Laura G. Goetz

Departamentul de Obstetrică, Ginecologie și Științe ale Reproducerii, Școala de Medicină Yale, New Haven, Connecticut

Ramanaiah Mamillapalli

Departamentul de obstetrică, ginecologie și științe ale reproducerii, Școala de medicină Yale, New Haven, Connecticut

Hugh S. Taylor

Departamentul de Obstetrică, Ginecologie și Științe ale Reproducerii, Școala de Medicină Yale, New Haven, Connecticut

Abstract

INTRODUCERE

Endometrioza este una dintre cele mai frecvente tulburări ginecologice la femeile în vârstă de reproducere [1]. Se caracterizează prin depunerea și proliferarea celulelor endometriale sau a țesutului în afara cavității uterine [2, 3]. Simptomul major al endometriozei este durerea pelviană, care afectează 50% dintre pacienți [4], urmată de infertilitate, care este raportată la 40% -50% dintre pacienți [5]. Aceste simptome pot afecta grav calitatea vieții unei femei [6] ]. Endometrioza este o tulburare variată și complexă, pacienții raportând adesea simptome difuze care nu au legătură cu reproducerea, iar cauza precisă și fiziopatologia nu sunt încă bine înțelese [1, 7]. Femeile cu boală se plâng adesea de pierderea în greutate, alergii, oboseală, inflamație și disfuncție intestinală.

Cauza acestor simptome inexplicabile anterior nu este cunoscută, dar poate proveni din dereglarea mai multor căi moleculare în mai multe sisteme de organe din afara tractului reproductiv. Existența unui indice de masă corporală mai scăzut (IMC) la femeile cu endometrioză comparativ cu cele fără boală este bine stabilită [8-15]. Niciun studiu anterior nu a investigat efectele endometriozei asupra ficatului. În prezent nu se știe dacă fenotipul IMC scăzut observat la femeile cu endometrioză este direct atribuibil bolii și, dacă da, prin ce mecanism. Aici am căutat să determinăm dacă endometrioza ar putea provoca dereglare metabolică.

Ficatul este un punct major al reglării metabolice și un mediator central pentru menținerea homeostaziei energetice [4, 16-19]. Expresia genei ficatului s-a dovedit a fi perturbată în mod specific la femeile cu obezitate [20-22]. Endometrioza creează un mediu inflamator modificat [23-25] care ar putea modifica expresia genelor în organele îndepărtate. Într-adevăr, am demonstrat anterior că endometrioza afectează expresia genelor uterine [26], sugerând că endometrioza poate duce la modificarea expresiei genelor și în organele neproductive. Modificări ale expresiei genelor hepatice datorate endometriozei nu au fost încă raportate; cu toate acestea, s-a demonstrat că dereglarea genei hepatice modifică IMC la un model de șoarece [27], iar obezitatea a fost asociată clinic cu modificarea expresiei genice în ficat [28, 29]. Acest lucru face din ficat un candidat interesant pentru implicarea într-o posibilă componentă metabolică a endometriozei.

Aici am comparat greutatea corporală, compoziția corporală și expresia genelor hepatice la șoareci cu endometrioză indusă chirurgical cu cele ale șoarecilor de control care au fost supuși unei intervenții chirurgicale simulate. Am identificat întreruperea metabolică indusă de endometrioză asociată cu greutatea corporală redusă și grăsimea. Aceste descoperiri pot explica greutatea corporală scăzută observată clinic la femeile cu endometrioză.

MATERIALE ȘI METODE

Toate experimentele pe animale au fost efectuate în conformitate cu o aprobare din protocolul Comitetului de îngrijire a animalelor de la Universitatea Yale, utilizând un total de 30 de șoareci. Endometrioza a fost indusă la șoareci femele C57BL/6 în vârstă de 12 săptămâni (n = 6) prin suturarea a două secțiuni uterine, fiecare constând dintr-o jumătate de corn uterin de la un donator, în cavitatea peritoneală conform tehnicilor raportate anterior [30, 31 ]. Au fost efectuate intervenții chirurgicale la șoareci martor (n = 6). Mâncarea a fost consumată ad libitum de toate animalele și ambele grupuri au primit același chow. Șoarecii au fost cântăriți săptămânal pe o cântare portabilă (Uline), iar greutățile corporale au fost înregistrate la cel mai apropiat 0,1 de gram, începând cu 1 săptămână după operația de inducție. Absorptiometria cu raze X cu energie duală (DEXA; GE Medical Systems) a fost efectuată la 7 săptămâni după operație. Într-un alt set de șoareci femele C57BL/6 de 9 săptămâni, endometrioza a fost indusă în conformitate cu aceleași proceduri chirurgicale (n = 9 în fiecare grup). Acest set de șoareci a fost eutanasiat prin dislocare cervicală după asfixierea CO2 la 21 săptămâni, iar ficatul a fost colectat și depozitat în ARNlater (Qiagen) la -80 ° C pentru izolarea ARN și proteine. Prezența leziunilor persistente de endometrioză a fost confirmată la necropsie.

Izolarea ARN-ului

Țesutul hepatic (100 mg) a fost omogenizat în 1 ml de reactiv TRIzol (Invitrogen). Omogenatele au fost ținute pe gheață timp de 5 minute, apoi s-au adăugat 0,2 ml de cloroform la fiecare și probele au fost agitate timp de 15 secunde, incubate la temperatura camerei timp de 3 minute și centrifugate la 12.000 rpm la 4 ° C timp de 15 minute. Apoi, stratul apos a fost transferat într-un tub proaspăt și ARN-ul a fost precipitat prin adăugarea a 0,5 ml alcool izopropilic, incubat la temperatura camerei timp de 10 min și centrifugat la 10.000 rpm timp de 15 min; apoi peletele de ARN au fost colectate, spălate cu 75% etanol și dizolvate în apă fără RNază. ARN-ul total a fost purificat folosind trusa de curățare RNeasy (Qiagen) și cuantificat printr-un spectrofotometru NanoDrop. ARN-ul purificat a fost imediat utilizat pentru sinteza ADNc și apoi supus analizei microarray sau stocat la -80 ° C până când a fost utilizat mai târziu.

Mouse Gene Microarray

ARN total de înaltă calitate (250 ng) a fost supus kitului de reactivi WT PLUS (Affymetrix) urmând instrucțiunile producătorului. Pe scurt, ARN-ul total a fost amplificat pentru a crea ADNc care a fost utilizat pentru transcrierea in vitro pentru a crea ARN complementar (ARNc). ARNc a fost curățat folosind purificarea mărgelelor și cuantificat. ARNc (15 μg) a fost utilizat cu un primer aleatoriu pentru a genera un al doilea ciclu de ADNc de direcție senzorială pe prima catenă. ADNc a fost purificat utilizând metoda de curățare a mărgelei și cuantificat. ADNc monocatenar (sscDNA; 5,5 μg) a fost apoi fragmentat enzimatic folosind ADP și UDG, folosind un kit de etichetare terminal (Affymetrix) și rulat pe un bioanalizator (Agilent) pentru a asigura dimensiunea corectă a transcriptului. Materialul fragmentat a fost marcat ulterior folosind deoxinucleotidil transferaza terminală, plasat într-un cocktail de hibridizare și hibridizat folosind matrice GeneChip de șoarece 2.0 ST peste noapte la 45 ° C. Tablourile au fost spălate și colorate folosind stația fluidică model 450 și apoi scanate folosind scanerul model 3000 7G (ambele Affymetrix). Software-ul consolei de expresie Affymetrix a fost utilizat pentru a genera date brute și normalizate pentru analiza din aval. MATLAB (MathWorks) a fost folosit pentru a analiza ieșirea datelor.

Analiza PCR cantitativă în timp real

ARN purificat (50 ng) a fost transcris invers într-un amestec de reacție de 20 pl folosind un kit de sinteză iScript cDNA (Bio-Rad Laboratories). PCR cantitativă în timp real (qPCR în timp real) a fost efectuată folosind SYBR Green (Bio-Rad) și optimizată în sistemul de detectare MyRQ monocolor în timp real PCR (Bio-Rad). Exemple de secvențe utilizate pentru genele respective sunt listate în Tabelul 1. Specificitatea transcriptului amplificat și absența primilor-dimeri a fost confirmată printr-o analiză a curbei de topire. Expresia genică a fost normalizată la cea a β-actinei. Expresia relativă a ARNm a fost calculată utilizând metoda pragului de ciclu comparativ (Ct) (2 - ΔΔ Ct) [32, 33]. Toate experimentele au fost efectuate de trei ori și fiecare în trei exemplare.

TABELUL 1

Secvențe primare utilizate pentru qRT-PCR.

masă

Analiza Western Blot

Absorptiometre cu raze X cu energie duală

Absorptiometria cu raze X cu energie duală a fost efectuată la șoareci 7 săptămâni după operație, folosind un Lunar PIXImus (GE Medical Systems). Șoarecii au fost anesteziați utilizând 50 mg/kg ketamină (Fort Dodge Animal Health) și 10 mg/kg xilazină (Lloyd), prin injecție intraperitoneală.

Analize statistice

Greutatea corporală și conținutul de grăsime corporală sunt prezentate ca parcele de cutie. Rezultatele qPCR în timp real sunt medii ± SEM. Distribuția variabilelor a fost investigată folosind testul Kolmogorov-Smirnov. Toate analizele statistice au fost efectuate de ANOVA unidirecțional utilizând software-ul Prism versiunea 4.00 (GraphPad), iar o valoare P de 0,05 sau mai puțin a fost considerată semnificativă. Genele de interes ale microarray-ului au fost determinate utilizând criterii de schimbare a pliurilor mai mari de 1,5 și o valoare P mai mică de 0,05.

REZULTATE

Am măsurat greutățile corporale ale șoarecilor model de endometrioză și șoarecilor de control chirurgical simulat săptămânal și am comparat modificările greutății nete în timp, valoarea inițială fiind greutatea șoarecelui la 1 săptămână după inducția chirurgicală. Toți șoarecii s-au îngrășat în perioada postchirurgicală, așa cum era de așteptat la șoarecii tineri. Cu toate acestea, creșterea în greutate a crescut pentru grupul de endometrioză, în timp ce greutatea corporală a controalelor a continuat să crească (Fig. 1 A). Începând cu 6 săptămâni după intervenția chirurgicală, am constatat că controalele au avut o creștere semnificativ mai mare a greutății corporale decât șoarecii endometriozici (P = 0,006) (Fig. 1 B).

MASA 2

Selecția genelor din microarrays. A

Rezultatele microarray-ului pentru cele 6 gene de interes au fost confirmate prin qPCR în timp real (Fig. 2 A) și analiza Western blot (Fig. 2 B). Așa cum se arată în Figura 2 A, s-a observat o expresie crescută a mai multor gene, inclusiv Cyp2r1 (10,0 ori), Fabp4 (5,4 ori), Mrc1 (4,3 ori) și Rock2 (8,9 ori). Scăderea expresiei genice a fost observată la Igfbp1 (-333-ori) și Mmd2 (-4,5-ori). Am determinat apoi că nivelurile de mARN modificate, determinate de qPCR în timp real, au dus la modificări similare în expresia proteinelor prin analiza Western blot, așa cum se arată în Figura 2 B. Am decis, de asemenea, să investigăm expresia relativă a leptinei (Lep) și a peroxizomului receptor activat de proliferatori gamma (Pparg), care sunt gene metabolice esențiale implicate în aceleași căi ca și genele identificate în microarray. Așa cum se arată în Figura 2 C, expresia genică a fost crescută pentru Lep (16,0 ori) și Pparg (17,6 ori) la șoareci cu endometrioză comparativ cu cei de la șoareci martor. Creșterea nivelurilor de ARNm pentru Lep și Pparg a fost confirmată în continuare prin Western blot, așa cum se arată în Figura 2 D, unde nivelurile de proteine ​​au fost crescute la șoareci cu endometrioză comparativ cu cei din controalele simulate.

Întreruperea expresiei genei hepatice este specifică. ARN-ul a fost extras din țesutul hepatic colectat de la șoareci de șir chirurgical și șoareci în care a fost indusă endometrioza. Rezultatele qPCR în timp real din ARNm hepatic prezintă niveluri comparabile de expresie genică a fibrinei, protrombinei, Ldha, Got2, albuminei și Adipoq (adiponectină) între endometriozăE) și control (C) grupuri. Datele sunt expresia relativă a schimbării ori în comparație cu cea din controalele chirurgicale simulate, iar nivelurile de expresie ale tuturor genelor au fost normalizate la cele ale β-actinei. Barele din fiecare grafic sunt medii ± SEM din două experimente individuale, fiecare realizat în triplicat (n = 6 șoareci per grup). Niciuna dintre diferențe nu a fost semnificativă statistic.

DISCUŢIE

În acest studiu, am demonstrat, într-un model animal, că endometrioza a dus la același fenotip IMC scăzut ca cel observat clinic la femeile cu endometrioză. Scăderea greutății corporale în grupul de endometrioză a fost susținută în continuare de scanarea DEXA, care a relevat că conținutul total de grăsime corporală a fost semnificativ mai mic în grupul de endometrioză decât în ​​grupul de control simulat. Această constatare afirmă faptul că corelația clinică observată anterior este de fapt legată cauzal de endometrioză.

De asemenea, am expus primele dovezi ale unui mecanism molecular care să explice IMC scăzut observat la femeile cu endometrioză. Aceste descoperiri au implicații atât pentru înțelegerea, cât și pentru tratamentul endometriozei. Modificările genei hepatice au fost specifice unui set definit de căi metabolice. Deși aceste gene neregulate au fost identificate folosind un model de șoarece, căile metabolice identificate sunt extrem de conservate între șoareci și oameni. Faptul că șoarecii noștri au prezentat, de asemenea, o greutate corporală mai mică decât cea a controalelor susține relevanța clinică a acestui mecanism molecular.

De asemenea, am căutat să determinăm dacă endometrioza a afectat expresia altor gene metabolice din ficat care poate nu au fost detectate de către matrice. Am investigat expresia relativă a câtorva gene metabolice esențiale care funcționează în aceleași căi ca și genele identificate. Leptina are un rol demonstrat în stabilirea sațietății și modularea consumului de alimente și a poftei de mâncare [56, 57] și s-a demonstrat că Pparg reglează metabolismul acizilor grași și al glucozei [58]. Atât Lep, cât și Pparg au fost semnificativ crescute în modelul nostru murin de endometrioză comparativ cu martorii. Studiile anterioare au raportat creșterea nivelului de leptină la femeile cu endometrioză și au emis ipoteza că leptina poate promova stabilirea și proliferarea leziunilor endometriale [59]. De asemenea, s-a arătat că șobolanii tratați cu rAAV-leptină au menținut o greutate corporală mai mică decât șobolanii netratați [60]. Cu toate acestea, rezultatele noastre sugerează că endometrioza crește expresia leptinei mai degrabă decât leptina care duce la endometrioză; endometrioza contribuie la modificări fiziologice care favorizează greutatea corporală scăzută.

Funcția hepatică, în afara homeostaziei energetice, a fost normală. S-a dovedit că neregularitatea expresiei genelor este specifică acelor gene metabolice. Nu au fost afectate majoritatea genelor hepatice examinate, inclusiv albumina, factorii de coagulare fibrină și protrombină și enzimele Got2 și Ldha. De asemenea, am comparat nivelurile de ARNm pentru adiponectină, un alt hormon metabolic major, pentru a demonstra specificitatea perturbării metabolice anorexigenice. Nu au existat diferențe între expresia adiponectinei în modelul endometriozei și cea din grupul de control fals, sugerând că există un mecanism precis de întrerupere metabolică cauzată de endometrioză, care implică leptină și nu adiponectină.

Pe scurt, demonstrăm că endometrioza duce la scăderea greutății corporale și la întreruperea expresiei genei hepatice. Efectul vizează selectiv un număr limitat de gene asociate metabolismului. Este posibil ca aceste modificări ale metabolismului hepatic să contribuie la un IMC scăzut observat la femeile cu endometrioză, demonstrând o componentă metabolică necunoscută anterior a acestei boli. Aici oferim dovezi că endometrioza este o boală metabolică, sistemică și multi-organică.