Abstract

Mg 2+ este al doilea cation intracelular cel mai abundent și joacă un rol esențial ca co-factor în multe reacții enzimatice (1). Homeostazia Mg 2+ depinde de echilibrul dintre absorbția intestinală, excreția renală și schimbul cu osul (2). Reglarea echilibrului total al corpului Mg 2+ se află în principal în rinichi, care se potrivește strâns cu absorbția intestinală a Mg 2+. Aproximativ 80% din totalul plasmatic Mg 2+ este filtrat în glomeruli (3,4), majoritatea fiind apoi reabsorbită de-a lungul nefronului (5). Optzeci și cinci la sută din Mg 2+ filtrat este reabsorbit pasiv în tubul proximal și membrul ascendent gros al lui Henle (TAL). Tubulul distal convoluit (DCT) reabsorbe 5-10% din Mg 2+ filtrat, iar rata de reabsorbție în acest segment definește concentrația urinară finală de Mg 2+. Transportul Mg 2+ în DCT este de natură transcelulară și este influențat de restricția dietetică Mg 2+ și de un număr de hormoni (6,7). Cu toate acestea, detaliile moleculare și reglarea acestei căi rămân în mare parte necunoscute (5,6,8,9).

receptorului

Tulburările ereditare cu hipomagneziemie primară au facilitat foarte mult identificarea transportorilor de ioni epiteliali în rinichi. De exemplu, elucidarea bazei genetice a hipomagnezemiei dominante izolate și a hipomagnezemiei cu hipocalcemie secundară a dus la identificarea subunității γ a Na +, K + -ATPazei și a receptorului tranzitoriu epitelial Mg 2+ melastatin 6 (TRPM6), respectiv (10-12). TRPM6, care este membru al superfamiliei TRP, este localizat de-a lungul membranei apicale a DCT. Expresia heterologă în rinichiul embrionar uman 293 celule ale TRPM6, dar nu și TRPM6 mutanți identificați la pacienții cu hipomagnezemie cu hipocalcemie secundară induce un canal cationic permeabil Mg 2+ care este strâns reglat de concentrația intracelulară de Mg 2+ (13). TRPM6 prezintă cea mai mare omologie cu TRPM7, care a fost identificat ca un canal ionic permeabil la Mg 2+, care este necesar în primul rând pentru homeostazia celulară Mg 2+ (13-15).

În analogie cu absorbția activă de Ca 2+ (re) absorbție în partea distală a nefronului și a intestinului subțire prin canalele epiteliale de Ca 2+ (receptor tranzitoriu potențial vaniloid 5 [TRPV5] și TRPV6) (16), procesul de Mg transcelular Transportul 2+ este prevăzut de următorii pași secvențiali. Condus de un potențial transmembranar favorabil, Mg 2+ intră în celula epitelială prin canalul epitelial apical Mg 2+ TRPM6. Apoi, Mg 2+ se va difuza prin citosol pentru a fi extrudat activ pe membrana basolaterală (13). Identitatea moleculară a acestor din urmă transportori Mg 2+ nu este cunoscută. Majoritatea studiilor fiziologice favorizează un mecanism de schimb dependent de Na + (17). Intrarea Mg 2+ pare a fi etapa de limitare a ratei și locul reglementării.

Scopul studiului nostru a fost de a determina locurile de absorbție activă a Mg 2+ la șoareci prin investigarea profilului de expresie al TRPM6. În plus, am stabilit dacă TRPM6 este reglementat de conținutul dietetic de Mg 2+ și de hormonii calciotropi 17β-estradiol (17β-E2), 1,25-dihidroxivitamină D3 (1,25 (OH) 2D3) și hormon paratiroidian (PTH) . Efectul conținutului de Mg 2+ din dietă a fost studiat prin analiza reglării TRPM6 la nivelurile de mARN și proteine ​​și de excreție și niveluri serice de Mg 2+ la șoarecii C57BL6 hrăniți cu diete deficiente, normale și îmbogățite cu Mg 2+.

Materiale și metode

Studii pe animale

Pentru a evalua expresia mRNA TRPM6, TRPM7 și TRPV6 în diferite țesuturi, am construit un panou de ADNc. În acest scop, patru șoareci C57BL6 hrăniți cu o dietă completă care conținea 0,2% Mg 2+ (greutate/greutate; SSNIFF spezialdiäten GmbH, Soest, Germania) au fost uciși; s-au colectat rinichi, splină, creier, inimă, mușchi scheletic, ficat, plămân, stomac, os, duoden, jejun, ileon, cec și colon; iar ARN-ul total a fost izolat. Pentru a studia efectul conținutului dietetic de Mg 2+ asupra expresiei TRPM6 și TRPM7 la rinichi și colon, am hrănit șoareci C57BL6 (vârsta de 12 săptămâni) pentru o dietă de 10 da Mg 2+ (0,005% greutate/greutate Mg) și Mg 2+ -dieta normală (0,19% greutate/greutate Mg) sau o dietă îmbogățită cu 2+ Mg (0,48% greutate/greutate Mg; SSNIFF spezialdiäten GmbH). În ultimele 24 de ore de tratament dietetic, animalele au fost adăpostite în cuști metabolice și s-a colectat urină de 24 de ore. La sfârșitul tratamentului dietetic, au fost prelevate probe de sânge și animale au fost ucise. Țesuturile de rinichi și colon au fost prelevate și congelate imediat în azot lichid.

Efectul 17β-E2 asupra nivelului de expresie al ARNm renal TRPM6 a fost evaluat de șobolani bilaterali, ovariectomizați (OVX) și OVX care au primit 2 × 500 μg 17β-E2/d așa cum s-a descris anterior (18). Efectul PTH a fost studiat de șobolani acționați simul, paratiroidectomizați (PTX) și PTX care au primit 6 unități/zi de PTH bovină așa cum s-a descris anterior (19). În plus, efectul 1,25 (OH) 2D3 a fost studiat de șoareci 1α-hidroxilază knockout (1α-OHază -/-), șoareci heterozigoți (1α-OHază +/−) care sunt fenotip identici cu șoarecii de tip sălbatic, și șoarecii 1α-OHază -/- suplimentați intraperitoneal cu 1,25 (OH) 2D3 așa cum s-a descris anterior (20). Consiliul de etică a animalelor de la Universitatea Radboud din Nijmegen a aprobat toate procedurile experimentale.

Analiza PCR cantitativă în timp real

ARN-ul total a fost extras din rinichi, segmente complete ale intestinului și din celelalte țesuturi folosind TriZol Total ARN Isolation Reagent (Life Technologies BRL, Breda, Olanda) conform protocolului producătorului. ARN-ul obținut a fost supus tratamentului cu DNază (Promega, Madison, WI) pentru a preveni contaminarea ADN genomic. Ulterior, 2 μg de ARN au fost transcrise invers de către virusul leucemiei moloni-murine-transcriptază inversă (Invitrogen) așa cum a fost descris anterior (21). ADNc a fost utilizat pentru a determina nivelurile de expresie a ARNm TRPM6, TRPM7 și TRPV6, precum și nivelurile de ARNm ale genei menajere hipoxantină-guanină fosforibosil transferază (HPRT) ca un control endogen. Nivelurile de expresie ale ARNm au fost cuantificate prin PCR în timp real pe un sistem de detectare a secvenței ABI Prism 7700 (PE Biosystems, Rotkreuz, Elveția). Grundele și sondele care vizează genele de interes au fost proiectate folosind programul de calculator Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, CA) și sunt enumerate în Tabelul 1.

Secvențe ale primerilor și sondelor Taqman pentru PCR cantitativă în timp real

În Vivo 45 Ca 2+ Test de absorbție

Absorbția intestinală a Ca 2+ a fost evaluată în două grupuri de șoareci C57BL6 prin măsurarea cantității de 45 Ca 2+ în ser la punctele timpurii timpurii după gavaj oral (15 μl/g corp greutate). Șoarecii au postit 12 ore înainte de test. Animalele au fost hemodinamic stabile sub anestezie în timpul experimentului. Soluția utilizată pentru măsurarea absorbției de Ca2+ conținea 0,1 mM CaCl2, 125 mM NaCl, 17 mM Tris (pH 7,4) și 1,8 g/L fructoză și a fost îmbogățită cu 20 μCi 45 CaCl2/ml (18 Ci/g; New England Nuclear, Newton, MA). Un grup a primit soluția 45 Ca2+ suplimentată cu MgCl2 la o concentrație finală de 10 mM, în timp ce soluția 45 Ca2+ din grupa 2 nu a fost suplimentată cu MgCl2. Probele de sânge au fost obținute la diferite intervale de timp (2, 4, 8 și 12 min). Radioactiv 45 Ca 2+ a fost analizat în ser (10 μl) prin numărare de scintilație lichidă. Modificarea concentrației serice de Ca 2+ a fost calculată din conținutul de 45 Ca 2+ al probelor de ser și activitatea specifică a Ca 2 administrat+ .

Proceduri analitice

Serul Mg 2+ și Ca 2+ au fost măsurate folosind un kit de testare colorimetrică conform protocolului producătorului (Roche Diagnostics, Woerden, Olanda). Excreția urinară de Mg 2+ și Ca 2+ a fost determinată prin spectrofotometrie de absorbție atomică pe un Perkin Elmer AAnalyst 300 (Perkin Elmer, Milano, Italia).

Imunohistochimie

Colorarea imunohistochimică a fost efectuată pe criozecții de 7 μm ale probelor de rinichi fixe cu periodat-lizină-paraformaldehidă. Secțiunile au fost colorate cu cobai anti-TRPM6 purificat prin afinitate, așa cum s-a descris anterior (13). Fotografiile întregului cortex au fost realizate cu un microscop de fluorescență Zeiss (Sliedrecht, Olanda) echipat cu o cameră foto digitală (Nikon DMX1200). Pentru determinarea semiquantitativă a nivelurilor de proteine, imaginile au fost analizate cu software-ul de analiză a imaginii Image Pro Plus 4.1 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD), rezultând cuantificarea nivelurilor de proteine ​​ca medie a densității optice integrate (22).

Analize statistice

Valorile sunt exprimate ca medie ± SEM. Diferențele dintre grupuri au fost testate cu ANOVA unidirecțional și evaluate ulterior folosind procedura de comparație multiplă Fisher. Diferențele în mediile cu absorbție P2+ în raport cu absorbția transcelulară Ca2+, am cuantificat nivelurile de expresie ale ARNm ale TRPM6, TRPM7 și TRPV6 în diferite segmente ale tractului intestinal de șoarece prin analiza PCR în timp real și le-am prezentat în raport cu totalul lor expresie intestinală. Canalul selectiv extrem de Ca 2+ TRPV6 formează mecanismul de intrare apical în absorbția activă a Ca 2+ în intestinul subțire. TRPM6 a fost exprimat în principal în cecum și colon, în timp ce nicio expresie nu a fost detectabilă în duoden și jejun (Figura 1C). TRPM7 a fost exprimat în mod egal în diferite segmente ale tractului intestinal. Canalul epitelial Ca 2+ TRPV6 a fost exprimat în principal în duoden, cec și colon, dar nu a fost detectabil în jejun și ileon (Figura 1C).

Profilul de expresie al receptorilor tranzitori potențiali melastatin 6 (TRPM6) și TRPM7 canale în diferite țesuturi de șoarece. (A și B) Nivelurile de expresie ale ARNm ale TRPM6 și TRPM7 într-un panou de țesuturi de șoarece au fost măsurate utilizând PCR cantitativă în timp real. (C) Cuantificarea nivelurilor de expresie a ARNm ale TRPM6 (▪), TRPM7 (□) și potențialul receptor tranzitor vaniloid 6 (TRPV6) (▒) de-a lungul tractului intestinal sunt prezentate ca procent din expresia totală a ARNm intestinal. ARNm cuantificat prin analiza PCR în timp real este calculat ca un raport cu nivelul de ARN hipoxantină-guanină fosforibosil transferază (HPRT). Datele sunt prezentate ca mijloace ± SEM (n = 4).

Analiza urinei și serice a șoarecilor hrăniți cu diferite diete Mg 2+

Șoarecii au fost hrăniți cu o dietă Mg 2+ -deficientă (0,005% greutate/greutate), -normală (0,19% greutate/greutate) sau îmbogățită (0,48% greutate/greutate) timp de 10 zile. La sfârșitul acestei perioade, șoarecii au fost adăpostiți timp de 24 de ore în cuști metabolice, iar probele de urină au fost colectate pentru investigarea metabolismului electrolitic al Mg 2+ și Ca 2+. Concentrațiile serice de Mg 2+ și Ca 2+ și excreția urinară totală de Mg 2+ și Ca 2+ sunt prezentate în figurile 2 și, respectiv, 3. Dieta cu deficit de Mg 2+ a dus la hipomagneziemie semnificativă (Figura 2B), în timp ce valorile serice ale Ca 2+ nu au fost modificate în mod semnificativ la șoarecii hrăniți cu diferitele diete Mg 2+ (Figura 2A). Restricția dietetică de Mg 2+ a redus semnificativ excreția urinară de Mg 2+ și Ca 2+ în comparație cu șoarecii hrăniți cu o dietă normală de Mg 2+ (Figura 3). Dieta îmbogățită cu Mg 2+ a crescut semnificativ excreția urinară de Mg 2+ și Ca 2+, în comparație cu șoarecii care au primit dieta normală.

Efectul conținutului dietetic de Mg 2+ asupra excreției urinare totale de Mg 2+ și Ca 2+. Excreția urinară netă de Mg 2+ (A) și Ca 2+ (B) de șoareci pe o dietă deficientă de Mg 2+ (0,005% greutate/greutate), dietă normală de Mg 2+ (0,19% greutate/greutate) și Dieta îmbogățită cu Mg 2+ (0,48% greutate/greutate). Valorile sunt prezentate ca medii ± SEM (n = 6). * P # P 2+ pe 45 Ca 2+ Absorbție

Pentru a investiga dacă Mg 2+ din dietă concurează cu rata de absorbție a Ca 2+, două grupuri de șoareci C57BL6 au primit oral o soluție de 45 Ca 2+ care conținea Ca 2+ 0,1 mM cu sau fără MgCl2 10 mM. Modificările concentrației serice de 45 Ca 2+ (ΔμM) au fost măsurate în decurs de 10 minute după administrarea soluțiilor de 45 Ca 2+. Nu s-au observat diferențe semnificative în rata absorbției de 45 Ca 2+ între grupul căruia i s-a administrat soluția de 45 Ca 2+ care conținea un exces de Mg 2+ și grupul care a primit doar soluția de 45 Ca 2+ (Figura 4).

Efectul conținutului de Mg 2+ din dietă asupra absorbției de Ca 2+. Modificări ale concentrației serice de 45 Ca 2+ (ΔμM) în decurs de 10 minute după administrarea a 45 Ca 2+ prin gavaj oral la șoareci C57BL6. Datele sunt valori medii ± SEM (n = 5) de la șoareci de 12 săptămâni. ⋄, 0,1 mM Ca2+; ▪, 0,1 mM Ca 2+ + 10 mM Mg 2+ .

Efectul conținutului Mg 2+ dietetic asupra expresiei TRPM6 și TRPM7

Efectul conținutului dietetic de Mg 2+ asupra nivelurilor de expresie renală ale TRPM6 și TRPM7. (A și B) PCR cantitativă în timp real a fost utilizată pentru a determina nivelurile de expresie a ARNm TRPM6 și TRPM7 în rinichi de șoareci hrăniți cu dietă deficitară Mg 2+ (0,005% greutate/greutate), dietă normală Mg 2+ (0,19% greutate)/greutate) și dietă îmbogățită cu Mg 2+ (0,48% greutate/greutate). (C și D) abundența de proteine ​​TRPM6 a fost determinată prin analiza computerizată a imaginilor imunohistochimice și este prezentată ca densitate optică integrată (IOD). Datele sunt prezentate ca medii ± SEM (n = 6). * Conținut P + pe expresia mRNA TRPM6 și TRPM7 în colonul mouse-ului. Nivelurile de expresie mARN ale TRPM6 (A) și TRPM7 (B) mARN în colonul șoarecilor hrăniți cu o dietă deficitară Mg 2+ (0,005% greutate/greutate), dietă normală Mg 2+ (0,19% greutate/greutate) și Mg Dieta îmbogățită cu 2+ (0,48% greutate/greutate) au fost evaluate prin analize PCR cantitative în timp real și calculate ca raport cu ARN-ul HPRT. Datele sunt prezentate ca medii ± SEM (n = 6). * Dieta P 2+.

Efectul conținutului de Mg + din dietă asupra expresiei ARNm TRPM6 și TRPM7 în colonul șoarecelui. Nivelurile de expresie a ARNm ale TRPM6 (A) și TRPM7 (B) ARNm în colonul șoarecilor hrăniți cu o dietă deficitară Mg 2+ (0,005% greutate/greutate), dietă normală Mg 2+ (0,19% greutate/greutate) și Mg Dieta îmbogățită cu 2+ (0,48% greutate/greutate) au fost evaluate prin analize PCR cantitative în timp real și calculate ca raport cu ARN-ul HPRT. Datele sunt prezentate ca medii ± SEM (n = 6). * Dieta P 2+.

Reglarea hormonală a expresiei TRPM6 și TRPM7 renale

Pentru a determina efectul hormonilor calciotropi, inclusiv 1,25 (OH) 2D3, PTH și 17β-E2, asupra nivelurilor de expresie a ARNm renal ale TRPM6 și TRPM7, au fost utilizate diferite modele animale. Șoarecii 1α-OHază -/- reprezintă un model animal unic pentru a studia efectul hormonului 1,25 (OH) 2D3 (23). Pentru a investiga efectul PTH și al 17β-E2, am folosit șobolani PTX și respectiv OVX (18,19). PCR cantitativă în timp real a demonstrat că nivelurile de expresie ale ARNm ale TRPM6 renale au rămas neafectate la 1α-OHază -/- în comparație cu 1α-OHază +/− șoareci și 1α-OHază -/- șoareci suplimentați cu 1,25 (OH) 2D3). În mod similar, nu s-a observat niciun efect al PTH (Figura 7C). Cu toate acestea, o scădere de două ori a nivelurilor de expresie a ARNm TRPM6 a fost măsurată la rinichii șobolanilor ovariectomizați (OVX) (Figura 7E). Important, administrarea de 17β-E2 a normalizat nivelurile de expresie TRPM6 în rinichiul șobolanilor OVX. Nu s-au observat diferențe ale nivelului de expresie renală a ARNm TRPM7 la animalele 1α-OHază -/-, PTX și OVX (Figura 7, B, D și F).

Efectul 1,25-dihidroxivitaminei D3 (1,25 (OH) 2D3), hormonului paratiroidian (PTH) și 17β-estradiol (17β-E2) asupra expresiei canalelor TRPM6 și TRPM7 ARNm în rinichi. Efectul 1,25 (OH) 2D3, PTH și 17β-E2 în nivelurile de expresie mARN ale TRPM6 (A, C și E) renale și TRPM7 (B, D și F) a fost cuantificat prin analiză PCR în timp real și normalizat pentru HPRT expresie. Datele sunt prezentate ca medii ± SEM (n = 4 până la 5). * Transport P 2+. În primul rând, acest canal epitelial Mg 2+ a fost exprimat predominant în epitelii de șoarece, incluzând rinichi, cec, colon și plămâni. În al doilea rând, expresia ARNm de 17PM-E2 reglează în mod specific TRPM6 în rinichi, indicând primul hormon magneziotrop în menținerea echilibrului Mg 2+. În al treilea rând, epuizarea Mg 2+ a crescut expresia mRNA TRPM6 în rinichi, în timp ce o dietă îmbogățită cu Mg 2+ a crescut nivelurile de mARN ARNTPM6 în colon. În al patrulea rând, expresia abundentă a TRPM6 în cecum și colon, împreună cu nivelul scăzut de expresie în duoden și jejun, sugerează că absorbția activă a Mg 2+ are loc în principal în partea distală a intestinului.

Rapoartele anterioare au demonstrat că PTH stimulează reabsorbția Mg 2+ în TAL și DCT (43,44). În plus, s-a demonstrat că 1,25 (OH) 2D3 mărește afluxul de Mg 2+ într-o linie celulară DCT de șoarece (5). Studiul nostru sugerează că PTH și 1,25 (OH) 2D3 nu sunt implicate în stimularea reabsorbției Mg 2+ prin reglarea ascendentă a nivelurilor de expresie renală TRPM6, deoarece 1,25 (OH) 2D3 și PTH nu au modificat expresia TRPM6 în rinichi. În plus, Karbach (45,46) a demonstrat că transportul celular Mg 2+ în colonul de șobolan nu răspunde la 1,25-dihidroxivitamina D3.

Nivelurile de expresie nemodificate ale ARNm TRPM6 în colon în timpul restricției Mg 2+ sugerează că capacitatea de absorbție Mg 2+ este suficientă pentru a obține transportul celular celular Mg 2+. Expresia omniprezentă și care nu răspunde la dietă a TRPM7 sugerează că acest canal special Mg 2+ nu participă la homeostazia extracelulară Mg 2+. În conformitate cu studiile anterioare, acest lucru indică faptul că TRPM7 este implicat în principal în homeostazia celulară Mg 2+ (14,15).

Este interesant faptul că, pe lângă rinichi și intestin, TRPM6 este foarte abundent în țesutul pulmonar. Cu toate acestea, funcția exactă a TRPM6 în acest organ rămâne de elucidat. Importanța Mg 2+ în plămâni este susținută de faptul că aportul alimentar de Mg 2+ este direct legat de funcția pulmonară, reactivitatea căilor respiratorii și simptomele respiratorii în populația generală (53). Mai mult, tratamentul pacienților care au astm bronșic primește în prezent atenție datorită rolului Mg 2+ în relaxarea celulelor musculare netede arteriale și bronșice (54-56). Cercetări suplimentare sunt cu siguranță necesare pentru a determina funcția precisă a TRPM6 în fiziologia pulmonară (patologică).

Concluzie

TRPM6 este exprimat în principal în rinichi, cec, colon și plămâni, sugerând că aceste organe sunt implicate în principal în (re) absorbția Mg 2+. Mai mult, oferim dovezi că situsul intestinal de absorbție activă a Mg 2+ este situat în principal în partea distală a intestinului. În plus, 17β-E2 și dieta Mg 2+ sunt implicate pozitiv în reglarea TRPM6, subliniind funcția gatekeeper a acestui canal Mg 2+ epitelial.

Mulțumiri

Acest studiu a fost susținut de Fundația Olandeză pentru Rinichi (C02.2030, C03.6017) și Organizația Olandeză de Cercetare Științifică (Zon-Mw 016.006.001).

Mulțumim NV Organon Nederland pentru furnizarea cu amabilitate a țesutului renal din studiul model OVX șobolan. În plus, îi mulțumim Dr. René St. Arnaud pentru furnizarea amabilă de țesut renal din modelul 1α-OHază -/- șoarece și Dr. Marlies Cornelissen pentru discuții stimulante.