Program de cercetare a biologiei radicale libere și a îmbătrânirii Fundației de cercetare medicală Oklahoma, Oklahoma City, Oklahoma, Statele Unite ale Americii, Departamentul de Biochimie și Biologie Moleculară, Universitatea din Oklahoma Health Science Center, Oklahoma City, Oklahoma, Statele Unite ale Americii

piruvat

Afilieri Program de cercetare a biologiei radicale libere și a îmbătrânirii Fundației de cercetare medicală Oklahoma, Oklahoma City, Oklahoma, Statele Unite ale Americii, Departamentul de Medicină Geriatrică, Centrul Reynolds pentru îmbătrânire, Centrul de științe medicale al Universității din Oklahoma, Oklahoma City, Oklahoma, Statele Unite ale Americii

Program de cercetare pentru biologie radicală gratuită și îmbătrânire Fundația de cercetare medicală Oklahoma, Oklahoma City, Oklahoma, Statele Unite ale Americii, Departamentul de Biochimie și Biologie Moleculară, Universitatea din Oklahoma Health Science Center, Oklahoma City, Oklahoma, Statele Unite ale Americii, Departamentul de Geriatrie Medicină, Reynolds Center on Aging, Universitatea din Oklahoma Health Science Center, Oklahoma City, Oklahoma, Statele Unite ale Americii

  • Clair Crewe,
  • Michael Kinter,
  • Luca I. Suedia

Cifre

Abstract

Citare: Crewe C, Kinter M, Szweda LI (2013) Inhibarea rapidă a piruvat dehidrogenazei: un eveniment inițial în pierderea de flexibilitate metabolică indusă de grăsimi dietetice în inimă. PLOS ONE 8 (10): e77280. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0077280

Editor: Gabriele Vincenzo Gnoni, Universitatea din Salento, Italia

Primit: 20 mai 2013; Admis: 31 august 2013; Publicat: 7 octombrie 2013

Finanțarea: Acest proiect a fost susținut de o subvenție (R01AG016339) de la ANI, cu sprijin suplimentar de la Oklahoma Medical Research Foundation (OMRF.org) și Hille Family Foundation (hillefoundation.org). Conținutul este exclusiv responsabilitatea autorilor și nu reprezintă neapărat punctele de vedere oficiale ale ANI sau ale ANI. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Aproximativ 70% din ATP produs în inimă este derivat din oxidarea acizilor grași. Cu toate acestea, inima crește utilizarea glucozei ca răspuns la disponibilitate sporită, sarcină de lucru crescută și stres fiziologic și fiziopatologic. Această flexibilitate metabolică este esențială pentru funcția cardiacă, deoarece: 1) Glucoza față de acizii grași produce mai mult ATP pe moleculă de oxigen consumat și 2) Intermediari glicolitici sunt necesari pentru alte procese decât producția de ATP [1]. Prin urmare, este de remarcat faptul că obezitatea și diabetul duc la reducerea oxidării glucozei cardiace și la o mare dependență de β-oxidare pentru producerea de energie [2,3]. Se crede că suprimarea cronică a flexibilității metabolice contribuie la însoțirea bolilor cardiovasculare [4,5]. Important, o dietă bogată în grăsimi promovează diminuarea utilizării glucozei cardiace înainte de manifestările evidente de obezitate, diabet și disfuncție cardiacă [6,7]. Prin urmare, identificarea evenimentelor și mecanismelor timpurii care contribuie la inflexibilitatea metabolică indusă de dietă poate oferi promisiuni pentru intervenții terapeutice care să restabilească echilibrul metabolic adecvat.

Enzima mitocondrială piruvat dehidrogenază (PDH) este un punct regulator cheie în oxidarea glucozei, catalizând decarboxilarea oxidativă a piruvatului și formarea acetil-CoA și NADH. PDH este reglementat cu strictețe, atât alosteric, cât și posttranslațional, pe baza cerințelor de energie, precum și a disponibilității glucozei și a acizilor grași. Fosforilarea reversibilă a PDH are loc pe lanțul α al subunității E1, una dintre cele trei subunități care cuprind complexul PDH. Există trei situri de fosforilare (serină 293, 300 și 232 la șoareci). Fosforilarea PDH inhibă activitatea enzimei și este catalizată de patru izoforme de piruvat dehidrogenază kinază, dintre care trei sunt exprimate în inimă (PDK1, PDK2 și PDK4). Defosforilarea și activarea PDH sunt catalizate de două fosfataze piruvat dehidrogenază (PDP1 și PDP2) [8-10]. Inhibarea PDH în inima șoarecelui prin supraexprimarea PDK4 este suficientă pentru a stabili un profil metabolic similar cu cel observat în obezitate, în mod specific creșterea β-oxidării și reducerea utilizării glucozei [11,12]. Astfel, modificarea reglării PDH cardiacă ca răspuns la grăsimi bogate în dietă are potențialul de a contribui în mod important la dezvoltarea inflexibilității metabolice.

Demonstrăm că o singură zi de grăsimi dietetice bogate induce reduceri semnificative ale respirației dependente de piruvat susținute de ADP în mitocondriile cardiace izolate ca urmare a unei creșteri selective a expresiei PDK4 și a inhibării PDH. Inhibarea PDH este îmbunătățită în prezența acizilor grași. Postul provoacă un răspuns de reglare convergent care ascunde schimbări metabolice rapide provocate de grăsimi bogate în dietă. Mai mult, creșterea PDK4 indusă de dieta bogată în grăsimi și inhibarea PDH precede scăderea nivelului transportorului de glucoză 4 (GLUT4) și a fosforilării Akt stimulată de insulină. De fapt, reducerea semnalizării insulinei cardiace evidente după 1 săptămână de grăsimi dietetice bogate nu a avut loc la șoarecii knockout PDK4. Aceste descoperiri oferă dovezi că reglarea ascendentă a PDK4 și inhibarea PDH fac parte din răspunsul imediat al inimii la grăsimi bogate în dietă și pot iniția pierderea indusă de dietă în utilizarea glucozei.

Proceduri experimentale

Șoareci și diete

Șoarecii masculi C57BL/6J au fost obținuți din laboratorul Jackson la vârsta de 6 săptămâni. Șoarecii PDK4 -/- au fost un cadou de la Dr. Robert A. Harris (Școala de Medicină a Universității Indiana) [21]. La vârsta de 8 săptămâni șoarecii au fost plasați pe o dietă martor (70% carbohidrați, 20% proteine ​​și 10% grăsimi, în kcal) sau bogată în grăsimi (20% carbohidrați, 20% proteine ​​și 60% grăsimi, după kcal) (Research Diets Inc.) ad libitum. Șoarecii au prezentat creșteri ale greutății corporale încă de la 1 săptămână în dieta bogată în grăsimi, comparativ cu șoarecii menținuți pe o dietă de control (29,1 ± 4,4 g față de 26,1 ± 1,6 g, reducere p + la NADH (340 nm, e = 6,200 M - 1 cm -1) la adăugarea de piruvat 2,5 mM, CoASH 0,1 mM, pirofosfat tiamină 0,2 mM, NAD + 1,0 mM și MgCl2 5,0 mM la pH 7,4.

Analiza Western Blot

Mitocondriile au fost suspendate în tampon de încărcare (106 mM Tris HCI, 141 mM Tris Base, 2,0% SDS, 10% zaharoză, 100 mM DTT, 0,5 mM EDTA, 0,75 mM roșu fenol, 0,22 mM Albastru strălucitor, la pH 8,5) cu 20 mM Cocktail cu NaF și inhibitor de protează (Roche). Proteina a fost apoi rezolvată pe un gel NuPAGE 10% Bis-Tris (Life Technologies) și transferată la membrana PVDF (Bio-Rad). Anti-PDH E1α, anti-phospho-ser293, -ser300 și -ser232 au fost cumpărate de la EMD Millipore, anti-pan AKT și anti-phospho-AKT (thr308) de la Cell Signaling și anticorp Hsp60 de la Santa Cruz Biotechnology. Anticorpul PDK4 a fost un cadou de la Dr. Robert A. Harris (Școala de Medicină a Universității Indiana). Legarea anticorpilor primari a fost vizualizată folosind anticorpi secundari conjugați cu peroxidaza de hrean (Pierce) și substratul chemiluminiscent SuperSignal West Pico (Thermo Scientific).

Analiza spectrometriei de masă [22]

Proteomica cantitativă a fost utilizată pentru a determina nivelurile proteinelor specifice. Proteina mitocondrială a fost introdusă 1,5 cm într-un gel NuPAGE 12,5% SDS-PAGE (Criterion, Bio-Rad). Gelul a fost apoi fixat și colorat cu GelCode Blue (Pierce). Întreaga bandă a fost tăiată

1 mm 3 bucăți. Probele au fost spălate, reduse cu DTT, alchilate cu iodoacetamidă și digerate cu tripsină. Peptidele au fost extrase cu 50% metanol/10% acid formic în apă. Extractul a fost uscat și reconstituit în acid acetic 1%. Probele au fost analizate folosind monitorizarea reacției selectate cu un spectrometru de masă triplu quadrupol (ThermoScientific TSQ Vantage) configurat cu un sistem HPLC cu coloană capilară fără split (Exigent). Datele au fost prelucrate utilizând programul Pinpoint (ThermoScientific), care a aliniat diferitele reacții de disociere induse de coliziune monitorizate pentru fiecare peptidă și au determinat zonele de vârf cromatografice. Răspunsul pentru fiecare proteină a fost luat ca răspuns total pentru toate peptidele monitorizate. Modificările abundenței relative a proteinelor au fost determinate prin normalizarea la standardul intern BSA, cu confirmarea prin normalizare la proteinele de menaj. Pentru detalii despre protocolul experimental, consultați Metodele S1, Tabelul S1, Figura S1 și Figura S2.

RT-PCR cantitativ

Aproximativ 10 mg de țesut cardiac au fost înghețate rapid în azot lichid. ARN-ul a fost extras folosind Tripure (Roche). Un spectrofotometru NanoDrop 2000 UV-Vis (ThermoScientific) a fost utilizat pentru a determina concentrația de ARN. ARN (1,0 ug) a fost convertit în ADNc (20 ul volum final) folosind kitul QuantiTect Transcription Reverse (Qiagen). PCR cantitativă a fost efectuată pe un termociclator CFX96 (BioRad) cu reacții constând din 1,0 pl ADNc, concentrație finală 125 nM a fiecărui primer și iQ SYBR Green Supermix (BioRad) într-un volum total de 20 pl. Valorile Ct pentru fiecare eșantion au fost calculate în medie din duplicatele tehnice. Rapoartele relative de exprimare a transcrierii și statisticile au fost generate utilizând software-ul REST2009 (Pfaffl pauls). Nivelurile de transcriere pentru genele țintă au fost normalizate la trei gene de referință (Gapdh, Sdha și Hspcb) determinate a fi stabile între condițiile dietetice utilizând analiza geNorm (Vandesompele-pauls).

Analiza de semnalizare a insulinei cardiace

Șoarecii au primit o injecție intraperitoneală (0,05 U/g) de insulină umană (NovoLog, Novo Nordisk Inc.). Inimile au fost recoltate la 5 minute după injectare și congelate rapid în azot lichid. Probele au fost apoi pregătite pentru analiza Western blot.

Statistici

Datele sunt prezentate ca medie ± SEM. Analizele statistice au fost preformate utilizând testul t Student cu două cozi și corecția Bonferroni pentru comparații multiple cu valorile p indicate în text ca: * Figura 1. Grăsimea dietetică ridicată reduce rata respirației suportate de piruvat în mitocondriile cardiace izolate.

Tabelul 1. Efectele grăsimilor bogate în dietă asupra activității respiratorii mitocondriale cardiace.

Activitatea PDH este diminuată în mitocondriile respiratorii după o zi de hrănire cu conținut ridicat de grăsimi

Pentru a evalua mecanismele responsabile de respirația diminuată susținută de piruvat, reglarea dinamică a PDH a fost evaluată ca o funcție a stării respiratorii mitocondriale. Mitocondriile izolate de la șoareci pe oricare dintre diete au prezentat o creștere semnificativă a activității PDH în timpul respirației de starea 3 când cererea de sinteză a ATP este mare. Cu toate acestea, activitatea absolută a PDH a fost semnificativ deprimată la fiecare stare respiratorie pentru mitocondriile cardiace izolate de la șoareci hrăniți cu un conținut ridicat de grăsimi în raport cu dieta de control timp de 1 zi (Figura 2A). Pierderea activității PDH în timpul respirației de starea 3 a rămas relativ constantă, cu creșterea duratei dietei până la 20 săptămâni (Figura 2B).

Expresia PDK4 este crescută selectiv ca răspuns la grăsimile dietetice bogate

Au fost cuantificate nivelurile de mARN și proteine ​​ale fiecărei izoforme PDK și PDP în țesutul cardiac de la șoareci hrăniți cu diete bogate în grăsimi sau de control. Expresia PDK4 a arătat cea mai dramatică creștere a răspunsului la dieta bogată în grăsimi. PDK4 mARN a crescut de 4,6 și 2,8 ori la 1 zi și, respectiv, 1 săptămână de hrănire cu conținut ridicat de grăsimi (Figura 3A). Nivelurile de proteine ​​PDK4 au crescut de aproximativ 3 ori la fiecare durată alimentară (Figura 3B), așa cum a fost determinat prin spectrometrie de masă. Creșterea conținutului de proteină PDK4 a fost confirmată prin analiza Western blot (Figura 3C). PDK1 și PDP1 mARN au crescut și au scăzut

30%, respectiv (Figura 3A). În ciuda acestor modificări la nivelul transcrierii, nu a fost detectată nicio modificare statistică la nivelul proteinei prin spectrometrie de masă (Figura 3B). PDK2 nu a prezentat modificări induse de dietă ale conținutului de ARNm sau proteine ​​(Figura 3A și B). Aceste rezultate indică faptul că expresia PDK4 crește rapid ca răspuns la grăsimi bogate în dietă și este probabil principalul mecanism prin care PDH este inhibat în timpul respirației de starea 3.

Conținutul de ARNm și proteine ​​din izoformele PDK și PDP au fost măsurate în inimile șoarecilor hrăniți fie cu dieta de control, fie cu un conținut ridicat de grăsimi timp de 1 zi sau 1 săptămână. A. Expresia ARNm determinată de qRT-PCR (n = 5 și 9 pentru 1 zi și 1 săptămână). B. Conținutul de proteine ​​măsurat prin spectrometrie de masă cantitativă (n = 5 și 6 pentru 1 zi și 1 săptămână). C. Exprimarea PDK4 în mitocondriile cardiace izolate cuantificate prin analiza densitometrică a Western blots (n = 5 pentru 1 săptămână). Toate datele sunt prezentate ca medie ± SEM cu valori p: ** Figura 4. Grăsimea alimentară bogată modifică cinetica inhibării PDH la șoareci de tip sălbatic, dar nu PDK4 -/-.

Șoarecii C57BL/6 au fost hrăniți fie cu o dietă de control timp de 1 zi, cu o dietă bogată în grăsimi timp de 1 zi, fie cu o dietă bogată în grăsimi timp de 1 zi, urmată de o dietă de control timp de 1 zi. A. Mitocondriile cardiace au fost incubate cu 100 μM piruvat și 1,0 mM malat. Respirația de stat 3 a fost inițiată prin adăugarea de ADP (0,25 mM). Activitatea PDH a fost testată în timpul respirației de starea 3 (n = 3). B. Analiza Western blot (reprezentativă pentru n = 3) și spectrometria de masă cantitativă (n = 3) au fost utilizate pentru a determina nivelurile de proteine ​​PDK4 în mitocondriile cardiace izolate. Toate datele sunt prezentate ca medie ± SEM cu valori p: * + 0,69 ori față de 2,32 + 0,93 ori), iar PDH a fost inhibat (Figura 6B și E) în măsuri similare la șoareci hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi sau de control, urmată de un 12 h repede. Astfel, protocolul tradițional al animalelor în repaus alimentar înainte de evaluarea efectelor metabolice ale dietei maschează pe deplin inhibarea rapidă mediată de PDK4 a PDH care rezultă din grăsimea alimentară bogată.

Tabelul 2. Efectele grăsimilor bogate în dietă asupra conținutului cardiac al enzimelor glicolitice.

informatii justificative

Metode S1.

Detalii despre protocolul experimental pentru analiza spectrometriei de masă.