Ciuperci și interacțiunile lor

Editat de
Hector Mora Montes

Universitatea din Guanajuato, Mexic

Revizuite de
Praveen R. Juvvadi

Universitatea Duke, Statele Unite

Frank Ebel

Universitatea Ludwig Maximilian din München, Germania

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

organizatoare

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • Laboratorul cheie Jiangsu pentru microbi și genomică funcțională, Centrul de cercetare tehnologică și inginerie Jiangsu pentru microbiologie, Colegiul de Științe ale vieții, Universitatea normală Nanjing, Nanjing, China

Momentul adecvat și poziționarea citokinezei/septării este crucială pentru creșterea și conidierea hifalului în Aspergillus nidulans. Componentele rețelei de inițiere a septării (SIN) sunt o cascadă de semnalizare localizată a corpului polului fusului (SPB) și complexul terminal de kinază SidB-MobA, care trebuie să se localizeze pe SPB în această cale pentru a declanșa septarea/citokineza. Subunitatea de reglementare a fosfatazei PP2A-ParA a fost identificată ca fiind un regulator negativ capabil să inactiveze SIN. Cu toate acestea, se știe puțin despre modul în care ParA reglează calea SIN și dacă ParA reglează procesul de formare a septului prin afectarea proteinelor SIN localizate SPB. În acest studiu, prin RNA-Seq și abordări genetice, am identificat un nou regulator de septare pozitiv, o proteină putoasă de organizare a fusului mitotic și un omolog Mzt1 de drojdie MztA, care acționează antagonic față de PP2A-ParA pentru a regla coordonat proteinele SIN localizate SPB SidB-MobA în timpul septării. Aceste descoperiri implică faptul că regulatorii, fosfataza PP2A-ParA și MztA contracarează funcția de septare probabil prin echilibrarea polimerizării și depolimerizării microtubulilor la SPB.

Introducere

În plus, SPB servește și ca centru de organizare a microtubulilor (MTOC), pentru a însămânța polimerizarea fusului mitotic și pentru a furniza mașini nucleatoare pentru reglarea atașării și dinamicii microtubulilor și stabilirea polarității microtubulilor (Zekert și colab., 2010; Takeshita și Fischer, 2011; Kilmartin, 2014; Wieczorek și colab., 2015). Regulatorul principal al nucleației microtubulilor (MT) este complexul inelar γ-tubulină (γ-TuRC), care acoperă capetele minus ale MT și facilitează nucleația direcțională a MT. Astfel, MT-urile sunt polimeri dinamici care tranzitează între polimerizare și depolimerizare (Xiong și Oakley, 2009; Suri și colab., 2014; Walia și colab., 2014). Mai mult, semnalele care transmit proteine ​​SIN localizate SPB prin cascadă pentru a declanșa citokineza au nevoie de control spațial și temporal al evenimentelor de restructurare celulară dependente de MT (Robinson și Spudich, 2004; Rankin și Wordeman, 2010; Zhou și colab., 2010; Ngo și colab. ., 2016). În țesutul uman, o proteină numită proteină organizatoare a fusului mitotic (MOZART1) care interacționează cu γ-TuRC a fost identificată pentru a promova polimerizarea microtubulului și apoi a da naștere la microtubuli ramificați (Hutchins și colab., 2010; Teixidó-Travesa și colab., 2010; Cukier și colab., 2017). Cu toate acestea, cunoașterea dacă regulatorul principal γ -TuRC al nucleației MT afectează citokineza este încă limitată.

În acest studiu, prin RNA-Seq și abordări genetice, am identificat un nou regulator de septare pozitiv, MztA, care acționează antagonic față de ParA pentru a regla coordonat proteinele SIN localizate SPB SidB-MobA în timpul septării în ciuperca filamentoasă. A. nidulans.

Materiale și metode

Condiții de tulpini, media și cultură

O lista de A. nidulans tulpinile și oligonucleotidele utilizate în acest studiu sunt furnizate în tabelele 1, 2. YAG (5 g/L extract de drojdie + 1 mL/L oligoelement + 20 g/l glucoză), YUU (YAG + 1,2 g/L uridină + 1,1 g/L Uracil), MMPGR (50 mL/L Sare + 10 mL/L Glicerol + 0,5 mg/L Piridoxină + 2,5 mg/L Riboflavină + 1 mL/L Oligoelement), MMPGRTUU (MMPGR + 1,2 g/L Uridină + 1,1 g/L Uracil + 11,9 g/L Treonină) și MMPPGRTUU (MMPGRUU cu acid p-aminobenzoic 100 mM). Aceste medii au fost descrise în lucrări anterioare (Gupta și colab., 1976; Käfer, 1977). Condiții de creștere, încrucișări și condiții de inducție pentru alcA(pExpresia condusă a fost așa cum s-a descris anterior (Liu și colab., 2003). Supraexprimarea genelor marcate sub controlul alcA promotorii au fost induși cu treonină (Zhong și colab., 2014). Au fost utilizate proceduri standard de transformare a ADN-ului A. nidulans (Osmani și colab., 1988).

tabelul 1. Aspergillus nidulans tulpini utilizate în acest studiu.

masa 2. Grunduri utilizate în acest studiu.

Analiza PCR cantitativă în timp real

Conidia de para-mutantul supraexprimat și tipul sălbatic parental (TN02A7) au fost cultivate în MMPGRTUU timp de 18 ore la 37 ° C cu un agitator rotativ la 220 rpm și apoi hifele uscate colectate au fost pulverizate până la o pulbere fină în prezența azotului lichid. ARN-ul total a fost extras folosind TRIzol (Roche) urmând instrucțiunile producătorului. Probele au fost tratate cu DNază I (TaKaRa), iar ADNc a fost generat folosind un kit de sinteză ADNc iScript Select (Bio-Rad). PCR în timp real a fost efectuat folosind un termociclor rapid ABI într-un singur pas (Applied Biosystems), iar produsele de reacție au fost detectate cu verde SYBR (TaKaRa). PCR a fost realizată printr-o etapă de denaturare de 10 minute la 95 ° C urmată de 40 de cicluri de 95 ° C-30 s, 60 ° C-30 s, 72 ° C-30 s. Nivelurile de transcriere au fost calculate prin metoda CT comparativă și normalizate față de expresia genei actinei în A. nidulans (Alam și colab., 2012; Long și colab., 2016). Exemple de informații sunt furnizate în Tabelul 2.

Construcția tulpinilor mutante

Pentru construcțiile celor cinci gene supraexprimate menționate anterior în fundalul para-supraexprimarea, A. nidulans AnpyroA gena, un marker nutrițional selectabil, a fost amplificată cu perechea de primer NotI-pyroA-5 '/ SpeI-pyroA-3'. Apoi AnpyroA fragmentul a fost clonat în vectorul reconstituit pBARGPE1 utilizând kitul de clonare cu un pas ClonExpress II (VazymeTM, C112-02), această tulpină a fost desemnată pBARGPE1-1, care conține AngpdA promotor. Folosind ADNc ca șablon, fragmentele ORF ale celor cinci gene au fost amplificate cu perechi de primer mztA-ClaI-5 ’/ mztA-ClaI-3’, pdbA-ClaI-5 ’/ pdbA -ClaI-3’, pdbA-SmaI- 5 ′/pdbA-SmaI-3 ′, pamA-ClaI-5 ′/pamA-ClaI-3 ′, respectiv cdc5A-ClaI-5 ′/cdc5A-ClaI-3 ′ și ulterior au fost clonate în pBARGPE1-1. Plasmidele relevante rezultate au fost transformate în OE:para încordare.

Pentru a genera un alcA (p) -gfp-mobA construcție de fuziune, un fragment de 594-bp mobA a fost amplificat din ADN genomic TN02A7 prin utilizarea primerilor mobA-NotI-5 ’/ mobA-XbaI-3’ (vezi Tabelul 2) și apoi mobA a fost donat în siturile corespunzătoare ale pLB01, rezultând pLB-mobA (Liu și colab., 2003). Această plasmidă a fost transformată în tulpina primitoare R21. Recombinarea omologă a acestei plasmide în mobA locusul ar trebui să conducă la o fuziune a proteinei fluorescente verzi N-terminale (GFP) cu produsul întregului mobA genă sub controlul alcA promotor. A fost menționată această tulpină alc (p) -mobA-GFP. Pentru generația de OE:para mobA−GFP, OE:mztA mobA−GFP și OE:para OE:mztA mobA− Tulpini GPF, alc (p) -mobA-GFP a fost încrucișat cu OE:para, OE:mztA și OE:para OE:mztA mutanți, respectiv.

Microscopie și procesare de imagini

Izolarea ARN pentru analiza nordică

Rezultate

Identificarea supresorilor ParA în septare și conciliere

figura 1. Identificarea supresoarelor de para în septare și conidiere. (A) Nivelurile relative de mARN de mztA, pdbA, pdaA, pamA, și cdc5A, respectiv, folosind teste RT-PCR în timp real în para-supraexprimând tipul sălbatic mutant și parental (TN02A7). Aceste două tulpini cultivate în mediu lichid MMPGRTUU la 37 ° C la 220 rpm timp de 18 ore. Cantitatea măsurată de mARN în fiecare dintre probele tratate a fost normalizată folosind valorile CT obținute pentru actina de referință internă (AN3696.4). (B) Caracterizarea fenotipică a mztA, pdbA, pdaA, pamA, și cdc5A mutanți de ștergere în fundalul para-mutant supraexprimând și respectiv tipul sălbatic parental (TN02A7). Toate tulpinile au fost cultivate pe mediu solid MMPGRTUU timp de 2,5 zile. (C) Morfologiile coloniilor mutanților supraexprimați pentru mztA, pdbA, pdaA, pamA și cdc5A gene în fundalul para-mutant supraexprimat. Toate tulpinile au fost cultivate pe mediu solid MMPGRTUU timp de 2,5 zile.

Figura 2. Morfologiile hifale ale mztA, pdbA, pdaA, pamA, și cdc5A ștergeri (A) și supraexprimarea lor (B) în fundalul para-supraexprimarea mutantului cultivat în mediu lichid MMPGRTUU și colorat cu calcofluor alb (septuri). Toate tulpinile au fost cultivate la 37 ° C timp de 11 ore. Săgețile indică locațiile septurilor. Bare, 10 μm.

În schimb, ne-am întrebat apoi că dacă supraexprimarea celor cinci gene ar putea salva morfologia bolnavă a para-mutant supraexprimat. Apoi le-am exagerat excesiv printr-un AngpdA-promotor constitutiv condus în fundalul para-tulpina supraexprimată. PCR de diagnostic a relevat acele tulpini asociate care au fost construite cu succes (Figura S2). În special, supraexprimarea mztA a restabilit semnificativ OE:para mutant la un fenotip cu conidiere asemănătoare WT și creștere radială a hifului așa cum se arată în Figura 1C. În comparație, supraexprimarea celorlalte patru gene nu a putut salva colonia aconidială la fenotipul de tip sălbatic. În mod consecvent, observația culturală lichidă a demonstrat că OE:mztA ar putea salva defectul de septare al supra-exprimării para, în timp ce nu au existat diferențe evidente pentru septare între celelalte patru tulpini supraexprimate și tulpina sa de tip sălbatic parental (Figura 2B). Prin urmare, aceste rezultate sugerează că mztA funcționează ca un supresor al para în septare și conidierea în A. nidulans.

Defecte de septare și de confruntare induse de supraexprimare para Sunt salvate de supraexprimare mztA într-un mod dependent de doză

Septa redusă în ΔmztA Sunt suprimate de șters para

Figura 4. Distribuția anormală a septurilor în mztA mutant de deleție și nivelurile de ARNm pentru mztA și para gene în diferite stadii de dezvoltare în tipul sălbatic (TN02A7). (A) Comparația distribuției septului în celulele hifale între tipul sălbatic parental (TN02A7) și (mztA mutant. Aceste două tulpini au fost crescute în mediu MMPGRTUU la 37 ° C timp de 10.11 și 12 ore. Septa au fost colorate cu calcofluor alb. Săgețile indică locațiile septurilor. Bare, 10 μm. (B) Date cantitative pentru distanța septului WT și ΔmztA mutant sub aceeași condiție culturală și timp. Semnificația statistică a fost determinată de testul lui Student, cu P Cuvinte cheie: ParA, MztA, PP2A, supresor, septare, Aspergillus nidulans

Citare: Jiang P, Zheng S și Lu L (2018) Proteina MztA care organizează fusul mitotic mediază semnalizarea septării prin suprimarea subunității de reglementare a proteinei fosfatazei 2A-ParA în Aspergillus nidulans. Față. Microbiol. 9: 988. doi: 10.3389/fmicb.2018.00988

Primit: 06 februarie 2018; Acceptat: 27 aprilie 2018;
Publicat: 08 mai 2018.

Hector Mora Montes, Universitatea din Guanajuato, Mexic

Praveen Rao Juvvadi, Universitatea Duke, Statele Unite
Frank Ebel, Ludwig-Maximilians-Universität München, Germania