Abstract

fundal

Calcificarea arterială este un factor de risc cardiovascular semnificativ la pacienții cu hemodializă. O serie de factori sunt implicați în procesul de calcificare arterială; cu toate acestea, relația dintre malnutriție și calcificarea arterială este încă neclară.

Metode

68 de pacienți cu hemodializă au fost înrolați în acest studiu. Starea nutrițională a fost evaluată utilizând o evaluare globală subiectivă cantitativă modificată (MQSGA). Au fost măsurați parametrii biochimici serici înrudiți. Și probele de arteră radială au fost colectate în timpul operațiilor de fistulă arteriovenoasă. Pata de hematoxilină/eozină a fost utilizată pentru a observa structurile arteriale, în timp ce pata roșie de Alizarină pentru a observa depozitele calcificate și a clasifica gradul calcificat. Expresiile proteinei morfogenetice osoase 2 (BMP2) și ale proteinei Gla matrice (MGP) au fost detectate prin imunohistochimie și metode western blot.

Rezultate

66,18% dintre pacienții cu hemodializă au fost malnutriți. La pacienții cu hemodializă, depozitele calcificate au fost localizate în principal în stratul medial al arterelor radiale, iar expresiile BMP2 și MGP au fost ambele crescute în zonele calcificate. Nivelurile de albumină serică au fost asociate negativ cu scorul de calcificare și expresiile BMP2 și MGP. În timp ce scorul MQSGA, fosforul seric și produsul de calciu × fosfor au prezentat relații pozitive cu scorul de calcificare și expresiile BMP2 și MGP.

Concluzii

Malnutriția este predominantă la pacienții cu hemodializă și este asociată cu calcificarea arterială și expresiile BMP2 și MGP în arterele radiale calcificate. Malnutriția poate fi un nou candidat inductor pentru calcificarea arterială la pacienții cu hemodializă.

fundal

Calcificarea arterială este un factor de risc major al mortalității cardiovasculare, în special la pacienții cu hemodializă [1]. Crește rigiditatea arterială, viteza undei pulsului, scade complianța arterială și duce în cele din urmă la evenimente cardiovasculare severe [2, 3].

Calcificarea arterială este considerată în mod tradițional a fi un proces pasiv; cu toate acestea, studii recente au arătat că calcificarea arterială este un proces reglementat activ și o serie de factori sunt implicați în acest proces [4]. Proteina morfogenetică osoasă 2 (BMP2) și proteina matrice Gla (MGP) sunt două proteine ​​critice strâns legate, care reglează calcificarea arterială [5]. Și BMP2 sa dovedit a fi un promotor pentru calcificarea arterială, în timp ce MGP este considerat a fi un inhibitor al calcificării arteriale [6, 7]. Cu toate acestea, încă nu este clar care este factorul cheie asociat cu prevalența calcificării arteriale și expresiile BMP2 și MGP în boala renală în stadiu final (ESRD).

Malnutriția este, de asemenea, un factor esențial asociat cu morbiditatea și mortalitatea crescută la pacienții cu hemodializă [8]. Cu toate acestea, dacă malnutriția participă la procesul de calcificare arterială și se asociază cu expresiile BMP2 și MGP nu este bine înțeles. În prezentul studiu, am estimat starea nutrițională a pacienților cu hemodializă și am investigat rolul malnutriției în procesul de calcificare arterială.

Materiale și metode

Pacienți

Colectarea datelor caracteristice demografice și evaluarea stării nutriționale

Datele caracteristice demografice au fost colectate după cum urmează: sex, vârstă, înălțime, greutate, boli primare, complicații și durata hemodializei.

Evaluarea subiectivă globală cantitativă modificată (MQSGA), o metodă bună de evaluare a stării nutriționale, a fost utilizată special pentru pacienții cu ESRD. În acest studiu, am folosit MQSGA pentru a evalua starea nutrițională a pacienților înrolați cu hemodializă. MQSGA constă din șapte componente: schimbarea greutății, simptome gastro-intestinale, aport alimentar, capacitate funcțională, comorbiditate, grăsime subcutanată și semne de irosire musculară. Fiecare componentă are un scor de la 1 (normal) la 5 (foarte sever). „Scorul de malnutriție” este un număr între 7 (normal) și 35 (subnutrit sever) [9]. Pe baza scorului MQSGA, s-au clasificat două grupuri: grupul de nutriție normală (scor de 7-10) și grupul de malnutriție (scor de 11-35).

Colectarea datelor biochimice

Înainte de operație, probele de sânge au fost colectate în tuburi care conțin acid etilendiaminetetraacetic (EDTA) și apoi depozitate la -20 ° C înainte de a fi analizate. Calciul seric, fosforul seric, albumina, trigliceridele, colesterolul total (TG), colesterolul lipoproteinelor cu densitate scăzută (LDL-c) și colesterolul lipoproteinelor cu densitate ridicată (HDL-c) au fost măsurate utilizând autoanalizatorul TBA-120, Toshiba Medical Systems, Japonia).

Nivelurile serice ale hormonului paratiroidian intact (PTH) au fost evaluate prin metoda chemiluminescenței (Immulyte 2000; DPC, Los Angeles, CA). Calciul × fosfor (Ca × P) a fost calculat pe baza calciului seric și a fosforului seric. Calciu seric 1 mmol/L = 4 mg/dl, fosfor seric 1 mmol/L = 3,1 mg/dl, calciu seric ajustat (mg/dl): calciculm seric + 0,8 × [4-sAlb (albumina serică) (g/dl )]].

Analiza histologică

Un segment circumferențial de 2-3 mm al arterei radiale a fost excizat de la pacienți în timpul operațiilor de fistulă arterio-venoasă și plasat imediat în soluție salină. Probele au fost disecate fără grăsimi și subcutanate, fixate peste noapte în paraformaldehidă 4% și apoi încorporate în parafină. Secțiunile de țesut cu grosimea de 4 μm au fost preparate și colorate cu hematoxilină/eozină (HE, Beyotime Institute of Biology, Suzhou, China). Și roșu de alizarină (Genmed Scientifics Inc. SUA).

EL pata

3 până la 5 secțiuni pe specimen au fost deparafinate și hidratate la apă. Colorați nucleii cu hematoxilină timp de 10 minute. Apoi clătiți cu apă curentă de la robinet timp de 10 minute. După deshidratarea a 5 secunde în alcool 95%, secțiunile au fost contracolorate cu eozină de la 30 secunde la 2 minute, în funcție de vârsta eozinei și de adâncimea contracolorului dorit. Deshidratați în 95% alcooli 2 minute și repetați o dată pentru a îndepărta excesul de eozină. La microscop, am putut vedea cum nucleele erau colorate în albastru, în timp ce citoplasma era colorată în roz.

Pete roșii de alizarină

Pata roșie de alizarină este o metodă dependentă de PH pentru diferențierea oxalatului de calciu de carbonatul de calciu și fosfatul. 3 până la 5 secțiuni pe specimen au fost deparafinate și hidratate până la apă distilată. Patați diapozitivele cu soluția roșie de alizarină timp de aproximativ 2 minute. Scoateți excesul de vopsea și secțiunile de ștergere. Se deshidratează în acetonă și apoi în soluție de acetonă-xilen (1: 1). Se curăță în xilen și se montează într-un suport de montare sintetic. La microscop, am putut observa că depunerile de calciu (cu excepția oxalatului) au fost colorate în roșu portocaliu.

Scorul de calcificare histologică

Scorul de calcificare histologică a fost obținut prin calcularea tuturor scorurilor din toate secțiunile de colorare roșie de Alizarin și a fost clasificat de la 0 la 4 [10]. Un scor de 2,5 până la 4 = calcificare severă. Conform scorului petei roșii de Alizarin, am clasificat pacienții în trei grupe: grupul necalcificat (NC), grupul ușor calcificat (SLC) și grupul sever calcificat (SEC).

Pata imunohistochimică

3 până la 5 diapozitive necolorate ale fiecărei secțiuni de țesut au fost deparafinizate în xilen și rehidratate în achohol descendent. Lamele au fost apoi plasate în peroxid de hidrogen 3% pentru a inhiba peroxidaza endogenă. După spălare în ser fiziologic Tris, secțiunile au fost blocate de 3% ser albumină bovină (Sigma-Aldrich Tradign Co., Ltd.) timp de 15 minute și apoi incubate cu anticorp primar la diluții adecvate peste noapte. Anticorpii utilizați au fost: BMP2 (1: 100, Abcam) și MGP (1: 100, Santa Cruz Biotechnology). Colorarea fără anticorpul primar întrerupt ca un control negativ. Al doilea anticorp peroxid conjugat capră-șoarece (Weijia, Guangzhou, China) la diluarea 1: 400 a fost aplicat timp de 45 de minute, dezvoltat cu DAB (Weijia, Guangzhou, China), iar secțiunile au fost colorate cu Harris Hematoxylin (Weijia, Guangzhou ), China).

Analiza imunohistochimiei

Expresiile BMP2 și MGP au fost analizate semicantitativ cu sisteme de analiză digitală Image Pro plus 6.0 (Media Cybernetics, SUA). La microscopul cu lumină, valoarea densității optice medii (MODV) a celulelor a fost calculată la 5 câmpuri vizuale aleatoriu. MODV a reprezentat densitatea proteinelor pozitive. Valoarea medie a valorii măsurate a fost utilizată ca valoare finală pentru calcul.

Analiza Western blot

Țesuturile arterei radiale au fost omogenizate în 250 μ de tampon de omogenizare cu ajutorul unui agitator electronic. Concentrația de proteine ​​a fost determinată cu kit BCA (Biocolors, Shanghai, China).

Cantități egale (30 μg) de proteine ​​totale au fost apoi separate prin electroforeză pe geluri de poliacrilamidă-SDS și transferate pe o membrană difluorură de poliviniliden (membrane imobilon-P; Millipore, Bedford, MA) folosind metoda umedă. Membranele au fost spălate și blocate cu 5% lapte uscat fără grăsime în tampon TBS/T timp de 1 oră la temperatura camerei. Apoi, membranele au fost incubate peste noapte la 4 ° C cu anticorpi primari: anti-BMP2 de șoarece (1: 1000) și anti-MGP de șoarece (1: 1000) și anti-β-actină de șoarece (1: 1000, Weijia, Guangzhou, China). După spălare, membranele au fost incubate cu anticorp secundar conjugat cu peroxidază de capră (1: 5000, Weijia, Guangzhou, China) și apoi vizualizate cu un kit ECL (Thermo Scientific, SUA) conform instrucțiunilor. Benzile specifice au fost cuantificate prin software-ul Quantity One (Bio-Rad, SUA).

analize statistice

Datele sunt exprimate ca medie ± eroare standard (SEM). Întrucât nu fiecare variabilă a fost distribuită în mod normal, corelația coeficientului Pearson și corelația Spearman Rank au fost utilizate pentru a evalua relația dintre scorul de calcificare, expresiile BMP2 și MGP, scorul MQSGA și mai mulți factori de risc legați de calcificare. Au fost utilizate analize de regresie liniară multiple pentru a estima factorii care au afectat calcificarea arterială. Testul ANOVA și testul Kruskal-Wallis au fost utilizate pentru compararea caracteristicilor biochimice și a scorului MQSGA între diferitele grupuri calcificate. Valoarea P

Rezultate

Caracteristici demografice și biochimice la pacienții cu hemodializă

Un total de 68 de pacienți (35 bărbați și 33 femei) supuși hemodializei au fost incluși în acest studiu. Vârsta medie a pacienților a fost de 62 ± 2,15 ani. Aproape fiecare pacient (92,31%) a avut antecedente de hipertensiune, în timp ce aproximativ o treime (30,77%) dintre pacienți au suferit diabet. Durata medie a hemodializei a fost de 5,6 luni. Am grupat pacienții în funcție de scorul MQSGA. 45 de pacienți (66,18%) au fost malnutriți. Caracteristicile demografice și biochimice ale celor două grupuri au fost prezentate în tabelul 1. Comparativ cu grupul de nutriție normală, grupul de malnutriție a prezentat greutate corporală semnificativ mai mică (56,79 ± 1,56 kg vs. 61,93 ± 1,76 kg, p = 0,046) și indicele de greutate corporală (IMC) (21,18 ± 0,46 g/m 2 vs. 23,00 ± 0,54 g/m 2, p = 0,018) și un scor MQSGA semnificativ mai mare (25,28 ± 1,13 vs. 8,26 ± 1,73, p Tabelul 1 Caracteristici demografice și biochimice la pacienții cu hemodializă

Calcificarea medială localizată în arterele radiale ale pacienților cu hemodializă

Pentru a observa structurile și depunerile calcificate în arterele radiale ale pacienților cu hemodializă, s-au efectuat pete roșii cu HE și Alizarin, iar datele reprezentative au fost prezentate în Figura 1A-F. Rezultatele colorării cu roșu de alizarină au arătat că 46,15% (31/68) din arterele radiale au avut grade diferite de depozite calcificate, iar depozitele calcificate au fost localizate în principal în stratul medial (Figura 1D-F). Am grupat pacienții cu hemodializă pe baza petei roșii de Alizarin și am calculat scorurile de calcificare în funcție de gradul calcificat al arterelor radiale. Scorul mediu de calcificare a fost de 0,34 pentru grupul NC, 1,84 pentru grupul SLC și 3,44 pentru grupul SEC. În plus, colorația HE (Figura 1A-C) a arătat, de asemenea, că stratul medial al arterelor radiale calcificate a fost crescut.

malnutriție

Pete de hematoxilină/eozină (HE, A-C) și roșu de alizarină (D-F) ale arterelor radiale ale pacienților cu hemodializă malnutrițională. EL pata (A-C) a arătat că grosimea stratului medial a fost mărită odată cu gradul calcificat. Și pata roșie de Alizarin (D-F) a demonstrat că depozitele calcificate erau localizate în principal în stratul medial al arterelor radiale. Abreviați: NC, necalcificat; SLC, ușor calcificat; SEC, sever calcificat.

Caracteristici biochimice

Tabelul 2 a arătat caracteristicile biochimice serice aferente și scorurile MQSGA ale pacienților cu hemodializă. Comparativ cu grupul NC, grupurile SLC și SEC au avut niveluri semnificativ crescute de fosfor seric, Ca × P și niveluri semnificativ scăzute de albumină serică. Și însoțit de gradul calcificat al arterelor radiale, scorul MQSGA a crescut semnificativ. Apoi am analizat relația dintre gradul calcificat și nivelurile de fosfor seric, Ca × P și albumina serică. Rezultatele au indicat că gradul calcificat a fost semnificativ corelat pozitiv cu nivelurile de fosfor seric (r = 0,726, p Figura 2

(A-D) Relația dintre scorul de calcificare și nivelurile fosforului seric, produsului calciu × fosfor, albuminei serice și scorul modificării cantitative subiective globale (MQSGA). Nivelurile de fosfor seric, produs de calciu × fosfor și scorul MQSGA au avut o relație pozitivă cu scorul de calcificare (Figura 2A, B, D), în timp ce nivelurile de albumină serică au prezentat o corelație negativă (Figura 2C).

Expresii crescute ale BMP2 și MGP în arterele radiale calcificate

BMP2 și MGP sunt două proteine ​​critice care reglementează procesul de calcificare arterială. Imunomarcarea ambelor proteine ​​a fost aproape exclusiv în stratul media și proeminentă în zonele calcificate (Figura 3A-F). MODV care a reprezentat densitatea proteinelor pozitive a arătat că ambele expresii ale BMP2 și MGP au fost treptat crescute semnificativ, răspunzând la gradul calcificat (Figura 3G). Rezultatele Western blot au demonstrat, de asemenea, că expresiile BMP2 și MGP au crescut semnificativ odată cu gradul calcificat (Figura 4). Iar raportul MGP/BMP2 în grupul NC, SLC și SEC a fost de 1,27, 1,2 și respectiv 0,78.

(A-G) Rezultatele imunoculturii proteinei morfogenetice osoase-2 (BMP2) și proteinei Gla matrice (MGP). Atât grupul ușor calcificat (SLC), cât și grupul sever calcificat (SEC) au avut expresii semnificativ mai mari de BMP2 și MGP în arterele radiale ale pacienților cu hemodializă decât grupul non-calcificat (NC) (Figura 3A-G). Și comparând cu grupul SLC, grupul SEC a arătat, de asemenea, expresii semnificativ crescute ale BMP2 și MGP (Figura 3B-C, E-G).

Rezultatele Western blot ale proteinelor morfogenetice osoase-2 (BMP2) și ale proteinei Gla matrice (MGP). Comparativ cu grupul necalcificat (NC), atât grupul ușor calcificat (SLC), cât și grupul sever calcificat (SEC) au avut expresii semnificativ crescute ale BMP2 și MGP în arterele radiale ale pacienților cu hemodializă. Și grupul SEC a avut, de asemenea, expresii semnificativ mai mari de BMP2 și MGP decât grupul SLC.

Relațiile dintre BMP2/MGP și fosforul seric, calciul × produsul fosforului, albumina serică și scorul MQSGA

Am explorat relațiile dintre expresiile BMP2 și MGP și factorii legați de calcificare. Tabelul 3 a arătat că atât nivelurile de fosfor seric, cât și produsul de calciu × fosfor s-au corelat pozitiv cu expresiile BMP2 și MGP în arterele radiale ale pacienților cu hemodializă. În schimb, nivelurile serice de albumină au fost semnificativ corelate negativ cu expresiile BMP2 și MGP. Mai mult, s-a arătat că expresiile BMP2 și MGP au avut relații pozitive cu scorul MQSGA (Tabelul 3).

Discuţie

Acest studiu a demonstrat că la pacienții cu hemodializă prevalează malnutriția. Și pacienții subnutriți au o rată mare de incidență a calcificării arterelor radiale. În plus, expresiile BMP2 și MGP au fost crescute în arterele radiale calcificate. Pentru prima dată la pacienții cu hemodializă, după cunoștințele noastre, am demonstrat că malnutriția (un scor ridicat MQSGA și un nivel scăzut de albumină serică) a fost strâns asociată cu calcificarea arterială și expresiile BMP2 și MGP. Mai mult, factorii de risc certi, cum ar fi fosforul seric și produsul Ca × P, au fost corelați cu gradul calcificat similar studiilor anterioare [11].

BMP2 și MGP sunt două proteine ​​strâns legate în timpul procesului de calcificare arterială. BMP2 aparține superfamiliei TGF-β (factor de creștere transformant β) a factorilor de creștere și a fost demonstrat că joacă un rol cheie în procesul de calcificare arterială [19, 20]. MGP, proteina dependentă de vitamina K, se leagă de BMP2 și acționează ca un inhibitor de calcificare endogen [21]. Deoarece atât BMP2 cât și MGP participă la procesul de calcificare arterială, am observat expresiile BMP2 și MGP în arterele radiale calcificate ale pacienților cu hemodializă. Am constatat că expresiile BMP2 și MGP au crescut simultan în arterele radiale calcificate. Între timp, scorul MQSGA a fost corelat pozitiv cu expresiile BMP2. Și nivelurile de albumină serică au arătat o corelație negativă cu expresiile BMP2. Aceasta oferă dovezi indirecte că malnutriția are o relație cu calcificarea arterială.

Interesant, am constatat, de asemenea, că expresiile crescute ale MGP nu au arătat un efect inhibat de BMP2 pentru calcificarea arterială. Acest lucru se poate atribui raportului MGP/BMP2 sau formelor de MGP. Zebboudj și colab. a demonstrat că MGP a reglat în funcție de doză activitatea BMP2 și a crescut calcificarea [5, 22]. În studiul de față, raportul MGP/BMP2 a scăzut odată cu gradul calcificat, ceea ce indică faptul că raportul mai mic dintre MGP/BMP2, cu atât se dezvoltă calcificarea arterială mai severă. Mai mult, MGP există forme carboxilate și necarboxilate și care ar putea influența procesul de calcificare în mod diferit. În studiul nostru, am constatat că expresiile MGP au fost crescute în arterele radiale calcificate umane în condiții de hemodializă. Două explicații posibile sunt că MGP crescut poate fi forma necarboxilată care nu a arătat niciun efect pentru inhibarea calcificării arteriale sau doar un răspuns la procesul calcificat, dar nu o cauză primară a calcificării arteriale. Cu toate acestea, din moment ce lipsește evaluarea MGP necarboxilat, sunt necesare mai multe studii la om și animale pentru a explora rolul MGP în calcificarea arterială.

Concluzii

Malnutriția este un posibil mecanism de calcificare arterială la pacienții cu hemodializă. Tratamentul eficient al malnutriției va fi o strategie promițătoare pentru atenuarea calcificării arteriale și scăderea morbidității și mortalității evenimentelor cardiovasculare la pacienții cu hemodializă.