Gintautas Grabauskas, Xiaoyin Wu, ShiYi Zhou, JiYao Li, Jun Gao și Chung Owyang

Divizia de Gastroenterologie și Hepatologie, Departamentul de Medicină Internă, Universitatea din Michigan, Ann Arbor, Michigan, SUA.

bogată

Adresă corespondență către: Chung Owyang, 3912 Taubman Center, SPC 5362, Divizia de Gastroenterologie și Hepatologie, Departamentul de Medicină Internă, Universitatea din Michigan, Ann Arbor, Michigan 48109, SUA. Telefon: 734.936.4785; E-mail: [email protected].

Găsiți articole de Grabauskas, G. în: JCI | PubMed | Google Scholar

Divizia de Gastroenterologie și Hepatologie, Departamentul de Medicină Internă, Universitatea din Michigan, Ann Arbor, Michigan, SUA.

Adresă corespondență către: Chung Owyang, 3912 Taubman Center, SPC 5362, Divizia de Gastroenterologie și Hepatologie, Departamentul de Medicină Internă, Universitatea din Michigan, Ann Arbor, Michigan 48109, SUA. Telefon: 734.936.4785; E-mail: [email protected].

Divizia de Gastroenterologie și Hepatologie, Departamentul de Medicină Internă, Universitatea din Michigan, Ann Arbor, Michigan, SUA.

Adresă corespondență către: Chung Owyang, 3912 Taubman Center, SPC 5362, Divizia de Gastroenterologie și Hepatologie, Departamentul de Medicină Internă, Universitatea din Michigan, Ann Arbor, Michigan 48109, SUA. Telefon: 734.936.4785; E-mail: [email protected].

Divizia de Gastroenterologie și Hepatologie, Departamentul de Medicină Internă, Universitatea din Michigan, Ann Arbor, Michigan, SUA.

Adresă corespondență către: Chung Owyang, 3912 Taubman Center, SPC 5362, Divizia de Gastroenterologie și Hepatologie, Departamentul de Medicină Internă, Universitatea din Michigan, Ann Arbor, Michigan 48109, SUA. Telefon: 734.936.4785; E-mail: [email protected].

Divizia de Gastroenterologie și Hepatologie, Departamentul de Medicină Internă, Universitatea din Michigan, Ann Arbor, Michigan, SUA.

Adresă corespondență către: Chung Owyang, 3912 Taubman Center, SPC 5362, Divizia de Gastroenterologie și Hepatologie, Departamentul de Medicină Internă, Universitatea din Michigan, Ann Arbor, Michigan 48109, SUA. Telefon: 734.936.4785; E-mail: [email protected].

Găsiți articole de Gao, J. în: JCI | PubMed | Google Scholar

Divizia de Gastroenterologie și Hepatologie, Departamentul de Medicină Internă, Universitatea din Michigan, Ann Arbor, Michigan, SUA.

Adresă corespondență către: Chung Owyang, 3912 Taubman Center, SPC 5362, Divizia de Gastroenterologie și Hepatologie, Departamentul de Medicină Internă, Universitatea din Michigan, Ann Arbor, Michigan 48109, SUA. Telefon: 734.936.4785; E-mail: [email protected].

Găsiți articole de Owyang, C. în: JCI | PubMed | Google Scholar

Publicat pe 5 septembrie 2019 - Mai multe informații

Cercetările arată că șobolanii și oamenii cu o dietă bogată în grăsimi (HFD) sunt mai puțin sensibili la semnalele de sațietate cunoscute că acționează prin căi aferente vagale. Ipotezăm că HFD determină o reglare ascendentă a canalelor de potasiu din 2 pori, rezultând hiperpolarizarea ganglionilor nodozitari (NG) și scăderea răspunsului vagal la semnalele de sațietate, care contribuie la hiperfagie. Arătăm că un HFD de 2 săptămâni a provocat o reglare ascendentă a canalelor K + (TRESK) și ale canalelor K + 1 (TASK1) sensibile la acid legate de TWIK din domeniul cu 2 pori cu 330% ± 50% și 60% ± 20%, respectiv, în NG. Studiile patch-clamp ale neuronilor NG izolați au demonstrat o scădere a excitabilității. Înregistrările in vivo cu o singură unitate NG au arătat că un HFD de 2 săptămâni a dus la o reducere de 55% a frecvenței de tragere ca răspuns la stimularea CCK-8 sau a leptinei. Electroporarea NG cu TRESK siRNA a restabilit răspunsul NG la CCK-8 și leptină. Șobolanii hrăniți cu HFD de 2 săptămâni consumate

Cu 40% mai multe calorii comparativ cu controalele. Silențierea NG TRESK, dar nu expresia canalului TASK1 la șobolanii hrăniți cu HFD a restabilit consumul normal de calorii. În concluzie, HFD a provocat reglarea în sus a canalelor TRESK, rezultând hiperpolarizarea NG și scăderea capacității de răspuns vagal la semnalele de sațietate. Această constatare oferă o țintă farmacologică pentru a preveni sau trata hiperfagia indusă de HFD.

Obezitatea indusă de dietă (DIO) și hiperfagia sunt frecvente în țările occidentale; totuși, înțelegerea noastră asupra mecanismelor care stau la baza dezvoltării acestor condiții rămâne neclară. Semnalizarea aferentă vagală este o legătură importantă între tractul gastrointestinal (GI) și centrele din sistemul nervos central care controlează aportul de alimente și cheltuielile de energie (1). Studiile anterioare arată că animalele obeze și oamenii prezintă semnalizare anormală a sațietății (2). Sensibilitatea aferentă vagală la hormoni GI (colecistochinină [CCK], bombesină și serotonină) și stimularea mecanică este semnificativ redusă în rozătoarele obeze induse de grăsimi (induse de HFD) în comparație cu dieta de control - animale hrănite (3 - 9), sugerând o funcționare senzorială vagală anormală.

S-a demonstrat că 1 până la 2 săptămâni de expunere la HFD au fost suficiente pentru a afecta capacitatea CCK de a inhiba golirea gastrică și de a suprima consumul de alimente (6, 10), indicând faptul că alimentarea cu HFD reglează funcționarea senzorială vagală înainte de apariția obezității. Reacția afectivă vagală afectată atât la hormonii de sațietate gastrică (CCK și leptină), cât și la stimularea mecanică crește posibilitatea ca modificările proprietăților electrofiziologice să fie mecanismul de bază responsabil pentru afectarea reacției vagale la o mare varietate de semnale de sațietate. Daly și colegii (6) au efectuat înregistrări electrofiziologice de la neuroni izolați ganglionare nodoză și au demonstrat că excitabilitatea electrică este semnificativ redusă în neuronii de la șoareci obezi induși de HFD. Această modificare a excitabilității este însoțită de o reducere a rezistenței de intrare a potențialului de repaus al membranei celulare.

Canalele de potasiu sunt factori determinanți esențiali ai excitabilității neuronale în tot sistemul nervos. Recent am demonstrat că reglarea ascendentă a canalelor K + (TRESK sau K2P18.1) ale măduvei spinării legate de TWIK din domeniul 2 pori este responsabilă pentru funcționarea senzorială vagală afectată în condițiile diabetice (11). Este de conceput că anomalii similare pot explica o reacție vagală redusă la semnalele de sațietate după hrănirea cronică cu conținut ridicat de grăsimi. În acest studiu, am emis ipoteza că reglarea ascendentă a canalului TRESK al domeniului cu 2 pori (2PK) are loc după hrănirea cu conținut ridicat de grăsimi și este responsabilă pentru reacția vagală anormală la semnalele de sațietate. Folosind tehnici electrofiziologice și de silențiere in vivo și in vitro, am investigat rolul canalelor K + 1 (TASK1) sensibile la acid asociate cu TRESK și TWIK în funcționarea defectuoasă a reacției neuronilor ganglionare vagale la semnalele de satietate și dezvoltarea hiperfagie.

TRESK este reglat în ganglionii senzoriali vagali. Studiile noastre PCR cantitative au arătat că neuronii ganglionilor nodozitari (NG) au exprimat TRESK, canalul K + legat de TWIK tip 2 (TREK2), TASK1 și -3 și ARNm TRAAK2 (Figura 1). Cuantificarea ARNm a diferitelor canale 2PK, normalizată la raportul mRNA HPRT de referință, a relevat o creștere semnificativă a expresiei mRNA TRESK și TASK1 cu 330% ± 50% și 60% ± 20% (P Demonstrarea nivelurilor crescute de canale 2PK în ganglionii senzoriali vagali după 2 săptămâni HFD. (A) Datele RT-PCR care arată TRESK, TASK1 și -3, TREK2 și TRAAK2 mARN în ganglionii senzoriali vagali după 2 săptămâni de hrănire HFD în comparație cu șobolanii hrăniți cu LFD. HPRT a fost utilizat ca control de încărcare. n = 9 în fiecare grup. *P + canal; TREK2, canal K + legat de TWIK tip 2; TRESK, canalul K + al măduvei spinării legat de TWIK.

Localizarea imunoreactivităților TRESK și CCK-AR și ObR în ganglionii senzoriali vagali de șobolan. (A) TRESK (verde, superior), CCK-AR (roșu, mijlociu) și imaginile suprapuse arată colocalizarea TRESK și CCK-AR (galben, inferior) și în ganglionii senzoriali vagali. Bara de scalare: 100 µm. (B) TRESK (roșu, superior), ObR (verde, mijlociu) și imaginile suprapuse arată colocalizarea TRESK și ObR (galben, inferior) în ganglionii senzoriali vagali. Bara de scalare: 100 µm. (C) Sinteza graficului cu bare care arată distribuția și colocalizarea imunoreactivităților TRESK și CCK-AR în ganglionii senzoriali vagali de șobolan. Datele sunt reprezentate ca media ± SEM. (D) Grafic cu bare rezumative care arată distribuția și colocalizarea imunoreactivităților TRESK și ObR în ganglionii senzoriali vagali de șobolan. Datele sunt reprezentate ca medie ± SEM. Elevi t Test. CCKR, receptor CCK-A; ObR, receptor de leptină.

Am arătat că expresia îmbunătățită a canalelor TRESK și, într-o măsură mai mică, a avut loc în NG la șobolani cărora li s-a administrat un HFD. Acestea au fost însoțite de o excitabilitate vagală redusă și pot contribui la hiperfagia la animalele care ingerează HFD. Aceste modificări au avut loc încă din 2 săptămâni de hrănire cu HFD. Tăierea expresiei genei TRESK, dar nu și a expresiei genei TASK1 în NG a revenit la modificările electrofiziologice pe NG evocate de HFD și a normalizat comportamentul de hrănire a șobolanilor cărora li s-a administrat un HFD. Pentru prima dată, după cunoștințele noastre, am demonstrat următoarele: (a) reglarea în sus a canalelor TRESK și TASK1 s-a produs în NG de șobolani după 2 săptămâni de HFD; (b) înregistrările in vivo cu o singură unitate a neuronilor nodozici au arătat că HFD a scăzut capacitatea de reacție la peptidele de sațietate, cum ar fi CCK-8 și leptină; (c) studiile in vitro patch-clamp ale neuronilor nodozici care inervează tractul GI au arătat o scădere globală a excitabilității; (d) mutarea canalelor TRESK, dar nu și TASK1, a normalizat proprietățile electrofiziologice ale neuronilor nodozici ai șobolanilor cărora li s-a administrat un HFD; și (e) reducerea in vivo a canalului TRESK a restabilit reacția NG la stimularea CCK și a leptinei și a prevenit hiperfagia indusă de HFD.

În concluzie, studiile noastre oferă o explicație moleculară pentru semnalizarea sațietății mediată vag vag la șobolani, dată de HFD. După 2 săptămâni de hrănire cu conținut ridicat de grăsimi, a existat o reglare ascendentă semnificativă a TRESK și o creștere modestă a canalelor TASK1 în NG. Studiile de reducere a zgomotului indică faptul că reglarea ascendentă de către canalele TRESK este în principal responsabilă de o scădere globală a excitabilității neuronilor senzoriali vagali, care la rândul lor diminuează răspunsul la semnale de sațietate, cum ar fi CCK și leptina. Aceste modificări plastice în semnalizarea senzorială vagală apar încă din 2 săptămâni de hrănire bogată în grăsimi, precedând dezvoltarea obezității și duc la hiperfagie. Înțelegerea anomaliilor în semnalizarea NG poate oferi ținte terapeutice pentru prevenirea sau tratarea hiperfagiei la pacienții cu HFD.

Animale. Șobolani Sprague-Dawley masculi (170-190 g) au fost cumpărați de la laboratoarele Harlan și li s-a permis să se aclimatizeze la unitatea locală pentru animale timp de 1 săptămână înainte de experimentare. Animalele au fost separate în 2 grupuri și au fost hrănite fie cu HFD (60% kcal din grăsimi; 5,21 kcal/g; obținut de la Research Diets Inc., D12492), fie printr-o dietă standard de șobolan de laborator/LFD (martor, 10% kcal din grăsimi; 3,85 kcal/g; Dieta de laborator, catalog 5LOD) timp de 2 săptămâni. Pentru a ne asigura că focul vagal defect s-a datorat creșterii grăsimilor, nu creșterii caloriilor, în dietă, am efectuat experimente suplimentare în care am restricționat aportul de calorii pentru a se potrivi cu caloriile din grupul LFD, menținând în același timp cantități de grăsime similare grupului HFD . Șobolanii au fost adăpostiți la 22 ° C sub un ciclu de 12 ore de lumină/12 ore de întuneric, cu lumini aprinse la 0600 ore și oprite la 1800 ore, cu acces gratuit la alimente și apă.

Urmărirea retrogradă a NG. Șobolanii au fost profund anesteziați cu un amestec de 4% izofluran în aer, așa cum s-a descris anterior (11). După laparotomie, s-au aplicat pe duoden cristale ale trasorului retrograd 1,1'-dioctadecil-3,3,3 ', 3'-tetrametilindocarbocianină (DiI; Molecular Probes, Invitrogen). Pentru a limita colorantul la locul de aplicare, cristalele de DiI au fost încorporate într-o rășină epoxidică cu întărire rapidă (Tra-Con Inc.) care a fost lăsată să se întărească timp de aproximativ 5 minute. Zona chirurgicală a fost apoi spălată cu soluție salină sterilă caldă, iar rana a fost închisă cu suturi de nailon 4-0. Animalul a fost lăsat să se recupereze timp de 10 până la 15 zile înainte de a fi ucis pentru disecția NG.

Izolarea și cultura neuronilor senzoriali vagali. Șobolanii au fost uciși prin asfixiere cu CO2, iar ganglionii senzoriali vagali au fost disecați, tăiați în fragmente mici și așezați într-un tub de centrifugă de 1,5 ml conținând tampon de digestie (dispaza II; Life Science, Roche Diagnostics) și colagenaza I (Invitrogen, Invitrogen ) (1 mg/ml). După incubare la 37 ° C timp de 60 de minute, celulele au fost dispersate prin triturare ușoară prin pipete Pasteur și spălate în DMEM (Invitrogen). Celulele au fost resuspendate în DMEM conținând 10% ser fetal bovin (FBS, Invitrogen) și placate pe lamele acoperite cu poli-l-lisină (100 μg/ml) timp de 30 de minute și cultivate în DMEM cu 10% FBS, cu penicilină și streptomicină, la 37 ° C. Culturile neuronale primare au fost menținute în cultură timp de 16 până la 30 de ore la 37 ° C înainte de înregistrare.

Western blot. Ganglionii vagi au fost recoltați în conformitate cu o tehnică descrisă anterior (12). După spălare, s-a adăugat tampon de liză (30 μl) cu inhibitor de protează (Life Science, Roche Diagnostics) timp de 15 minute la 4 ° C. Lizatul a fost centrifugat la 14.000 g timp de 10 minute. Probele de proteine ​​au fost apoi rulate pe 10% Ready Gel Tris-HCl (Bio-Rad Laboratories) timp de 1,5 ore la 80 V. Proteinele au fost apoi transferate în membranele PVDF timp de 1 oră la 80 V. Membranele au fost blocate cu tampon de blocare StartBlockT20 (Invitrogen ) la temperatura camerei, sondat cu anticorpi primari împotriva TRESK (APC-122, Alomone Labs) la o diluție de 1: 1000 la 4 ° C peste noapte, și apoi spălat cu soluție salină tamponată Tris timp de 1 oră. Membranele au fost sondate cu anticorpi secundari conjugați cu peroxidază de hrean (Invitrogen, catalog 31464) la o diluție de 1: 2000. Benzile rezultate au fost scanate cu un Epson Stylus Photo R2400 (Epson Corp.) și analizate folosind ImageJ (NIH).

RT-PCR cantitativ NG. NG au fost îndepărtate bilateral de la șobolani din toate grupurile experimentale. ARN-ul total a fost extras folosind un kit RNeasy Micro (Qiagen) conform instrucțiunilor producătorului. ARN-ul a fost cuantificat prin măsurarea absorbanței la 260 nm (A260) folosind un spectrofotometru NanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific), iar puritatea ARN-ului a fost estimată prin raportul de absorbție 260/280. ARN total (2-4 μg) a fost transcris în ADNc folosind primeri oligo-dT și supercript II (Invitrogen). RT-PCR cantitativ a fost efectuat utilizând sistemul în timp real Bio-Rad CFX-Connect și SYBR Green Supermix. Primerii care vizează ObR, TRESK, TASK1 și -3, TREK2, TRAAK, CCK-AR și HPRT sunt enumerați în Tabelul 1. Toate perechile de primer acoperă 1 sau mai mulți introni. Condițiile PCR cantitative au fost de 95 ° C timp de 5 minute, 1 ciclu; 95 ° C timp de 10 secunde, 60 ° C timp de 45 secunde, 40 cicluri. S-a obținut o curbă de topire pentru a confirma specificitatea produselor.

Primeri PCR cantitativi

RT-PCR a fost efectuat utilizând ADN polimeraza GoTaq (Promega) cu următoarele condiții: 95 ° C timp de 3 minute, 1 ciclu; 95 ° C timp de 30 de secunde, 55 ° C timp de 30 de secunde, 72 ° C timp de 1 minut, 38 de cicluri; 72 ° C timp de 10 minute, 1 ciclu. Produsele au fost vizualizate folosind electroforeză în gel de agaroză 3% cu colorare cu bromură de etidiu. Nivelurile relative de ARN au fost calculate utilizând tomografia computerizată comparativă. Datele cantitative au fost exprimate ca medie ± SEM.

În ganglionii marcați duplex, am numărat profilurile neuronale care prezintă profiluri neuronale care ar putea fi identificate în mod clar, cu profilul de nucleu vizibil obținut în iluminarea cu câmp luminos și în lumina fluorescentă. Au fost numărate cinci secțiuni pe ganglion, secțiunile fiind separate de o distanță minimă de 80 μm. Datele au fost incluse în graficul cu bare (Figura 2) reprezentând procentul de profiluri de celule care exprimă colorarea verde, roșie, sau atât colorarea verde, cât și cea roșie.

Eficiența transfecției a fost evaluată prin măsurarea expresiei GFP, a imunoreactivității proteinelor specifice, a expresiei ARNm și a expresiei proteinelor. Expresia GFP, care este un nou sistem de raportare genetică, a fost măsurată utilizând microscopie fluorescentă cu excitație la 488 nm. Deoarece construcția specifică de ARNsi țintă a fost ambalată cu gena reporter GFP, distribuția expresiei siARN și expresia GFP se suprapun.

Studiul nostru anterior a demonstrat că transfecția ARNsi în neuroni are un efect maxim la 3-6 zile de la transfecție, cu reducerea duratei de până la 2 săptămâni (11, 12). Studiile de alimentare și înregistrările cu o singură unitate au fost efectuate la 5-6 zile după electroporare. Doar animalele complet recuperate au fost incluse în studiu. Studiile noastre preliminare au arătat că șobolanii care au intervenții chirurgicale și cei cu siRNA de control injectat în NG au consumat cantități similare de alimente, indicând faptul că operația singură nu afectează comportamentul de hrănire.

Statistici. Toate valorile sunt exprimate ca medie ± SEM. ANOVA unidirecțională cu corecția lui Bonferroni pentru comparații multiple a fost utilizată pentru a compara mai mult de 2 grupuri și a studenților cu două cozi nepereche t testul a fost folosit pentru a compara 2 grupuri. P Aprobarea studiului. Toate procedurile la animale au fost efectuate în conformitate cu orientările NIH și cu aprobarea Comitetului universitar pentru utilizare și îngrijire a animalelor de la Universitatea din Michigan.

CO a supravegheat proiectul și a obținut sprijin pentru subvenții. GG a efectuat studii de patch-clamp și analize relevante. XW a efectuat înregistrări cu o singură unitate și analize relevante. JG a efectuat studii Western blotting și analize relevante. JL a efectuat studii PCR și analize relevante. SZ a efectuat studii de hrănire genetică și hrănire și analize relevante.

Această lucrare a fost susținută de Institutul Național de Diabet și Boli Digestive și Boli Rinice subvenții R01-DK048419 (la CO) și P30-DK34933 (la CO).

Conflict de interese: Autorii au declarat că nu există niciun conflict de interese.