Fanghao Hu

un Departament de Chimie, Columbia University, 3000 Broadway, New York, NY, SUA.

Lu Wei

un Departament de Chimie, Columbia University, 3000 Broadway, New York, NY, SUA.

Chaogu Zheng

b Departamentul de Științe Biologice, Universitatea Columbia, New York, NY, SUA.

Yihui Shen

un Departament de Chimie, Columbia University, 3000 Broadway, New York, NY, SUA.

Wei Min

un Departament de Chimie, Columbia University, 3000 Broadway, New York, NY, SUA.

c Institutul Kavli pentru Știința Creierului, Universitatea Columbia, New York, NY, SUA.

Date asociate

Abstract

Introducere

Metabolismul colinei îndeplinește roluri critice în funcția biologică a tuturor organismelor vii. Este implicat în diferite procese vitale, cum ar fi formarea membranei celulare, semnalizarea, transportul lipidelor, sinteza neurotransmițătorului acetilcolină și reacția de transfer a metilului. 1 Metaboliții importanți care conțin colină includ fosfocolina cu molecule mici (PC), glicerofosfocolina (GPC), fosfatidilcolina legată de lipide (PtC) și sfingomielina (SM).

Aici raportăm imagistica in vivo neinvazivă a metaboliților care conțin colină cu rezoluție subcelulară prin microscopie stimulată de împrăștiere Raman (SRS) (Figura 1a), prin încorporarea metabolică a colinei deuterate (trimetil-D9). Odată preluată de celule, colina este metabolizată în principal prin calea Kennedy în molecule mici PC, GPC și fosfolipide de colină legate de membrană (Figura 1b). Metabolismul activat al colinei în tumoră și consumul ridicat de colină în timpul dezvoltării prenatale vor duce la absorbția activă a colinei D9 încorporate în rezerva totală de metaboliți ai colinei într-un echilibru dinamic, care servește ca biomarker distinct pentru cancer, funcția neuronală și dezvoltarea embrionară.

imagistica

Imagistica de împrăștiere Raman stimulată (SRS) a metaboliților colinei prin încorporarea metabolică a colinei deuterizate D9. (a) Configurarea microscopului SRS. Suprapunerile spațiale și temporale Stokes și grinzile pompei duc la activarea vibrațională selectivă în cadrul probei în condiții rezonante. (b) Incorporarea colinei D9 în bazinul celular de metaboliți ai colinei servește ca biomarker metabolic în progresia tumorii, funcția creierului și dezvoltarea embrionară. (c) Diagrama energetică împreună cu spectrele laser de intrare și ieșire ale SRS.

rezultate si discutii

Spectre Raman spontane ale celulelor HeLa suplimentate cu (negru) și fără (albastru) D9-colină și 100 mM D9-colină (roșu) în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS). Vârful de 2188 cm -1 din regiunea Raman silențioasă este aleasă pentru imagistica SRS.

Imagistica cu celule vii a metaboliților D9-colină este demonstrată mai întâi cu SRS în linia celulară HeLa a cancerului de col uterin uman. Într-adevăr, spectrul Raman spontan al celulelor HeLa suplimentat cu 10 mM D9-colină timp de 48 de ore prezintă același model de vârfuri Raman în regiunea silențioasă celulară ca și pentru D9-colină în soluția PBS (Figura 2), verificând absorbția celulară a D9-colină. Pe baza intensității Raman (Figura 2, spectrele negre și roșii), se estimează că metaboliții medii intracelulari care conțin colină D9 sunt

Imagini SRS ale metaboliților care conțin colină D9 în diferite linii celulare de cancer (a - c) și embrionare (d - e). (a) Imagine de 2188 cm -1 a metaboliților D9-colină (colină) pe celule HeLa vii cultivate cu 10 mM D9-colină timp de 48 de ore. Semnalul puternic este văzut la regiunile din jurul nucleului (indicate prin săgeți), cum ar fi reticulul endoplasmatic. (b) 2188 cm -1 imagine colină pe celule HeLa vii cultivate în mediu fără colină D9. (c - e) 2188 cm −1 imagini colină pe celule U2OS de osteosarcom uman os viu (c), celule HEK293T renale embrionare umane vii (d) și celule NIH3T3 fibroblaste embrionare vii de șoarece (e) cultivate cu 5 sau 10 mM D9-colină timp de 48 de ore. Imaginile de 1655 cm -1 (amida I din proteine) și imaginile de 1900 cm -1 (colină-off) afișează același set de celule ca în imaginile colină-pe. Canalele colină-pornire și colină-oprire sunt reprezentate în condiții experimentale identice. Scara de culoare din canalul amidă este de 3 ori mai mare decât alte canale. Barele de culoare din canalele colinei corespund unui interval de concentrație D9-colină de la 0 la cel mai întunecat la 78,7 mM la cel mai strălucitor. Bara de scalare: 10 µm.

Pentru a verifica îmbogățirea colinei D9 în cantitatea totală de metaboliți ai colinei, în special fosfolipidele colinei din aval, am supus partea imobilă a semnalului colinei SRS reținută după fixare la teste de fosfolipază. În celulele fixe incubate cu fosfolipază C, grupele de cap de fosfat de colină sunt scindate de fosfolipide sub cataliză Ca 2+ și se poate observa un semnal mic în canalul de colină, similar cu canalul de colină (Figura S3b), în timp ce semnalul rămâne în cea mai mare parte atunci când nu este prezentă fosfolipază (Figura S3a) sau EDTA se adaugă pentru a chela ionul Ca 2+ (Figura S3c). Acest lucru confirmă încorporarea D9-colinei în fosfolipidele din aval PtC și SM și, prin urmare, rezerva totală de metaboliți ai colinei. În comparație cu metoda raportată anterior pentru a imagina fosfolipidele de colină din membrană prin etichetare fluorescentă bioortogonală, imagistica SRS directă aici nu conține fixare celulară, colorare cu vopsea și spălare extinsă. Astfel, abordarea noastră nu este compatibilă numai cu imagistica cu celule vii, ci evită pierderea unor specii difuzive importante care conțin colină și fosfolipide de suprafață ale membranei în timpul proceselor de fixare și colorare, oferind astfel o imagine cuprinzătoare și precisă a metaboliților care conțin colină în interiorul celulelor.

Imagistica SRS a metaboliților D9-colină în neuronii hipocampici primari de șoarece. (a) Spectru spontan Raman al neuronului cultivat cu 10 mM D9-colină timp de 48 de ore. (b) Imaginea colinei de 2188 cm -1 arată clar distribuția metaboliților care conțin colină D9 în rețeaua neuronală. (c) Imaginea mărită a unui singur neuron arată distribuția subcelulară a metaboliților D9-colină. Imaginile amidă afișează același set de celule ca în imaginile colină. Scara culorilor din canalul amidă este de 2 ori mai mare decât alte canale. Barele de culoare din canalele colinei corespund unui interval de concentrație D9-colină de la 0 la cel mai întunecat la 78,7 mM la cel mai strălucitor. Bara de scalare: 10 µm.

Imagistica SRS a încorporării colinei D9 în larvele C. elegans. (a) Ca martor, sa imaginat larva vie de C. elegans de tip sălbatic viu, fără niciun tratament și s-a găsit un fundal întunecat în imaginea colinei de 2188 cm -1. (b) 100 mM D9-colină a fost injectată în gonadele animalelor tinere adulte și larva F1 vie a fost realizată în stadiul L1. Canalul de colină de 2188 cm -1 prezintă un model de semnal similar cu cel al canalului lipidic CH2 la 2845 cm -1, sugerând localizarea colinei D9 în membrana celulară. Amidele, lipidele CH2 și canalele colină-off afișează aceeași zonă ca în canalul colină-pe. Scara de culoare din canalul amidic este de 6 ori mai mare decât canalele colinei. Barele de culoare din canalele colinei corespund unui interval de concentrație D9-colină de la 0 la cel mai întunecat la 78,7 mM la cel mai strălucitor. Bara de scalare: 5 µm.

Concluzii

În acest articol, am demonstrat cu succes imagistica cu celule vii a grupului de metaboliți care conțin colină (inclusiv colină liberă, PC, GPC, PtC și SM) în mai multe linii de cancer, celule embrionare, neuroni primari și larve C. elegans cu rezoluție subcelulară, prin folosind împrăștierea Raman stimulată cuplată cu încorporarea metabolică marcată cu izotopi. Celulele canceroase s-au dovedit a avea o distribuție semnificativă a metaboliților colinei în interiorul nucleului în comparație cu celulele necanceroase, care ar putea influența evenimentele de semnalizare mediate de lipide endonucleare. Incorporarea colinei atât în ​​corpul celular, cât și în procesele neuronale a fost vizualizată în neuronii hipocampici, unde metaboliții colinei sunt distribuiți mai uniform decât proteina. În larvele C. elegans, metaboliții care conțin colină au fost localizați în regiunea faringelui, ceea ce este în concordanță cu procesul său de organogeneză autonomă.

Abilitatea de a imagina metaboliții colinei în celule vii și organisme cu rezoluție ridicată, așa cum se arată în acest studiu, ne va pregăti să studiem mai bine transformarea malignă a cancerului și dezvoltarea embrionară în sisteme complexe. Recent, colina D9 a fost utilizată ca un identificator metabolic la om. 36 Cu excelenta biocompatibilitate a încorporării izotopului stabil 32 și microscopie SRS la animale și oameni vii, 37 abordarea noastră a imagisticii vibraționale neliniare bazate pe izotopi ar găsi aplicații viitoare în diagnosticul bolii legate de colină și evaluarea tratamentului in vivo.