de gel a fost îndepărtat. S-a avut grijă să se obțină o distribuție omogenă a gelului în plăcile superioare și inferioare ale reometrului. Măsurările dinamice ale timpului oscilator au fost colectate la frecvențe unghiulare de 6,3 rad s -1 și 0,5% deformare. O măturare inițială a amplitudinii de deformare a fost efectuată la 25 ° C la diferite frecvențe pentru a determina domeniul viscoelastic liniar pentru geluri. Proprietățile reologice au fost examinate prin experimente de măturare în frecvență la o amplitudine fixă ​​a tensiunii de 0,5%. Experimentele au fost repetate pe trei până la patru probe și au fost prezentate date reprezentative. Pentru experimentele de recuperare la forfecare la 6,3 rad s -1, subțierea forfecării a fost indusă prin aplicarea unei tulpini de 500% timp de 2 minute. Tulpina a fost eliberată la 0,5% timp de 3 minute pentru a permite recuperarea gelului.

Studii de eroziune a EISH-urilor: Cinetica eroziunii EISH-urilor a fost măsurată într-un mediu fiziologic. Un volum de 0,5 ml de EISH-uri a fost injectat în soluție salină și incubat în continuare la 37 ° C timp de 30, 60, 90 și respectiv 120 de minute. Volumul gelurilor rămase la fiecare punct de timp a fost înregistrat pentru a calcula cinetica eroziunii EISH-urilor.

Dezvoltare de pernă Ex Vivo în Pig Colon: Dezvoltarea pernei ex vivo a fost realizată prin injectarea de 0,5 cc EISHs (2 mg mL -1) în colonul de porc. Țesutul de colon a fost izolat din tracturile gastro-intestinale intacte proaspăt obținute de la porci de la abatoare locale selectate. Vederea de sus și cea laterală a pernelor dezvoltate au fost prezentate în Figura S1 în Informații suport.

In Vivo Cushion Development într-un model de porc: Toate experimentele cu porc au fost aprobate de Comitetul pentru îngrijirea animalelor de la Institutul de Tehnologie din Massachusetts. Femele de porc Yorkshire (40-80 kg) au fost obținute de la Universitatea Tufts și adăpostite în condiții convenționale. Animalele au fost selectate aleatoriu pentru experimente. Animalele au fost plasate pe o dietă lichidă timp de 24 de ore înainte de experiment cu hrana de dimineață ținută în ziua experimentului. La momentul experimentului, porcii au fost anesteziați cu administrare intramusculară de Telazol (tiletamină/zolazepam, 5 mg kg -1), xilazină (2 mg kg -1) și atropină (0,04 mg kg -1). Un endoscop (Pentax, endoscopie SUA) a fost introdus în colonul distal și un ac Carr-Locke a fost introdus prin canalul endoscopului în colon. Ulterior, 1,5 ml de soluție salină și hidrogel au fost injectați separat în spațiul submucos, repetat de trei ori. Au fost înregistrate videoclipuri pentru a monitoriza scăderea dimensiunii ridicării pernelor. Toate animalele au fost recuperate din anestezie.

Măsurători ale duratei pernei in vivo: Toate procedurile au fost efectuate în conformitate cu protocoalele aprobate de Comitetul pentru îngrijirea animalelor din Massachusetts Institute of Technology. Femelele porcine Yorkshire, cu greutatea corporală de aproximativ 40-80 kg, au fost anesteziate cu administrare intramusculară de Telazol (tiletamină/zolazepam, 5 mg kg -1), xilazină (2 mg kg -1) și atropină (0,04 mg kg -1). Animalele au fost intubate și menținute pe 2-3% izofluran în oxigen. Ca parte a unei proceduri terminale sau non-de supraviețuire, a fost efectuată o laparotomie de linie mediană și jejunul proximal sau colonul distal a fost accesat și stabilizat cu tifon. S-a făcut o incizie longitudinală pentru a accesa latura luminală și 2 cc soluție salină normală și 1 mg mL -1 EISH, 2 mg mL -1 EISH și 3 mg mL -1 EISH au fost injectate în spațiul submucos pentru a forma pernele. Lungimea, lățimea și înălțimea pernelor au fost măsurate la 0, 30, 60 și 120 de minute după injectare. 1, 2 și 3 mL 2 mg mL -1 EISH-uri au fost, de asemenea, injectate pentru a investiga proprietățile pernei. Animalele au fost eutanasiate înainte de recuperarea anestezică cu administrare intravenoasă de 120 mg kg -1 de pentobarbital de sodiu.

Colorarea H&E: Toxicitatea EISH-urilor a fost evaluată în timpul unui experiment terminal in vivo. Toate procedurile au fost efectuate în conformitate cu protocoalele aprobate de Comitetul pentru îngrijirea animalelor din Massachusetts Institute of Technology. Porcii au fost intubați și menținuți pe 2-3% izofluran în oxigen. S-a efectuat o laparotomie de linie mediană și jejunul proximal a fost accesat și stabilizat cu tifon. Soluție salină normală de 3 cc și 3 mg ml-1 EISH au fost injectate submucos în colonul de porc pentru a forma pernele. Între timp, s-au făcut multiple incizii de 4–5 cm de-a lungul părții antimesenterice a colonului. Soluția salină normală de 3 cc și 3 mg mL -1 EISH au fost incubate pe partea superioară a mucusului folosind godeuri securizate cu carbopol și acoperite cu o membrană adezivă. Porcii au fost eutanasiați cu pentobarbital de sodiu (120 mg kg -1) intravenos înainte de colectarea țesutului. Țesuturile au fost recoltate și plasate în formalină (4%). După ce țesuturile au fost fixate în formalină, acestea au fost încorporate în parafină, secționate și colorate cu H&E pentru analiză.