Molecular
Medicament
Rapoarte

• Ultimii doi ani
• Total

• Anul trecut 0
• Total

• Luna trecuta
• Anul trecut
• Total

• Xiaoqing Yi
• Xuan Cai
• Sisi Wang
• Yanfeng Xiao

Acest articol este menționat în:

Abstract

Introducere

Mecanismele care stau la baza prevalenței ridicate a diabetului zaharat de tip 2 (T2DM) la persoanele obeze rămân neclare (1). Rezistența la insulină și disfuncția celulelor β din insulă sunt considerate în prezent ca două mecanisme patogene cheie în progresia obezității către diabet (2). Când diferiți factori duc la rezistența la insulină la pacienții obezi, celulele β compensează prin creșterea secreției de insulină pentru a menține un nivel normal de glucoză din sânge și toleranță la glucoză; cu toate acestea, atunci când cantitatea de insulină produsă de celulele β este insuficientă pentru a compensa sensibilitatea redusă la insulină a țesuturilor, homeostazia glucozei este perturbată, ducând la o toleranță redusă la glucoză și, în cele din urmă, la diabet (3).

În urma dezvoltării ER, acumularea unei cantități mari de proteine ​​în lumenul ER induce calea de semnalizare a răspunsului proteic desfășurat în aval (UPR) (10). UPR indus de ER poate activa selectiv trei căi de transducție a semnalului în celule; o serie de studii au indicat faptul că activarea protein kinazei AR kinază tip ARN (PERK) și a enzimei care necesită inozitol 1α (IRE1α) căile de semnalizare joacă roluri importante în mecanismele patogenetice care stau la baza disfuncției celulelor β (4,11). Cu toate acestea, se știe puțin despre influența factorului de transcripție activant 6 (ATF6) asupra funcțiilor celulelor β. S-a demonstrat că factorii care induc ER, cum ar fi hipoxia, tunicamicina și thapsigargina, pot regla expresia mARN-ului ATF6, indicând faptul că creșterea expresiei ATF6 este importantă pentru răspunsurile ER și că ATF6 poate avea un rol în disfuncția dezvoltării celulare, similar cu IRE1 și PERK (12).

În prezentul studiu, s-a investigat dacă a existat o ER excesivă în insulele șoarecilor obezi induși cu dietă bogată în grăsimi (HFD) și au fost evaluate efectele ER asupra funcției celulelor β. Ulterior, s-a determinat dacă concentrațiile mari de palmitat (PA) au indus ER în celulele INS-1 cultivate și dacă ER au afectat transcripția genei insulinei. În cele din urmă, a fost evaluat dacă transcripția genei insulinei afectate de ER a fost mediată de ATF6.

Materiale și metode

Șoareci agățați induși de HFD

În total, 36 de șoareci C57BL/6J (bărbați; 3 săptămâni; greutate inițială, 8,5-10 g) au fost obținuți de la Xi'an Jiaotong University Animal Center. Șoarecii au fost adăpostiți în cuști individuale. Șoarecii au primit acces la alimente și apă ad libitum, iar temperatura a fost controlată la 26-28 ° C. Umiditatea relativă a fost de 40-60% și o lumină de 10:14 h: ciclu întunecat a fost menținut în fiecare zi. După hrănirea adaptivă cu o dietă normală timp de 1 săptămână, șoarecii au fost împărțiți aleatoriu într-un grup de dietă normală și un grup HFD (18 șoareci/grup) și apoi hrăniți cu o hrană generală sau hrană bogată în grăsimi timp de 16 săptămâni. Pe bază calorică, HFD consta din 40% grăsimi din untură, 41,8% carbohidrați și 18,2% proteine, în timp ce dieta normală conținea 13,8% grăsimi, 60,5% carbohidrați și 25,7% proteine. Greutatea corporală a fost măsurată o dată pe săptămână la o oră fixă.

Studiul a fost aprobat de Comitetul de etică a animalelor de la Universitatea Xi'an Jiaotong (permis nr. 2017-30). Studiul a fost realizat în strictă conformitate cu recomandările Ghidului pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator de la Institutele Naționale de Sănătate și cu Liniile directoare AVMA pentru eutanasierea animalelor Ediția 2013 (13,14).

Test de toleranță intraperitoneală la glucoză (IPGTT) și test de eliberare a insulinei

După 16 săptămâni, șoarecii au fost postiti timp de 15 ore și supuși unei injecții intraperitoneale de glucoză 25% la 2 g/kg greutate corporală. Nivelurile de glucoză din sânge în vena cozii au fost măsurate înainte de injecție și la 30, 60 și 120 de minute după injectare folosind un glucometru. Probele de sânge venos (0,1 ml/probă) au fost colectate din plexul venos retro-orbital înainte de injectare și la 30, 60 și 120 de minute după injectare. Toate animalele au fost anesteziate cu pentobarbital de sodiu (40 mg/kg, intraperitoneal) pentru prelevarea de sânge retro-orbital. Probele de sânge au fost centrifugate timp de 15 minute la 1.000 × g la 4 ° C, apoi probele de ser au fost colectate și depozitate la -70 ° C. ELISA a fost utilizat pentru detectarea insulinei (trusa ELISA pentru insulină de șoarece; nr. Cat. F6301; Westang Biological Technology Co., Ltd.).

Analiza imunohistochimică

Microscopie electronică

Șoarecii au fost sacrificați și țesuturile pancreatice au fost recoltate așa cum s-a descris mai sus. Probele pancreatice au fost tăiate în cuburi mici (1 mm 3) și plasate imediat într-o soluție fixativă de glutaraldehidă 2,5% (conținând 0,1 M PBS și 4% paraformaldehidă) la 4 ° C timp de> 2 ore. După clătire cu PBS, probele au fost fixate într-o soluție de tetroxid de osmiu 2% la 4 ° C timp de 2 ore și amestec de rășină epoxidică/oxid de propilenă 1: 1 timp de 1 oră la 37 ° C. Probele au fost încorporate în rășină epoxidică timp de 1 oră la 37 ° C și polimerizate la 60 ° C peste noapte pentru secționare ultra-subțire (grosime, 100 nm). Probele au fost colorate cu acetat de uranil și citrat de plumb la temperatura camerei timp de 30 de minute. Secțiunile au fost examinate sub un microscop electronic cu transmisie H-600 (Hitachi, Ltd.) la 80 kV.

Cultură de celule

Linia celulară de insulinom de șobolan INS-1 (Biohermes Biomedical Technology Co., Ltd.) a fost cultivată în aer 5% CO 2 −95% la 37 ° C în mediu RPMI-1640 (nr. De cod 22400071; Thermo Fisher Scientific, Inc .) conținând 11,1 mM glucoză și 2 mM l-glutamină. Mediul a fost suplimentat cu 10% FBS (nr. Cod SV30087; Thermo Fisher Scientific, Inc.), 1 mM piruvat, 10 mM HEPES, 0,05 mM 2-mercaptoetanol, 100 U/ml penicilină și 100 mg/ml streptomicină. Toate experimentele au fost efectuate folosind celule INS-1 între pasajele 20 și 30. Pregătirea mediilor de cultură care conțin PA (nr. Cat. P9767; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) a fost efectuată după cum urmează: Concentrația de PA a fost 0,5 mM, iar concentrația finală de BSA fără acizi grași a fost 0,1 mM. Prin urmare, raportul molar dintre PA: BSA a variat între 1: 1 și 5: 1. Toate condițiile de control conțineau aceleași cantități de BSA ca cele cu PA. Grupul de control normal conținea mediu RPMI-1640 cu 10% FBS. Grupul de control BSA conținea mediu RPMI-1640 cu 0,5% BSA, iar grupul de tratament PA conținea mediu RPMI-1640 cu 0,5 mM PA și 0,5% BSA.

Analiza Western blot

Transcriere inversă-PCR cantitativă (RT-qPCR)

Pentru RT-qPCR, ARN-ul total a fost izolat din celulele INS-1 folosind reactiv TRIzol® (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.). ADNc a fost sintetizat utilizând un kit PrimeScript ® RT Master Mix (Takara Bio, Inc.), conform protocoalelor producătorului. ADNc rezultat a fost utilizat pentru analiza qPCR folosind un sistem SYBR® Premix Ex Taq ™ II (Takara Bio, Inc.). Pentru amplificarea PCR s-a folosit următorul protocol: 95 ° C timp de 30 sec, urmat de 40 de cicluri de 95 ° C timp de 5 sec și 60 ° C timp de 30 sec. qPCR a fost efectuat într-un sistem Bio-Rad IQ5 (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Au fost utilizați următorii primeri: ATF6, 5'-ACAAGACCGAAGATGTCCATTGTG-3 ', 5'-GATCCTGGTGTCCATGACCTGA-3' invers; insulină, înainte 5'-CAGCACCTTTGTGGTTCTCACTT-3 ', invers 5'-CTCCACCCAGCTCCAGTTGT-3'; și GAPDH, înainte 5'-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3 'și invers 5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3'.

Produsele amplificate au fost analizate prin electroforeză pe gel de agaroză (2% agaroză) pentru a valida analiza qPCR. Bromura de etidiu (nr. Cat. E1385; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) a fost utilizată pentru vizualizare. Curba standard și valorile corespunzătoare pentru fiecare probă au fost determinate utilizând sistemul Bio-Rad IQ5. GAPDH a fost utilizat ca control intern, iar metoda 2 −ΔΔCq a fost utilizată pentru a calcula nivelurile relative de expresie ale genelor țintă (15).

Analiza imunofluorescenței (localizarea nucleară a ATF6)

Celulele au fost placate pe pahare de acoperire înainte de a le incuba timp de 48 de ore în mediul de cultură standard descris în secțiunea „Cultură celulară”. După cultivare timp de 24 de ore în mediu conținând 0,5 mM PA, celulele au fost fixate în paraformaldehidă 4% la temperatura camerei timp de 20 min și permeabilizate în Triton X-100 la temperatura camerei timp de 30 min. Celulele au fost pre-incubate cu 2% BSA (nr. Cat. C500626; Sangon Biotech Co., Ltd.) timp de 10 minute la temperatura camerei. Apoi celulele au fost incubate cu anticorp ATF6 peste noapte la 4 ° C (1: 100; nr. Cat. Ab11909; Abcam) și ulterior anticorpul secundar conjugat Cy3® 1 oră la 4 ° C (1: 100; nr. Cat. Nr. BA1031, Boster Biological Technology). Nucleii au fost colorați cu DAPI timp de 15 minute la temperatura camerei, iar probele au fost montate în glicerol și observate la microscopul cu fluorescență cu mărirea × 40.

Transfecție mică de ARN interferent (si) pentru ATF6

analize statistice

figura 1.

Figura 2.

Figura 3.

Microscopia electronică a microstructurilor ER la șoareci obezi. Triunghiurile goale roșii indică zonele prezentate în imaginile de mai jos. Săgeată goală: ER dură normală din grupul normal. Săgeată roșie: Dilatare, degranulare și modificări asemănătoare vacuole ale ER aspre la șoareci obezi. Triunghi roșu: cromatină condensată în nucleu. Triunghi roșu gol: mitocondrii umflate. Cercul roșu: spațiu perinuclear extins. ER, reticul endoplasmatic.

ER induse de PA în celulele INS-1

Pentru a confirma dacă mediul cu lipide ridicate a indus ER-celule β, celulele INS-1 au fost cultivate într-un mediu cu lipide ridicate, iar expresia proteinei ATF6 în celule a fost măsurată prin analiza Western blot (Fig. 4). Nivelul de expresie al proteinei ATF6 în grupul de control BSA nu a fost semnificativ diferit în comparație cu cel al grupului de control normal. Cu toate acestea, în prezența 0,5 mM PA, expresia ATF6 a crescut semnificativ după expunerea de 24 de ore, ceea ce sugerează că expunerea prelungită la PA poate induce ER.

Figura 4.

Figura 5.

Localizarea nucleară a ATF6 în celulele INS-1 după tratamentul PA. ATF6 a fost vizualizat în roșu, colorarea nucleară DAPI în albastru. ATF6 (săgeți albe) localizate la citoplasma celulelor INS-1 din grupul de control, fără expresie ATF6 în nucleu. Tratamentul cu 0,5 mM PA a indus localizarea nucleară a ATF6 în celulele INS-1; ATF6 a fost exprimat atât în ​​citoplasmă, cât și în nucleu (săgeți goale). Mărire, × 40. ATF6, activând factorul de transcripție 6; PA, palmitat.

ER în celulele INS-1 afectează expresia genei insulinei

Pentru a confirma dacă ER au influențat expresia genei insulinei, celulele INS-1 au fost cultivate într-un mediu cu lipide ridicate, iar nivelurile de expresie ale ARNm insulinei au fost detectate prin RT-qPCR (Fig. 6). După 24 de ore de incubație, nivelul de expresie al ATF6 în grupul PA a fost semnificativ mai mare comparativ cu cel din grupul de control BSA. În plus, nivelul de expresie al ARNm al insulinei în grupul de control normal nu a fost semnificativ diferit în comparație cu cel din grupul de control BSA. Nivelul de expresie al ARNm insulinei în grupul PA a fost semnificativ redus. Aceste rezultate au sugerat că PA a inhibat expresia mARN-ului insulinei în celulele INS-1.

Figura 6.

Figura 7.

Figura 8.

În condiții normale, ATF6 interacționează cu proteina ER care leagă proteina imunoglobulină/GRP78 și este reținută în membrana ER (35). În timpul ER, acumularea de proteine ​​desfășurate induce transferul de ATF6 în aparatul Golgi pentru a fi hidrolizat în fragmente active (22). ATF6 activat intră în nucleu pentru a activa elementul de răspuns ER pe regiunile promotor ale mai multor gene pentru a promova plierea corectă a proteinelor în lumenul ER (36). În studiul de față, colorarea cu imunofluorescență a arătat că în celulele INS-1 normale, ATF6 a fost exprimat în principal la un nivel scăzut în citoplasmă, cu aproape nici o expresie în nucleu. Cu toate acestea, în celulele tratate cu PA, s-au observat atât expresia citoplasmatică, cât și cea ATF6 nucleară, cu niveluri de expresie mai mari decât cele observate în celulele normale. Aceste descoperiri au sugerat că în celulele INS-1 tratate cu PA, proteina ATF6 a fost activată și translocată din citoplasmă în nuclei.

Prezentul studiu a folosit șoareci obezi induși de HFD pentru a evalua starea ER în pancreasul șoarecilor obezi și pentru a evalua influența obezității asupra metabolismului glucozei și a funcției celulelor β a insulelor pancreatice în organism. Modificări ale ATF6, o moleculă de semnalizare importantă în procesul ER în celulele β, la nivelurile de proteine ​​și ARNm, și influența sa asupra expresiei mRNA insulinei în celulele β au fost investigate folosind experimente in vitro. Rezultatele au confirmat că activarea căii de semnalizare ATF6 indusă de ER excesive a fost unul dintre potențialele mecanisme care stau la baza disfuncției celulelor β în obezitate. Prezentul studiu a elucidat teoretic mecanismele potențiale care stau la baza prevalenței ridicate a T2DM la pacienții obezi, indicând strategii noi pentru prevenirea și controlul eficient al dezvoltării T2DM legate de obezitate în practica clinică.

Mulțumiri

Finanțarea

Prezentul studiu a fost susținut de Fundația Națională de Științe Naturale din China (subvenția nr. 81673187).

• Este o dietă bogată în carbohidrați legată de cancerul pancreatic Articolul AMP Reuters
• Dieta bogată în grăsimi modulează conținutul de proteine ​​al transportorilor de nutrienți din intestinul subțire al șoarecilor
• Dieta cu conținut ridicat de grăsimi saturate și carbohidrați scade durata de viață independent de greutatea corporală la șoareci
• Metilfenidatul previne învățarea indusă de dieta bogată în grăsimi (HFD) afectarea memoriei la șoarecii juvenili -
• Legătura dintre dieta bogată în grăsimi și bogată în calorii și dezvoltarea cancerului pancreatic găsit la șoareci;