1 Laborator de biologie moleculară, Asociația de investiții medicale în nutriție, Spitalul de pediatrie, Centrul Medical Național Siglo XXI, IMSS, Etajul 4, Avenida Cuauhtémoc Nr. 330, Colonia Doctores, Delegación Cuauhtémoc, 06725 México, DF, Mexic

inflamatia

2 Serviciul de distrofie electrodiagnostică și musculară, Institutul Național de Reabilitare, Mexic, DF, Mexic

Abstract

1. Introducere

Pacienții cu DMD prezintă de obicei întârzieri motorizate generalizate și dificultăți de mers în copilăria timpurie. Slăbiciunea musculară este progresivă, provocând pierderea ambulanței la începutul adolescenței (între 9 și 12 ani) [1]. Unele scale de evaluare, cum ar fi scala Vignos, au fost utilizate pentru a evalua funcția motorie a bolilor neuromusculare. Scala Vignos oferă informații despre gradul de dependență funcțională a pacientului și măsoară funcția extremităților inferioare [8]. Pentru a susține această evaluare, se utilizează biomarkeri clinici circulanți, cum ar fi creatin kinaza (CK), unde nivelurile ridicate de CK reflectă leziuni musculare. Cu toate acestea, este important să se ia în considerare faptul că nivelurile de CK nu sunt fiabile, deoarece acestea variază considerabil în mai multe condiții de stres independente, nu neapărat asociate cu leziuni musculare [9].

În plus, procesul de inflamație ar putea epuiza ciclurile de degenerare și regenerare ale fibrei musculare, provocând înlocuirea fibrelor musculare cu țesut conjunctiv și adipos [10]. Țesutul adipos acumulat în țesutul muscular poate duce la modificări metabolice, cum ar fi obezitatea. Este bine cunoscut faptul că pacienții cu DMD dezvoltă obezitate de la vârsta de 7 ani [11] nu numai datorită tratamentului cu glucocorticoizi așa cum am raportat anterior. Un eșantion de pacienți cu DMD (

) care nu luau medicamente, inclusiv glucocorticoizi, au demonstrat 18,3% subponderal, 22,7% supraponderal și 68% obezitate [12]. Este bine cunoscut faptul că obezitatea este asociată cu o inflamație de grad scăzut a țesutului adipos alb datorită secreției de citokine proinflamatorii, cum ar fi TNF.-α, IL-1 și IL-6 [13-15]. În același mod, proteina C-reactivă (CRP) este, de asemenea, crescută în serul subiecților obezi. Deși CRP nu este o citokină, este un marker inflamator util pentru obezitate [15, 16].

Alte molecule asociate cu obezitatea sunt leptina și adiponectina. S-a demonstrat că leptina este crescută la copiii obezi, în timp ce adiponectina este scăzută. De asemenea, leptina are o relație pozitivă cu CRP și este legată de cantitatea de grăsime corporală [16].

Inflamația cronică cauzată de leziuni musculare sau din cauza obezității la pacienții cu DMD are un impact important asupra progresiei bolii [10]. Identificarea stării inflamatorii în timpul progresiei distrofiei este importantă din punct de vedere clinic, deoarece va fi utilă pentru detectarea gradului de afectare musculară, crescând posibilitatea de a propune intervenții timpurii indiferent de originea inflamației, indiferent dacă este vorba de afectarea musculară sau de obezitate. Are un impact important asupra progresului caracteristicilor clinice la pacienții cu DMD.

Astfel, scopul acestei investigații a fost de a evalua dacă există o asociere între inflamația sistemică cu funcția musculară și starea nutrițională la pacienții cu DMD.

2. Materiale și metode

2.1. Subiecte și metode

Studiul a fost realizat la Laboratorul de Biologie Moleculară, Unitatea de Cercetare Medicală în Nutriție, Spitalul Pediatric, Centro Medico Nacional Siglo XXI (CMN SXXI), Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS). Toți pacienții cu DMD văzuți la serviciul de distrofie musculară electrodiagnostică ambulatorie de la Institutul Național de Reabilitare au fost recrutați pentru studiul transversal între ianuarie 2011 și decembrie 2013. Subiecții cu diagnostic clinic de DMD au fost candidați să participe la studiu și la diagnosticul molecular de confirmare de distrofie a fost efectuată așa cum este descris într-un raport recent la aceiași pacienți [12]. Prin urmare, 66 de pacienți (cu vârste cuprinse între 4 și 18 ani) cu un diagnostic confirmat de distrofie au fost incluși în prezentul studiu. Copiii nu au fost incluși dacă au primit terapie cu corticosteroizi. Niciunul dintre pacienți nu a luat medicamente în timpul studiului.

Studiul a fost aprobat de comitetul de etică instituțional al IMSS. Părinții și pacienții au primit o explicație a fundamentelor studiului, procedurilor, beneficiilor, dreptul la confidențialitate și dreptul de a se retrage din studiu, dacă doreau. Toți părinții și-au dat consimțământul scris în conformitate cu orientările subiecților umani ai comitetului de etică instituțional.

După un post de 12 ore peste noapte, sângele periferic a fost colectat de la fiecare pacient într-un Vacutainer fără anticoagulant pentru a cuantifica citokinele TNF-α, IL-6, IL-1, CRP și CK. Probele de ser au fost menținute la -70 ° C până la analiză. Apoi, a fost obținut un istoric medical de către personal instruit care utilizează scala Vignos. În cele din urmă, au fost măsurate măsurători antropometrice, cum ar fi greutatea, înălțimea și compoziția corpului prin absorptiometrie cu raze X cu energie duală (DEXA).

2.2. Măsurarea scalei Vignos

Există diferite proceduri pentru evaluarea funcției musculare la pacienții cu DMD. Una dintre cele mai utilizate este scala Vignos, care măsoară funcția extremităților inferioare. Este nedureros și ușor de evaluat, iar timpul de finalizare este scurt. Gama scalei a fost clasificată de la 1 la 10 după cum urmează [19]: (1) merge și urcă scări fără asistență, (2) merge și urcă scări cu ajutorul balustradelor, (3) merge și urcă scări încet cu ajutor de balustrade (> 25 sec pentru șapte trepte standard), (4) merge fără asistență și se ridică de pe scaun, dar nu poate urca scările, (5) merge fără asistență, dar nu se poate ridica de pe scaun sau urcă scări, (6) merge doar cu asistență sau merge independent cu bretele lungi pentru picioare, (7) merge în bretele lungi, dar necesită asistență pentru echilibru, (8) stă în bretele lungi, dar nu poate merge chiar și cu asistență, (9) limitat la scaunul cu rotile, (10) limitat la pat.

Pe baza etapelor funcționale cronologice, pacienții au fost clasificați în trei grupe în conformitate cu scala Vignos: grupa A care include pacienții cu ambulanta independenta (intervalul 1-5); Grupa B care include pacienții cu ambulanta asistata (intervalul 6-8); și grupul C care include pacienții cu scaun cu rotile-mobilitate limitată (interval 9-10) [20].

2.3. Măsurători antropometrice

Măsurătorile greutății corporale (kg) și înălțimii (m) au fost toate efectuate de personal instruit. Pentru subiecții care au putut sta în poziție verticală, înălțimea a fost măsurată cu un stadiometru montat pe perete (modelul 208, Seca). Pentru subiecții incapabili să stea în picioare, lungimea a fost măsurată pe o masă plată cu subiectul în decubit dorsal. Greutatea pacienților ambulatori a fost măsurată cu ajutorul unui cântar digital Tanita (model BWB-700), iar pentru pacienții legați de scaunul cu rotile a fost măsurată cu ajutorul unui cântar pentru scaun cu rotile (model 954), subiectul purtând haine ușoare și fără încălțăminte.

În acest studiu, pacienții au fost clasificați în funcție de starea lor nutrițională. Diagnosticul supraponderalității și obezității a fost obținut folosind indicele de masă corporală (IMC) exprimat ca percentile. Copiii cu IMC ≤ percentila 5 au fost clasificați ca subponderali; cei cu IMC> 5 dar

. Distribuția variabilelor studiate a fost examinată folosind testul Shapiro-Wilk. Analiza diferențelor între grupuri a fost realizată cu o analiză unidirecțională a varianței folosind Bonferroni sau Dunnet post hoc. Pentru datele care nu sunt distribuite în mod normal, statistici neparametrice, cum ar fi Kruskal-Wallis și Mann-Whitney

au fost utilizate teste pentru identificarea diferențelor dintre grupuri.

3. Rezultate

3.1. Subiecte de studiu

În acest studiu, au fost incluși 66 de pacienți cu diagnostic clinic și molecular de DMD. Tabelul 1 rezumă parametrii clinici, antropometrici și biochimici ai pacienților cu DMD. În acest studiu de probă, vârstele pacienților au fost

ani (medie ± SD); 18 pacienți erau legați de scaunul cu rotile. Valoarea medie a scalei Vignos indică faptul că pacienții sunt capabili să meargă și să urce scări, dar cu dificultăți. Potrivit CDC, pacienții cu greutate normală au un IMC de. Pe de altă parte, așa cum era de așteptat, concentrația medie de CK (

U/L) este crescut în raport cu valorile normale.

3.2. Inflamarea sistemică și funcția musculară în DMD

Deoarece inflamația cronică este asociată cu afectarea mușchilor care afectează progresia distrofiei Duchenne, am decis să clasificăm populația studiată în funcție de starea funcțională a mușchilor folosind scala Vignos.

Așa cum era de așteptat, rezultatele noastre arată că pacienții cu ambulație independentă (Vignos Scala A) (Tabelul 2) au avut o concentrație mai mare de citokine pro-inflamatorii IL-1 și TNF-α în comparație cu pacienții cu mobilitate limitată a scaunului cu rotile (Scala A Vignos). În același sens, CK, biomarkerul leziunilor musculare, este, de asemenea, crescut în același grup în comparație cu grupele Vignos Scala A și B. În schimb, pacienții cu mobilitate limitată pentru scaunul cu rotile (scara Vignos C) au o concentrație mai mică de citokine proinflamatorii (IL-1 și TNF-α) și CK în comparație cu grupul Vignos Scale A. Cu toate acestea, nu s-au observat diferențe în IL-6 între grupuri.

Concentrația IL-1 a scăzut de patru ori în grupul Vignos Scale C în comparație cu grupul Vignos Scale A și a scăzut de șase ori în grupul Vignos Scale B. În ceea ce privește TNF-α, concentrația sa a scăzut cu una în grupul Vignos Scale C comparativ cu grupul Vignos Scale A. Concentrația de CK a fost redusă de patru ori în grupul Vignos Scale C în raport cu grupul Vignos Scale A (Tabelul 2).

Leptina și CRP au crescut de trei și, respectiv, de cinci ori, în grupul Vignos Scale C comparativ cu grupul Vignos Scale A. În schimb, nu s-au detectat diferențe în concentrația de adiponectină între grupuri (Tabelul 2).

În consecință, pacienții din grupul Vignos Scale C au cel mai mare procent de grăsime corporală, greutate corporală și masă corporală slabă comparativ cu pacienții cu funcție musculară mai bună (Tabelul 2). Deși atât masa slabă, cât și cea grasă au prezentat o creștere mai mare a grupului Vignos Scale C decât grupul Vignos Scale A, aceasta nu apare în aceeași proporție. În grupul Vignos Scale A, putem observa că cantitatea de masă corporală slabă (kg) este de aproape trei ori mai mare decât masa grasă corporală (kg), dar în grupul Vignos Scale C, proporția dintre masa corporală slabă și grasă (kg) este similar (Tabelul 2).

3.3. Inflamarea sistemică și starea nutrițională în DMD

Nu am observat diferențe semnificative în concentrația citokinelor proinflamatorii, cum ar fi IL-1, IL-6 și TNF.-α printre grupurile cu stare nutritivă diferită. Aceste rezultate sugerează că starea inflamatorie produsă de aceste citokine este similară, independent de starea nutrițională a pacienților. În același sens, nu s-au găsit diferențe în ceea ce privește vârsta, concentrația de CK și scala Vignos între nivelurile de stare nutrițională. În schimb, așa cum era de așteptat, concentrația CRP la pacienții supraponderali/obezi a fost mai mare decât cea din celelalte două grupuri (Tabelul 3). În consecință, greutatea corporală, masa de grăsime corporală, masa slabă și leptina au crescut semnificativ () la băieții supraponderali/obezi în comparație cu pacienții cu greutate sănătoasă (Tabelul 3). Creșterea acestor parametri în obezitate este bine cunoscută, deși nu au fost observate diferențe în concentrația de adiponectină între grupurile de stare nutrițională (Tabelul 3).

4. Discutie

Inflamația joacă un rol major în dezvoltarea patologiei în DMD. Deși este bine cunoscut faptul că inflamația cronică și exacerbată poate provoca pierderea regenerării musculare, în prezent nu există suficiente studii la om care să identifice dacă există o asociere între inflamația sistemică cu funcția musculară și starea nutrițională la pacienții cu DMD. Rezultatele acestui studiu sugerează că inflamația sistemică este asociată cu funcția musculară la pacienții cu DMD.

Deoarece biopsia musculară este o procedură invazivă, nu există informații despre inflamație în timpul progresului afectării musculare a pacienților cu DMD. În consecință, în încercarea de a identifica procesul inflamator al distrofiei de-a lungul evoluției într-o manieră neinvazivă, am analizat moleculele inflamatorii din ser. Deși este bine cunoscut faptul că inflamația în DMD este localizată în principal în fibrele musculare din mușchiul deteriorat, concluziile acestei investigații ne-au determinat să considerăm unele citokine ca biomarkeri ai inflamației sistemice care pot indica leziuni musculare.

4.1. Inflamarea sistemică și funcția musculară în DMD

Inflamația are un impact important asupra fiziopatologiei DMD, unde celulele imunologice secretă citokine care amplifică procesul inflamator. Exacerbarea inflamației poate provoca pierderea regenerării musculare și scăderea masei musculare; în consecință, există o pierdere a funcției musculare.

Rezultatele noastre arată că citokinele proinflamatorii (IL-1 și TNF-α) sunt scăzute în serul pacienților cu funcție musculară mai mică. Este bine cunoscut faptul că citokinele sunt crescute la pacienții distrofici în comparație cu subiecții sănătoși. De exemplu, TNF-α concentrația în ser a pacienților cu DMD este crescută de opt ori în comparație cu băieții sănătoși (

versus pg/ml) de aceeași vârstă (ani) [18]. IL-6 este, de asemenea, crescută în serul indivizilor DMD (pg/ml) comparativ cu subiecții sănătoși (pg/ml) [7]. Prin urmare, citokinele pot avea un impact semnificativ asupra procesului inflamator. Există câteva studii care sugerează o corelație între expresia inflamatorie a citokinelor și funcția musculară în DMD. de Pasquale și colab. a demonstrat o expresie mai mare a citokinei proinflamatorii (IL-17) în biopsia musculară de la pacienții cu DMD cu rezultatul motor inferior evaluat de scorul North Star Ambulatory Assessment (NSAA), sugerând că nivelurile de ARNm IL-17 și rezultatul funcțional sunt asociate negativ [6].

Conform acestor constatări, CK a fost, de asemenea, redusă la aceiași pacienți. S-a raportat că CK scade la pacienții vârstnici [21, 22]. Saito și colab. raportat la pacienți tineri (cu vârsta de 20 de ani (12 ng/L)] [4].

Pe baza acestor studii și în conformitate cu rezultatele noastre, propunem că concentrația de citokine (markeri inflamatorii serici) este crescută în mod special în stadiile incipiente ale bolii, cum ar fi la pacienții mai tineri cu DMD, cu ambulație independentă. Această propunere se bazează și pe alte studii [23-25] în care autorii au descris că numărul celulelor inflamatorii scade în țesutul muscular al pacienților distrofici după vârsta de 8 ani și cantitatea acestor celule este mai mare în primii ani ai viata pacientului. Cu toate acestea, este important să se ia în considerare faptul că fibrele musculare contribuie la inflamație datorită capacității lor de a produce citokine, așa cum s-a demonstrat în celulele șoareci distrofice și nedistrofice. Liniile celulare de miocite cedează și secretă diferite citokine în mediu, cum ar fi IL-1, IL-6 și TNF-α și trimite semnale către mușchi pentru a sintetiza citokine suplimentare [26-28]. Prin urmare, pacienții mai tineri cu funcție musculară mai bună au mai multă masă musculară, cu o producție mai mare de citokine. Concentrația acestor citokine în ser este crescută în comparație cu pacienții cu funcție musculară mai mică.

Pe baza acestor studii și pentru că am observat că pacienții cu cea mai afectată funcție musculară (mobilitate limitată în scaunul cu rotile) au cea mai mică concentrație de IL-1, TNF-α, și CK comparativ cu pacienții cu mai puține leziuni musculare (ambulație independentă), am emis ipoteza că scăderea concentrației acestor citokine și CK poate rezulta din pierderea musculară la pacienții cu DMD. Această ipoteză este susținută și de Emery și Muntoni care sugerează că scăderea nivelului CK în serul pacienților cu DMD este asociată cu o scădere a abilităților ambulatorii și progresia bolii [22].

4.2. Starea sistemică de inflamație și nutriție în DMD

Citokinele sunt secretate de țesutul adipos și această secreție este crescută la subiecții obezi. Mușchiul băieților distrofici este înlocuit cu masa grasă. Prin urmare, inflamația la pacienții cu DMD poate rezulta și din obezitate.

Am observat că concentrația moleculelor inflamatorii, scala Vignos și vârsta au fost similare în rândul grupurilor cu niveluri diferite de stare nutrițională, sugerând o stare inflamatorie similară independentă de gradul de obezitate. De exemplu, copiii subponderali și obezi au valori similare ale citokinelor. Interesant este faptul că rezultatele noastre sugerează că, la pacienții subponderali, inflamația sistemică poate fi cauzată parțial de patologia DMD, deoarece acești pacienți au o masă mai mică de grăsime corporală. Cu toate acestea, la pacienții cu supraponderalitate sau obezitate, această inflamație sistemică poate fi originată de țesutul adipos. S-a raportat că citokinele proinflamatorii sunt crescute la copiii obezi. Autorii au raportat o concentrație mai mare de IL-6 seric (0,14 versus 0,05 pg/ml) și TNF-α (9,2 pg/ml față de 8,1) la copiii mexicani obezi (13 ani) decât la copiii neobezi [29].

Alte molecule asociate cu obezitatea sunt CRP, adiponectina și leptina. Ficatul și țesutul adipos produc CRP și ambele pot contribui la creșterea nivelului de CRP plasmatic la obezitate. O cantitate mare de grăsime corporală poate produce o parte importantă a CRP circulant [17, 30]. După cum era de așteptat, CRP și leptina au fost crescute la băieții supraponderali și obezi, deoarece grăsimea corporală a fost crescută. Aceste două molecule (CRP și leptină) au fost, de asemenea, crescute în grupul Vignos Scale C, posibil explicat deoarece subiecții din grupul Vignos Scale C au avut cele mai mari valori ale masei grase [11].

Cu toate acestea, este important să se ia în considerare faptul că acest studiu are unele limitări. Am evaluat aceste citokine în sânge, dar nu și în mușchi. Cu toate acestea, ar trebui să considerăm că acestea sunt citokine circulante și acest lucru poate oferi o explicație cu privire la starea inflamatorie musculară. O altă limitare este lipsa subiecților de control de aceeași vârstă pentru a evalua concentrațiile de citokine. Principalul punct forte al acestui studiu este că am demonstrat, pentru prima dată, diferențe în starea inflamatorie între grupurile cu niveluri diferite de funcție musculară și stare nutrițională. Deoarece inflamația joacă un rol cheie în progresul patologic, este necesar să se evalueze alți factori care contribuie la procesul inflamator pe parcursul distrofiei, cum ar fi alte citokine și celule imunologice, pentru a propune diferite proceduri de management la acești pacienți.

5. Concluzii

Din câte știm, aceste noi rezultate prezintă dovezi cu privire la starea inflamatorie la pacienții cu DMD cu niveluri diferite de funcție musculară. În prima stare a patologiei, când pacienții au o funcție musculară mai bună, starea inflamației sistemice este crescută. Această inflamație este redusă la pacienții cu funcție musculară mai slabă. Concentrarea moleculelor inflamatorii sistemice este independentă de starea nutrițională.

Conflict de interese

Autorii nu declară niciun conflict de interese.

Mulțumiri

Autorii își exprimă aprecierea față de pacienți și familii pentru participarea la studiu. Această lucrare a fost susținută de Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, México (subvenția nr. Salud-2012-180058). Autorii recunosc Sharon Morey, Scientific Communications, pentru acordarea de asistență editorială.

Referințe