Editat de Peter M. Howley, Harvard Medical School, Boston, MA și aprobat la 16 noiembrie 2001 (primit pentru revizuire la 18 iunie 2001)

funcționale

Abstract

Inactivarea funcțională a proteinei supresoare tumorale p53 prin ubiquitină accelerată/proteoliză dependentă de proteazom este un eveniment frecvent în progresia tumorii. Degradarea proteazomală este inhibată de repetarea Gly-Ala (GAr) a antigenului nuclear 1 al virusului Epstein-Barr, care acționează ca un element transferabil pe o varietate de substraturi proteazomale. Demonstrăm că himerele p53 care conțin domenii GAr de diferite lungimi și poziții în cadrul proteinei sunt protejate de proteoliză indusă de ubiquitin ligases dublu minut 2 murin și proteine ​​asociate E6, dar sunt încă ubiquitinate și păstrează capacitatea de a interacționa cu legarea ubiquitinei S5a subunitate a proteazomului. Chimerele GAr transactivează genele țintă p53, induc oprirea ciclului celular și apoptoza și prezintă activitate inhibitorie a creșterii îmbunătățită în celulele tumorale cu activitate p53 endogenă afectată.

Inactivarea p53 de către niveluri ridicate de Mdm2 sau HPV E6 oferă un avantaj clar de creștere in vivo (13, 14), sugerând că o proteină p53 activă terapeutic ar trebui să reziste activității acestor ligase. În acest context, ar trebui subliniat faptul că Mdm2 și E6-AP aparțin unor familii distincte de ubiquitin ligase (15). Mdm2 s-a dovedit recent a fi o ubiquitin ligază RING-deget care se leagă de domeniul de transactivare transcripțională a p53 (16). În schimb, E6-AP interacționează cu domeniul de legare a ADN-ului și este exemplul clasic al domeniului HECT (omologie la capătul terminal E6-AP C) ubiquitin ligază (6). Aceste diferențe explicite între cele două ligase implică faptul că salvarea simultană a p53 din degradarea mediată de E6 și Mdm2 poate fi realizată numai prin țintirea evenimentelor comune din aval în calea degradării.

O oportunitate interesantă pentru atingerea acestui obiectiv poate fi oferită de un modulator recent descoperit al proteolizei dependente de ubiquitină, repetarea Gly-Ala (GAr) a antigenului nuclear 1 al virusului Epstein - Barr (EBV) (EBNA1). Acest domeniu proteic interferează cu procesarea proteazomală a EBNA1 (17), prelungind timpul său de înjumătățire și abrogând prezentarea epitopilor EBNA1 la limfocitele T CD8 + limitate CD8 + complex complex de histocompatibilitate majoră (18, 19). GAr acționează ca un element transferabil cu acțiune cis pe diferite substraturi proteazomice (17, 20). Promiscuitatea efectului implică faptul că GAr poate contracara activitatea unei largi varietăți de ubiquitină ligase, oferind astfel un instrument atractiv pentru reglarea proteolizei multor substraturi de potențial interes pentru terapia de transfer genetic (21).

Aici raportăm despre generarea unui set de himere p53-GAr care prezintă o rezistență îmbunătățită la degradarea indusă de Mdm2 și E6 în testele de cotransfecție și în liniile celulare tumorale umane cu proteoliză accelerată a p53 endogen. Chimerele p53-GAr sunt salvate eficient de degradarea dependentă de ubiquitină/proteazom, rezultând niveluri crescute în starea de echilibru de p53 activ funcțional.

Materiale și metode

Construirea chimerelor p53-GAr.

Cultura țesuturilor, transfecția și testarea formării coloniilor.

Liniile osteosarcomului uman Saos-2 [p53 nul (26),] și U2OS [p53 de tip sălbatic, supraexpresie Mdm2 (13)], și liniile de carcinom cervical uman HeLa (p53 de tip sălbatic, HPV18 pozitiv), CasKi și SiHa [P53 de tip sălbatic, HPV16 pozitiv (14, 27)] au fost menținute în mediul Dulbecco modificat de Iscove (Life Technologies, Grand Island, NY) suplimentat cu 10% FCS. Transfecțiile tranzitorii ale monostratelor subconfluente au fost efectuate cu Lipofectamină (Life Technologies). Pentru testele de formare a coloniilor, 1,9105 celule U2OS transfectate au fost împărțite la 16 ore după transfecție (8000 de celule pe godeu) în mediu conținând 0,5 mg/ml de Geneticin (Sigma). Numărul de colonii viabile a fost numărat după 2 săptămâni de selecție.

Analiza Western Blot.

Extractele de celule totale au fost fracționate prin SDS/PAGE, transferate la membranele nitrocelulozice Protran BA85 (Schleicher & Schuell) și testate cu anticorp monoclonal primar anti-p53 de șoarece (D07, Dako) sau anticorp monoclonal anti-p21 WAF/CIP1 de șoarece (Transduction Laboratories ), Lexington, KY). După incubare cu anticorpii secundari conjugați cu peroxidază, complexele au fost vizualizate prin chemiluminescență sporită (Amersham Pharmacia - Pharmacia Biotech). Pentru determinarea volumului de proteine, celulele transfectate transitoriu au fost incubate cu cicloheximidă (Sigma). Densitometria a fost efectuată folosind un Densitometru personal SI (dinamică moleculară).

Citometrie de flux și imunocitochimie.

Analiza citometrică de flux a fost efectuată utilizând un citometru de flux FACSort (Becton Dickinson) și un software cellquest. Pentru analiza ciclului celular, celulele au fost fixate și colorate cu anticorpul anti-p53 de șoarece D07 și un anticorp anti-șoarece marcat cu FITC (Dako) prin utilizarea kitului Cytofix/Citoperm (PharMingen) înainte de incubare cu iodură de propidiu (Sigma). Pentru colorarea imunofluorescentă, celulele au fost fixate în paraformaldehidă 4% și apoi incubate peste noapte cu un anticorp monoclonal anti-FLAG de șoarece (M5, Sigma).

Testele glutatione S-Transferază (GST) Pull-Down.

ORF-urile S5a și S8 au fost amplificate PCR dintr-o bibliotecă de ADNc leucocitar uman (CLONTECH) și clonate în pGEX-5X-1 (Amersham Pharmacia - Pharmacia Biotech). Proteinele de fuziune GST-S5a și S8 au fost purificate din tulpina Escherichia coli BL-21 (Amersham Pharmacia - Pharmacia Biotech). Celulele HeLa transfectate tranzitoriu cu FLAG p53 sau FLAG p53-GA239/C au fost lizate la 4 ° C timp de 12 ore în tampon de liză (1% digitonină/50 mM NaCl/50 mM Tris, pH 7,6) conținând amestec de inhibitori de protează (Sigma) și 20 mM N-etilmaleimidă (Sigma). Lizatele au fost eliminate prin centrifugare timp de 20 minute la 4 ° C, 15.000 × g și diluate în tampon de legare (50 mM Tris, pH 7,6/50 mM NaCL/0,01% Triton X-100/10% glicerol). Două micrograme de proteină de fuziune GST au fost imobilizate pe 10 pl de gel de glutation Sefaroză 4B (Amersham Pharmacia - Pharmacia Biotech) și incubate cu lizate de celule HeLa. După spălare de cinci ori la 4 ° C în tampon de legare, probele au fost resuspendate în tampon de probă SDS pentru separare prin SDS/PAGE și imunoblotare cu anticorpul anti-p53 D07.

Rezultate

Exprimarea chimerelor p53-GAr.

Un set de himere care conțin GAr a fost construit pentru a investiga efectul repetării asupra cifrei de afaceri și funcției proteinei supresoare tumorale p53. Un GAr de 239-aa-lung, derivat dintr-un izolat EBV natural (28), a fost introdus la capătul C al p53 (Fig. 1A). În plus, a fost introdus un GAr mai scurt de 25-aa-lung sau o întindere de glicină de 25-aa-lung mai mică la capătul N sau C al p53.

Exprimarea himerelor p53-GAr în celulele Saos-2 p53-negative. (A) Reprezentarea schematică a himerelor p53 marcate cu FLAG (F) care conțin inserții GAr sau GGr terminale N sau C. (B) Extractele de celule Saos-2 transfectate tranzitoriu au fost examinate prin Western blot cu un anticorp monoclonal specific pentru p53 de tip sălbatic. Sunt indicați markerii greutății moleculare.

Expresia himerelor a fost investigată prin transfecție în linia de osteosarcom negativ p53 Saos-2. Cele mai ridicate niveluri de expresie au fost detectate în mod regulat în celulele transfectate cu himerele p53-GA239/C urmate de celulele transfectate cu p53-GA25/N sau p53-GA25/C, în timp ce expresia a fost constant mai scăzută în celulele transfectate cu p53 de tip sălbatic sau himerele p53-GG25/N și p53-GG25/C (Fig. 1B).

GAr protejează p53 de proteoliza indusă de Mdm2 și HPV-E6.

Exprimarea p53 a fost investigată prin analiza Western blot a celulelor Saos-2 cotransfectate cu plasmide care exprimă diferite himere p53 și ubiquitin ligaza Mdm2. Așa cum era de așteptat, nivelurile stării de echilibru ale p53 de tip sălbatic au scăzut dramatic în prezența Mdm2 într-o manieră dependentă de doză (Fig. 2 A și B). Inserarea unui GAr cu 25 de reziduuri a dus la o protecție modestă împotriva degradării induse de Mdm2, în timp ce un efect mai dramatic s-a obținut prin inserarea unei repetări lungi de 239 de reziduuri, în acord cu observația noastră anterioară că efectul GAr este lung - dependent (23). O scară distinctă de specii cu greutate moleculară mare, distanțate în mod regulat, a fost detectată în celulele care exprimă p53-GA239/C puternic stabilizat, sugerând că himerele sunt încă supuse omniprezentării induse de Mdm2. În conformitate cu noțiunea că p53 ubiquitinat este degradat rapid de proteazom, această scară nu a fost detectată în celulele care exprimă molecula de tip sălbatic.

Himerele p53-GAr sunt rezistente la degradarea indusă de Mdm2 și HPV-E6. (A) Celulele Saos-2 au fost transfectate cu 100 ng din plasmida codificată p53 indicată împreună cu 0, 100, 200 sau 400 ng dintr-o plasmidă de expresie Mdm2. Extractele celulare totale colectate după 16 ore au fost supuse analizei Western blot cu un anticorp monoclonal anti-p53. Este indicată scara speciilor p53 cu greutate moleculară mare. (B) Densitometria Western blot-urilor prezentate în A. (C) Celulele Saos-2 au fost transfectate cu 100 ng din plasmida codificată p53 indicată și 400 ng de pcDNA3 (-) control sau plasmidă de expresie HPV16-E6 (+) . Detalii experimentale ca în A. Sunt indicați markerii greutății moleculare. (D) Subunitățile S5a și S8 ale proteasomului uman 19S au fost exprimate în bacterii sub formă de proteine ​​de fuziune GST, imobilizate pe glutation Sefaroză și analizate în teste de legare a coloanei cu lizatele celulelor HeLa transfectate cu FLAG p53 (0) de tip sălbatic sau FLAG p53 conținând un GAr 239-aa (239). Western blots au fost sondate cu un anticorp monoclonal anti-p53. Este afișată o expunere scurtă de 10% din intrare (Stânga). Sunt indicate speciile de p53 care interacționează cu S5a și speciile de p53 cu greutate moleculară mare.

Apoi am testat dacă himerele p53 au fost, de asemenea, rezistente la proteoliză indusă de proteina E6 a HPV16. Cotransfecția celulelor Saos-2 cu p53 de tip sălbatic, împreună cu un exces de 4 ori de HPV16-E6 a dus la o scădere dramatică a expresiei p53, în timp ce himerele p53-GAr care conțin repetări lungi de 25 sau 239 aa au fost afectate doar modest (Fig. 2C). Stabilizarea nu a fost cauzată de o abrogare indusă de GAr a interacțiunii dintre E6 și p53, deoarece o proteină de fuziune GST-E6 a interacționat la fel de bine cu himere de tip sălbatic care conțin p53 și GAr în testele de tragere (datele nu sunt prezentate) . Efectul mai puternic al repetărilor în această configurație experimentală se explică probabil prin prezența nivelurilor fiziologice ale ligazei E6-AP în comparație cu supraexpresia uriașă a Mdm2.

Chimerele p53-GAr păstrează proprietățile funcționale ale tipului Wild p53.

Pentru a investiga dacă himerele GAr păstrează activitatea transcripțională a p53 de tip sălbatic, celulele Saos-2 au fost cotransfectate cu plasmide care codifică p53 și o plasmidă reporter care conține gena EGFP sub controlul unui element receptiv la p53. Exprimarea p53 de tip sălbatic a dus la activarea transcripției dependentă de doză, în care EGFP nu a fost indusă în celulele care exprimă mutantul de legare a ADN-ului p53 R273H (Fig. 3A) (30). Chimerele care conțin un GAr lung de 25 aa au fost la fel de active ca p53 de tip sălbatic, în timp ce himera p53-GA239/C a arătat o activitate transcripțională afectată care a atins ~ 55% din efectul p53 de tip sălbatic la cea mai mare concentrație de plasmidă testată. Gena p53-țintă p21 WAF/CIP1 a fost reglată în sus în celulele Saos-2 transfectate cu plasmide care exprimă p53 sau p53-GAr, confirmând în continuare competența de transactivare a himerelor (Fig. 3B).

Mdm2 poate inactiva p53 prin legarea la domeniul de activare transcripțională (31). Prin urmare, am întrebat dacă himerele stabile p53-GAr pot rămâne active transcripțional în prezența Mdm2. Expresia Mdm2 a redus inducerea p21 WAF1/CIP1 cu p53, p53-GA25/C și p53-GA239/C (Fig. 3C). Cu toate acestea, niveluri constant mai ridicate de p21 WAF1/CIP1 au fost detectate în celulele care exprimă himerele p53-GAr, ceea ce a fost mai evident în prezența excesului de 2 și 4 ori al plasmidei Mdm2.

P53 controlează proliferarea și supraviețuirea celulelor prin inducerea opririi ciclului celular G1/G2 și apoptoză (1). Prin urmare, am întrebat dacă himerele p53-GAr au păstrat aceste proprietăți funcționale ale p53. Exprimarea p53 sau a himerelor din celulele noastre Saos-2 utilizate în mod obișnuit a dus la o reducere a procentului de celule în G2/M și o creștere a celulelor în G1 (Fig. 3D). Efectul a fost specific deoarece celulele transfectate cu mutantul p53 R273H au prezentat o distribuție a ciclului celular identică cu cea a populației p53-negative (datele nu sunt prezentate). Cu toate acestea, apoptoza a fost indusă doar într-o proporție mică de celule care exprimă p53. S-a raportat că, în timp ce expresia scăzută a p53 induce oprirea ciclului celular, sunt necesare niveluri mai mari de expresie pentru inducerea apoptozei (32). Prin urmare, am apelat la o altă clonă Saos-2 care produce în mod constant o eficiență mai mare a transfecției. În plus, p53 de tip sălbatic și himera p53-GA239 au fost subclonate într-o plasmidă care exprimă EGFP pentru a permite detectarea directă a celulelor transfectate. Exprimarea p53 a indus o creștere de mai mult de 2 ori a procentului de celule apoptotice comparativ cu vectorul EGFP gol și s-a observat o creștere suplimentară în celulele care exprimă himera p53-GA239 (Fig. 3E).

Chimerele p53-GAr sunt stabilizate în celule cu cifră de afaceri p53 accelerată.

Proteoliza p53 accelerată a fost demonstrată în multe tipuri de celule tumorale care exprimă p53 de tip sălbatic. Prin urmare, am întrebat dacă himerele p53-GAr sunt stabilizate și funcționale active și în celulele tumorale care poartă tulpini oncogene de HPV sau exprimă niveluri de Mdm2 suficiente pentru a inactiva proteina endogenă. Analiza cifrei de afaceri a p53 în linia HeLa de carcinom cervical pozitiv HPV18 a demonstrat că, în timp ce p53 de tip sălbatic ectopic a avut un timp de înjumătățire doar puțin mai mare decât ≈20 min determinat pentru p53 endogen, himere conținând 25- sau 239-aa-lungime Domeniile GAr au avut un timp de înjumătățire semnificativ mai lung (Fig. 4A). Rezultate similare au fost obținute în două linii celulare de carcinom al colului uterin HPV16, CasKi și SiHa (datele nu sunt prezentate). Chimerele GAr au prezentat un timp de înjumătățire semnificativ prelungit și în linia celulară de osteosarcom U2OS (Fig. 4B) care exprimă niveluri ridicate de Mdm2 (13).

Chimerele p53-GAr sunt stabile în celulele tumorale cu degradare accelerată a p53. Linia celulară de carcinom a colului uterin HPV18-E6 pozitivă HeLa (A) sau linia celulară de osteosarcom Mdm2 care supraexprimă U2OS (B) a fost transfectată tranzitoriu cu FLAG p53 sau himerele FLAG p53-GAr indicate. După 16 ore, celulele au fost incubate cu 60 μg/ml de cicloheximidă, iar extractele celulare au fost recoltate după timpul de incubare indicat. Exprimarea p53 a fost detectată prin Western blot cu un anticorp monoclonal anti-p53. Sunt indicați produsele p53 endogene (end.) Și produsele ectopice FLAG p53.

Testarea formării coloniilor

Discuţie

Constatarea că GAr ar putea proteja p53 de degradarea indusă de două ligase ubiquitin care recunosc semnale de țintire independente sugerează că domeniul inhibitor poate interfera cu un eveniment comun în aval de ubiquitinare. Acest lucru a fost dedus anterior din observația că himerele EBNA4-GAr sunt ubiquitinate în mod eficient într-un sistem fără celule (17) și prin acumularea de himere IκBα-GAr ubiquitinate în extracte de celule tratate cu inhibitori ai enzimelor de debiquitinare (20). Este de remarcat faptul că, deși omniprezentarea acestor substraturi ar fi putut fi neafectată, doar himerele neconjugate au fost detectate în mod regulat în lizatele celulare, ceea ce ne-a determinat să speculăm că himerele GAr pot fi prinse într-un ciclu perpetuu de ubiquitinare și deubiquitinare care ar putea exclude interacțiunea cu proteazomul. Prin coexprimarea himerelor p53-GAr cu cantități mari de Mdm2, am observat acumularea de proteine ​​care conțin GAr poliubiquitinate în celule. Această acumulare susține noțiunea că domeniul inhibitor acționează asupra unui eveniment postubiquitinare.

În concluzie, am furnizat acum dovezi convingătoare că EBV GAr poate acționa ca un inhibitor selectiv al proteolizei dependente de ubiquitină, care contracarează o gamă largă de semnale de țintire și ligase de ubiquitină. Demonstrația că himerele p53-GAr rămân competente din punct de vedere funcțional sugerează că inserarea repetării virale ar putea oferi o strategie convenabilă pentru stabilizarea unei largi varietăți de proteine ​​care prezintă un interes potențial pentru terapiile de înlocuire a genelor.

Mulțumiri

Recunoaștem cu recunoștință sprijinul tehnic excelent al Marianne Jellne, Anthony Chen și Niloofar Rasti. Mulțumim Karen H. Vousden, Bert Vogelstein și Vladimir J. Bykov pentru darurile amabile ale reactivilor. Această investigație a fost susținută de subvenții acordate de Societatea suedeză a cancerului, Fundația suedeză pentru cercetarea strategică, Consiliul suedez de cercetare, Petrus și Augusta Hedlunds Stiftelse și Institutul Karolinska. SH. și N.P.D. au fost susținute de burse acordate de Programul de formare și mobilitate al Comisiei Europene (ERBFMRXCT960026). A.L. este membru al unui masterat comun/doctorat. Program între Academia Medicală din Letonia (AML) și Institutul Karolinska (KAMP).

Note de subsol

↵ § Cui trebuie adresate cererile de reimprimare. E-mail: nico.dantumamtc.ki.se .

Această lucrare a fost trimisă direct (pista II) la biroul PNAS.