Abstract

Introducere

Placenta este un participant activ la sarcină, acționând ca o conductă între mamă și făt. În această capacitate, poate promova creșterea fetală prin transferul de nutrienți și oxigen 1-3 și reduce la minimum expunerile adverse la atingerea fătului prin intermediul transportorilor de eflux și a altor sisteme de barieră 4. Atunci când funcția sa este optimă, placenta se poate adapta la schimbările din mediul sarcinii și poate amortiza fătul de expuneri adverse 1.5. Dar dacă capacitatea placentei de a răspunde la stimulii de mediu este compromisă, probabil din cauza dezvoltării și/sau funcției placentare modificate, adaptarea poate fi insuficientă sau absentă, iar creșterea și dezvoltarea fetală pot fi afectate negativ 1.5. Creșterea slabă a fătului este problematică: este asociată cu traiectorii de creștere suboptimă în viața timpurie și cu un risc crescut de boli cronice pe termen lung 6.7. Cu toate acestea, rămâne neclar modul în care placenta se adaptează la mediile de sarcină modificate într-un mod care ar putea modela creșterea fetală și ar putea sta la baza originilor timpurii ale bolii ulterioare.

morfologia

Nu toți fetușii expuși la medii adverse în uter prezintă semne de creștere compromisă, care pot fi explicate prin capacitatea de adaptare a placentei, influențând capacitatea sa de a acționa ca o barieră selectivă pentru factorii trofici și alte xenobiotice. Am emis ipoteza că placenta s-ar putea adapta diferit la dietele materne ONU și HF, prin schimbări în dezvoltarea și funcția acesteia, iar aceste adaptări ar explica de ce descendenții mamelor ONU și HF cresc diferit în uter și ar putea dezvălui mecanisme care stau la baza originilor dezvoltării bolii ulterioare. . Pentru a aborda acest lucru, am evaluat markeri selectivi de dezvoltare placentară și transportatorii ABC și de acizi grași la sfârșitul sarcinii la barajele hrănite cu o dietă normală, ONU sau hrănite cu o dietă IC, și am determinat efectele acestor diete asupra metabolismului matern și a creșterii fetale.

Metode

Model animal

Colectarea și prelucrarea biospecimenului

La GD18.5, perioada de vârf a creșterii fetale și imediat după atingerea volumului placentar maxim, a spațiului sanguin matern și a dezvoltării capilare fetale 51, barajele au fost ucise prin luxația cervicală. Imediat după aceea, glucoza din coadă a fost măsurată folosind un glucometru comercial (Roche Accucheck). Barajele au fost decapitate și sângele din trunchi a fost colectat în tuburi acoperite cu heparină pentru a izola plasma. Feturile și placentele au fost disecate rapid din uter și cântărite, iar țesuturile au fost congelate rapid în azot lichid și depozitate la -80C, pentru analize moleculare ulterioare, sau clătite cu PBS 1X rece ca gheața, apoi fixate în formalină 10% tamponată neutră, urmat de depozitare în 70% EtOH la 4 ° C înainte de a fi încorporat în parafină pentru analize histologice ulterioare.

Analize histologice

5 secțiuni placentare încorporate în parafină param au fost colorate conform protocoalelor standard cu hematoxilină și eozină Y (H&E), acid periodic - Schiff (PAS) sau cu anticorpi specifici primari și secundari, așa cum este descris mai jos. Diapozitivele colorate cu H&E și PAS au fost scanate digital la o mărire de 5x sau respectiv de 20x, folosind un scaner digital de diapozitive Hamamatsu la Facilitatea de imagistică optică a Institutului de cercetare Lunenfeld-Tanenbaum. Imaginile rezultate au fost vizualizate folosind ImageJ și pluginurile ImageJ NDPITools 52. Măsurătorile zonelor de joncțiune placentară și zone labirintice au fost calculate așa cum a fost descris de Bloise și colab. 53 (2012). Celulele PAS-pozitive au fost numărate în întreaga secțiune placentară și exprimate ca număr de celule PAS-pozitive/zona spongiotrofoblastului sau/zona JZ. Scorarea analizei zonei placentare și a imaginii a fost efectuată pe un placent de sex masculin și unul de sex feminin din fiecare grup dietetic, unde fiecare probă selectată a reprezentat greutatea medie fetală și placentară pentru acel grup de dietă 53,54. Un observator orbit de grupurile experimentale a efectuat analiza imaginii.

Placentae au fost colorate pentru P-gp (1: 500, D-11 Santa Cruz, Mississauga, Canada) și BCRP (1: 200, Calbiochem, Etobicoke, ON, Canada) așa cum este descris mai sus, cu următoarele modificări: secțiunile au fost stinse folosind 0,03 % peroxid de hidrogen în 1X PBS timp de 30 de minute la temperatura camerei; anticorpul secundar a fost anticorp anti-șoarece biotinilat de capră (1: 200, Vector Labs); și timpul de incubație a substratului DAB peroxidazei pentru a vizualiza semnalele anticorpilor a fost de 30 de secunde atât pentru P-gp cât și pentru BCRP. Din secțiuni colorate, șase imagini au fost capturate aleatoriu la o mărire de 20X (microscop inversat Leica DMIL LED și software QCapture Pro) în spongiotrofoblast și în zonele labirintului. Analiza semicantitativă pentru a obține intensitatea colorării în fiecare imagine a fost realizată de un singur observator orbit de grupurile experimentale așa cum s-a descris anterior 55. Colorarea a fost marcată ca absentă (0), slabă (1), moderată (2), puternică (3) și foarte puternică (4). A fost calculată intensitatea medie a colorării în cele șase imagini pentru fiecare zonă placentară pentru fiecare placentă.

hibridizare in situ

Arhitectura placentară la GD18.5 a fost analizată utilizând programul software Visiopharm NewCAST (Horsholm, Danemarca) în urma hibridizării in situ utilizând următoarele sonde: Ctsq, Prl3b1, Pcdh12 și Tpbpa așa cum s-a descris anterior 19. 20% din suprafața per secțiune placentară a fost numărată aleatoriu la o mărire de 20x (folosind un microscop Olympus BX61) cu 20 de puncte pe câmp vizual, reprezentând 8,9 mm 2 per punct/număr. Un total de 3 sau 4 secțiuni pe placentă au fost analizate din 4 placente de sex feminin și 4 bărbați pe grup dietetic. Suprafețele totale sau relative pentru structuri specifice au fost calculate pentru fiecare secțiune și mediată pe placentă. Structurile de interes au inclus celulele glicogenului, celulele PAS-pozitive, TGC sinusoidale, TGC, celulele glicogen interstițiale, spațiul sanguin matern, spațiul sanguin fetal, spațiul sanguin matern în SW, zona trofoblastului labirintic și zona spongiotrofoblastului. Mărimea SW a fost calculată prin însumarea zonelor sinusale spongiotrofoblast, TGC și SW. Mărimea LZ a fost calculată prin însumarea spațiului sanguin fetal, a sinusului labirintic și a zonelor trofoblastice labirintice.

Măsurători ale biomarkerului plasmatic

Testele de plăci specifice șoarecilor disponibile în comerț au fost utilizate conform instrucțiunilor producătorului pentru a măsura biomarkerii în circulația maternă. Insulina plasmatică (șoarece ultrasunet ELISA, ALPCO, Salem, NH, SUA), leptina (șoarece ELISA, Crystal Chem, Downers Grove, IL, SUA), adiponectină (șoarece ELISA cu greutate moleculară mare, ALPCO, Salem, NH, SUA) și trigliceridele (LabAssay Triglyceride Kit, Wako, Richmond, VA, SUA) au fost măsurate în plasmă. Acizii grași liberi (kitul gratuit de cuantificare a acizilor grași, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA) au fost măsurați în eritrocite materne grupate pentru fiecare grup dietetic datorită volumului redus de eritrocite disponibile de la fiecare animal, ceea ce face imposibilă măsurile individuale ale animalelor.

Izolarea și exprimarea ARNm în placentă

ARN-ul total a fost extras din placenta 29 folosind reactivul TRIZOL (Invitrogen) urmând instrucțiunile producătorului. Puritatea și concentrația ARN au fost evaluate prin analiză spectrofotometrică (Nanodrop) și integritatea ARN a fost verificată utilizând electroforeza pe gel. 1 Rg ARN a fost transcris invers utilizând 5X iScript Reverse Transcription Supermix (BioRad, Mississauga, ON, Canada). O probă de transcripție non-inversă (NRT; absența enzimei) a fost transcrisă invers pentru a oferi un control negativ pentru reacția RT în aplicațiile PCR din aval.

Izolarea și exprimarea proteinelor în placentă

Proteina totală a fost extrasă din placentă utilizând tampon RIPA cu inhibitor de protează complete ™ (Sigma, Oakville, ON, Canada) și ortovanadat de sodiu 100mM. Concentrația de proteine ​​a fost determinată utilizând testul BCA (Pierce, Thermo Fisher, Mississauga, ON, Canada).

Pentru nivelurile de proteine ​​LPL placentare, a fost utilizat un ELISA specific șoarecelui (Cusabio, Houston, TX, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. Toate probele de proteine ​​au fost normalizate la aceeași concentrație în diluantul probei înainte de testare. Probele au fost efectuate în duplicat și media (SD)% CV între duplicate a fost de 6,98 ± 4,58%.

Măsurători de citokine placentare

Proteinele izolate din omogenate placentare au fost testate pentru nivelurile de citokine conform instrucțiunilor producătorului folosind testul Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-Plex (Bio-Rad, Hercules, CA, SUA) și sistemul Luminex (Bio-Rad; software v6.0 ). Toate probele de proteine ​​au fost normalizate la aceeași concentrație în diluantul probei înainte de testare. Concentrațiile de citokine sunt exprimate ca proteine ​​pg/mg. Citokinele cu valori peste sau sub intervalul curbei standard au fost excluse din analize, lăsând 16 citokine pentru analiză în probe placentare. În plus, placenta de la fetuții feminini a prezentat niveluri de IL-17a și G-CSF sub limita inferioară de detectare a testului și, prin urmare, datele prezentate pentru aceste citokine reflectă doar valori în placenta masculină. Eșantioanele au fost preluate în duplicat și media CV% (interval) între duplicate în toate cele 16 citokine a fost de 5,7 (3,74-9,65).

Statistici

Măsurile de rezultat au fost testate pentru normalitate și varianțe inegale (testul Levene). Datele care nu erau normale au fost transformate pentru a atinge normalitatea, acolo unde este posibil. Diferențele dintre grupurile dietetice pentru măsurile de rezultat au fost determinate de ANOVA cu Tukey’s post hoc sau Welch ANOVA cu Games-Howell post hoc sau testul Kruskal-Wallis cu Steel-Dwass pentru date neparametrice (p Vizualizați acest tabel:

  • Vizualizați în linie
  • Vizualizați fereastra pop-up
  • Descărcați PowerPoint

A existat un efect general al dietei materne asupra creșterii în greutate în timpul sarcinii (p = 0,002). Mamele HF au fost mai grele decât ONU pe tot parcursul sarcinii (p Vizualizați acest tabel:

  • Vizualizați în linie
  • Vizualizați fereastra pop-up
  • Descărcați PowerPoint

Dieta maternă slabă afectează creșterea fetoplacentară și este asociată cu arhitectura placentară modificată

Dieta maternă nu a modificat dimensiunea așternutului sau numărul de resorbții fetale la GD18.5 (Tabelul 2). Cu toate acestea, greutatea fetală, greutatea placentară și raportul dintre greutatea fetală și greutatea placentară au fost semnificativ mai mici în ONU comparativ cu sarcinile CON și HF (p Vizualizați acest tabel:

  • Vizualizați în linie
  • Vizualizați fereastra pop-up
  • Descărcați PowerPoint

Ambele zone de joncțiune și labirint ale placentei ONU și HF au fost mai mici comparativ cu martorii; diferențele au fost mai mari de 10%, în cazul în care placentele ONU au redus semnificativ zona SW în comparație cu CON (p = 0,03; Figura 2). Analiza aprofundată a arhitecturii placentare a relevat dimensiunea labirintică calculată semnificativ mai mică în placentele HF comparativ cu CON (p = 0,03, Figura 3). Nu a existat niciun efect al dietei materne asupra dimensiunii SW placentare sau a raportului dimensiunea SW: dimensiunea labirintică. În plus, analiza arhitecturii placentare a evidențiat o reducere semnificativă a spațiului sanguin fetal în placenta HF comparativ cu placentele CON și UN (p = 0,003, Tabelul 3 și Figura 3). Analizele stratificate în funcție de sex ale arhitecturii placentare au arătat tendințe similare atât la placenta masculină, cât și la cea feminină, dar rezultatele au fost semnificative doar la bărbați (p = 0,001, Tabelul 3). Spațiul sanguin fetal: raportul greutății fetale a fost redus semnificativ la fetuții HF comparativ cu CON și UN (p Vizualizați acest tabel:

  • Vizualizați în linie
  • Vizualizați fereastra pop-up

A. Imagini reprezentative ale placentelor colorate cu H&E la o mărire de 5X. B. Zona labirintului și a zonelor de joncțiune (panoul superior) și modificarea procentuală a zonei față de valorile de control (panoul inferior). Datele sunt reprezentate de graficul cu cutii cu cantități cu 95% diamante de încredere CI.

Se arată secțiunile transversale colorate cu PAS pentru a detecta conținutul de glicogen (roșu) al celulelor glicogenului trofoblast, contracolorat cu hematoxilină (albastru). Inserțiile arată măriri mai mari ale structurilor labirintului. Deși mai mici ca mărime și greutate, placentele UN (C, D) prezintă morfologii similare în comparație cu placentele CON (A, B). Placentele dietetice HF (E, F) prezintă structuri labirintice mai dense cu suprafață redusă a spațiilor sanguine fetale. L, labirint; SpT, spongiotrofoblast; GC, celulă glicogenă; S, sinusoid matern; D, decidua; săgeți, celule gigantice trofoblaste sinusoidale; capete de săgeți, spațiu sanguin fetal; asterisc; spațiul sanguin labirintic matern.

A. Raportul la toți făturile. B. Raportul la femei. C. Raportul la bărbați. Datele sunt reprezentate de o diagramă cu cutie cu cantități de 95% cu diamante de încredere CI hibridizare p in situ a placentei GD18.5 de la sarcini de sex masculin (M) și femele (F) de control (CON), subnutriți (ONU) și cu greutate bogată în grăsimi (HF). Se arată secțiunile transversale sondate cu Ctsq și Prl3b1 pentru a detecta celulele gigantice, Pcdh12 pentru a detecta celulele glicogen și Tpbpa pentru a detecta spongiotrofoblastul. Deși mai mici ca mărime și greutate, placentele UN (C, D în toate panourile) prezintă morfologii similare comparativ cu placentele CON (A, B în toate panourile) și placentele HF (E, F în toate panourile). L, labirint; SpT, spongiotrofoblast; săgeți, semnal pozitiv al sondei.

Se arată secțiunile transversale sondate cu Ctsq și Prl3b1 pentru a detecta celulele gigantice, Pcdh12 pentru a detecta celulele glicogen și Tpbpa pentru a detecta spongiotrofoblastul. Deși mai mici ca mărime și greutate, placentele UN (C, D în toate panourile) prezintă morfologii similare comparativ cu placentele CON (A, B în toate panourile) și placentele HF (E, F în toate panourile). L, labirint; SpT, spongiotrofoblast; săgeți, semnal pozitiv al sondei.

Expresia ARNm Ctsq a fost mai mică (p = 0,009), iar Pcdh12 (p = 0,0003) și expresia ARNm Cx31,1 (p = 0,002) au fost mai mari, în placentele UN comparativ cu HF. Datele sunt parcele cu cutii cuantile cu 95% diamante de încredere CI. p Analiza semicantitativă a intensității colorării P-gp imunoreactive și a BCRP în zonele spongiotrofoblastice și labirintice în placentele CON, UN și HF la GD18.5 (consultați Figura 6B pentru imagini reprezentative). Datele sunt parcele cu cutii cuantile cu 95% diamante de încredere CI.

(consultați Figura 6B pentru imagini reprezentative). Datele sunt parcele cu cutii cuantile cu 95% diamante de încredere CI.

Deoarece studiul nostru are o secțiune transversală în proiectare, nu suntem în măsură să stabilim punctul în care creșterea fetoplacentară (și, de asemenea, structura și funcția placentei) au început să fie afectate de aceste expuneri nutriționale și dacă traiectoria dezvoltării și funcției placentare a divergut în sarcinile ONU și HF în același timp în timpul gestației. Fenotipurile placentare timpurii sunt importante de caracterizat, deoarece modul în care placenta răspunde la provocările secundare ulterioare în timpul gestației va fi, fără îndoială, influențat de modul și de viteza în care se adaptează la expunerile precoce ale sarcinii și acest lucru este valabil mai ales atunci când vorbim despre transportul și funcții de barieră selectivă 41. Studiile viitoare ar trebui să examineze impactul dietelor ONU și HF asupra placentei longitudinal și să raporteze schimbările în dezvoltarea, structura și funcția acesteia cu evaluări longitudinale detaliate ale creșterii fetale, compoziției corpului și nivelurilor circulante de lipide și inflamatorii, atunci când este posibil.

În concluzie, am folosit o abordare inovatoare pentru a caracteriza și a înțelege adaptările placentare la șoareci la două adversități nutriționale obișnuite, subnutriția și dieta bogată în grăsimi/bogată în calorii, într-un efort de a explica de ce făturile cresc diferit în funcție de mediile la care sunt expuși. uterul. Studiul nostru umple lacune importante de cunoștințe prin evaluarea arhitecturii placentare, a dezvoltării și a funcției și a spectrului de malnutriție, care poate avea un impact asupra dezvoltării fetoplacentare independent de compoziția corpului matern. În plus, evaluarea noastră atât a transportului de nutrienți, cât și a transportului xenobiotic este esențială pentru a înțelege numeroasele sarcini la nivel global în care există mai multe adversități, inclusiv o nutriție deficitară, boli infecțioase și inflamații și utilizarea de medicamente sau medicamente. Descoperind relațiile dintre expunerile nutriționale adverse și dezvoltarea și funcția placentară, putem înțelege mai bine de ce unii fături sunt expuși riscului de dezvoltare compromisă sau sunt protejați de aceștia. Acest lucru poate informa abordările nutriționale adaptate femeilor înainte și în timpul sarcinii pentru a optimiza dezvoltarea fetală și pe termen lung, creșterea postnatală și sănătatea pe tot parcursul vieții.

Contribuții și note ale autorului

Contribuții: Conceptualizare, KLC, SJL, EB; metodologie KLC, MK, EB; anchetă, KLC, EM, MK, EB, TTNN; curarea datelor, analiza formală, KLC, EB; scris - pregătire originală a proiectului, KLC; scris - recenzie, KLC, EB, MK, SJL, SGM, TTNN, EM. Această cercetare a fost finanțată de Institutele Canadiene de Cercetare în Sănătate (CIHR) (acordă MOP-81238 și FDN-143262 către SJL, Fellowship MFE-246638 către KLC și acordă 452740 către SGM). KLC este susținut de Consiliul de Cercetări în Științe Naturale și Inginerie din Canada, Fundația de Cercetare Perinatală Molly Towell (New Investigator), Oficiul de Cercetare al Universității Carleton și CIHR. EB este finanțat de Consiliu Național de Dezvoltare Științifică și Tehnologică (CNPq; 422410/2016-0).

Autorii nu au interese concurente și nimic de dezvăluit. Acest articol conține figuri și tabele suplimentare.

Mulțumiri

Îi mulțumim lui Richard Maganga pentru asistența sa la lucrarea animalelor și lui Ricardo Henriques, de la University College London, pentru că a împărtășit șablonul său bioRxiv, pe care l-am modificat ușor pentru utilizare aici.