Elena R. Nikitina

2 Institutul Sechenov de Fiziologie și Biochimie Evolutivă, Academia Rusă de Științe, St. Petersburg, Rusia

endogeni

Anton V. Mihailov

3 Facultatea de Medicină din St. Universitatea de Stat din Petersburg și Maternitatea nr. 17, St. Petersburg, Rusia

Ekaterina S. Nikandrova

3 Facultatea de Medicină din St. Universitatea de Stat din Petersburg și Maternitatea nr. 17, St. Petersburg, Rusia

Elena V. Frolova

2 Institutul Sechenov de Fiziologie și Biochimie Evolutivă, Academia Rusă de Științe, St. Petersburg, Rusia

Artem V. Fadeev

2 Institutul Sechenov de Fiziologie și Biochimie Evolutivă, Academia Rusă de Științe, St. Petersburg, Rusia

Vera V. Shman

3 Facultatea de Medicină din St. Universitatea de Stat din Petersburg și Maternitatea nr. 17, St. Petersburg, Rusia

Victoria Y. Shilova

1 Institutul Național pentru Îmbătrânire, Institutele Naționale de Sănătate, Baltimore, MD, SUA

Natalia I. Tapilskaya

5 Departamentul de Obstetrică și Ginecologie, Școala de Medicină Pediatrică, St. Petersburg, Rusia

Iosif I. Shapiro

4 Departamentul de Medicină, Universitatea din Toledo, OH, SUA

Olga V. Fedorova

1 Institutul Național pentru Îmbătrânire, Institutele Naționale de Sănătate, Baltimore, MD, SUA

Alexei Y. Bagrov

1 Institutul Național pentru Îmbătrânire, Institutele Naționale de Sănătate, Baltimore, MD, SUA

Abstract

fundal

Marinobufagenina (MBG), un steroid cardiotonic bufadienolidic, induce fibroza cardiovasculară. Deoarece nivelurile de MBG în preeclampsie sunt crescute, iar anticorpul monoclonal anti-MBG reduce tensiunea arterială (TA) într-un model de preeclampsie de șobolan, am emis ipoteza că în preeclampsie, nivelurile crescute de MBG ar fi asociate cu dezvoltarea fibrozei în circulația feto-placentară și cu afectarea relaxării vasculare.

Metodă

Am studiat 16 pacienți cu preeclampsie (sistolică BP150 +/- 4 mmHg; 28 +/- 2 ani, 37 +/- 1 săptămână vârstă gestațională) și 14 femei gestante cu vârsta gestațională normală (BP sistolică 112 +/- 2 mmHg).

Rezultate

Placentae

Arterele ombilicale

Studii contractile izolate ale arterei ombilicale

Inelele denotate de endoteliu ale arterelor ombilicale (2,5-4,0 mm lățime) au fost suspendate la o tensiune de repaus de 3,0 g într-o baie de organe de 15 ml (Ugo Basile, Italia) și superfuzate la 37oC cu o soluție conținând în mmol/l: NaCl 130, KCl 4.0, CaCl2 1,8, MgCl2 1,0, NaH2PO4 0,4, NaHCO3 19 și glucoză 5,4 și gazate cu un amestec de 95% O2 și 5% CO2 (pH 7,45) și s-au înregistrat contracții izometrice așa cum sa raportat anterior [19] . Inelele arteriale au fost restrânse de două ori cu 80 mmol/l KCl și, după relaxare completă, au fost studiate răspunsurile contractile la endotelina-1 (0,1-10 nmol/l). Pentru a investiga impactul preeclampsiei și al tratamentului MBG asupra relaxării arterelor ombilicale, am studiat efectul creșterii concentrațiilor de nitroprusidă de sodiu (1 nmol/l - 1umol/l) după constricția inelelor vasculare cu 100 nmol/l endotelină-1 . Forța contracțiilor a fost exprimată ca procent de răspuns vasoconstrictor la 80 mmol/l KCl. Procentul de relaxare a fost calculat în raport cu platoul forței contractile care a fost atins ca răspuns la 100 nmol/l endotelină-1.

Western blot

Nivelurile a doi markeri preeclampsici endoglin-1 (anticorp monoclonal de șoarece MAB0702, Santa-Cruz Biotechnology; 1: 500) și sFlt1 (anticorp monoclonal de șobolan 2Q1707, Santa-Cruz Biotechnology; 1: 250) au fost determinate în omogenate placentare. În membranele din arterele ombilicale am determinat nivelurile de Fli-1 (anticorp policlonal de iepure; Santa-Cruz Biotechnology; 1: 500), procolagen-1 (anticorp policlonal de capră; Santa Cruz Biotechnology; 1: 200) și colagen-1 (policlonal de capră) anticorp, Southern Biotechnology; 1: 200). Proteinele solubilizate au fost separate prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă 10% Tris-Glicină și transferate într-o membrană de nitroceluloză și au fost vizualizate folosind anticorpi specifici de mai sus, urmate de incubație cu antimouse conjugat cu peroxidază sau antiserabit (Amersham Corp., 1: 1000), sau antiserat antiserat (Santa Cruz Biotechnology, 1: 1000). Benzile au fost vizualizate prin expunerea de 1-15 minute la nitroceluloză pe membrană pe filmul Kodak SAR5. Se normalizează nivelurile de Fli-1, procolagen-1 și colagen-1 împotriva nivelurilor de gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază (GAPDH), membranele au fost decupate și retondate cu un anticorp monoclonal de iepure (mAb) împotriva GAPDH uman (Cell Signaling Technology, Inc. Danvers, MA).

Activitatea Na/K-ATPaza a eritrocitelor

Activitatea eritrocitelor Na/K-ATPaza a pacienților cu preeclampsie și a femeilor cu sarcină necomplicată a fost determinată în prezența și absența mAb anti-MBG 3E9, după cum sa raportat anterior [20]. Concentrația de mAb utilizată (0,85 mg/ml) a fost cea care a inversat ex vivo inhibarea 75% indusă de MBG a Na/K-ATPazei renale de șobolan și a redus in vivo TA la șobolanii Dahl-S hipertensivi, după cum s-a raportat și anterior [11].

Imunoanalize

Marinobufagenina a fost măsurată folosind o analiză fluoroimuno [analiză FluoroImmunoAssay (DELFIA)] pe baza unui mAb anti-MBG 4G4 murin descris recent în detaliu [11]. Această analiză se bazează pe competiția dintre antigenul imobilizat (MBGglicozid-tiroglobulină) și MBG, CTS endogen sau alți reactanți încrucișați din eșantion pentru un număr limitat de site-uri de legare pe un mAbs anti-MBG. Anticorpul antimouse secundar de capră marcat cu europiu a fost obținut de la Perkin-Elmer (Waltham, Massachusetts, SUA). Reactivitatea încrucișată de 4G4 mAb este (%): MBG - 100; marinobufotoxină - 43; cinobufotalin - 40; telocinobufagină - 14; resibufagenină - 0,5; bufalină - 0,08; cinobufagină - 0,07; digoxină - 0,03; ouabain - 0,005; ouabagenin - 0,001; digoxigenină - 0,004; proscillaridina A, digitoxina, aldosteronul, progesteronul, prednisonul, corticosteronul și tiroglobulina - mai puțin de 0,001.

Analize statistice

Datele sunt prezentate ca mean_SEM. Analizele statistice au folosit testul t cu două cozi sau ANOVA unidirecțional, urmat de un test t post-hoc utilizând corecția Newman - Keuls pentru comparații multiple. O valoare P pe două fețe mai mică de 0,05 a fost considerată statistic semnificativă (Graph-Pad Instat și GraphPad Prism, GraphPad Software Inc., San Diego, California, SUA).

REZULTATE

Șaisprezece paciente cu preeclampsie (vârstă, 28 ± 2 ani; vârstă gestațională, 37 ± 1 săptămâni, excreție urinară de proteine, 2,12 ± 0,46 g/24 ore) și 14 subiecte gravide normotensive (vârstă, 26 ± 1 ani; vârstă gestațională, 39 ± 1 săptămână) au fost înscriși în studiu. Așa cum se ilustrează în Figura 1, pacienții cu preeclampsie au demonstrat o creștere a tensiunii arteriale sistolice și diastolice (Figura 1A, B) și au fost însoțiți de niveluri crescute de MBG în plasmă și placente (Figura 1C, D). La pacienții cu preeclampsie, nivelurile crescute de MBG au fost asociate cu o inhibare substanțială a Na/K-ATPazei în eritrocite, comparativ cu cele la subiecții cu sarcini necomplicate, și pretratarea eritrocitelor preeclamptice cu 3E9 mAb anti-MBG restaurat Na/K -Activitatea ATPase (Figura 1E). Nivelurile a doi factori angiogenici și markeri ai preeclampsiei, endoglin-1 și sFlt1, au fost semnificativ crescute în placenta preeclamptică în comparație cu cele din placentă la subiecții cu sarcini necomplicate (Figura 1F, G).