Subiecte

Abstract

Introducere

Șobolanii și șoarecii nocturni cu acces gratuit la alimente sunt activi și mănâncă predominant noaptea, sub controlul unui stimulator cardiac circular-luminos-întunecat (LD) în nucleul suprachiasmatic (SCN). Dacă disponibilitatea alimentelor este limitată la jumătatea perioadei de lumină timp de o săptămână sau mai mult, apare o perioadă de activitate în așteptarea mesei zilnice 1,2,3, iar ceasurile circadiene din majoritatea organelor și țesuturilor periferice se schimbă pentru a se alinia la ora mesei 4, 5. Aceste ajustări circadiene la programele zilnice de hrănire nu implică stimulatorul cardiac SCN, deoarece SCN, atunci când este antrenat la ciclurile LD, nu este deplasat prin hrănirea diurnă 6,7,8, iar ablația SCN nu perturbă ritmurile anticipative ale alimentelor sau împiedică antrenarea perifericelor ceasuri la hrănirea programată 9,10,11 .

Metode

Animale și locuințe

Șoareci C57BL/6 masculi tineri (N = 110, vârsta de 2-4 luni) au fost obținuți de la Charles River (QC, Canada). Cohorte separate au fost utilizate pentru a testa NOR într-un labirint Y (Experiment 1, N = 34) și într-un câmp deschis (Experiment 2, N = 37). O a treia cohortă (N = 40) a fost utilizată pentru a testa alternanța spontană (Experimentul 3a) și condiționarea contextuală a fricii (Experimentul 3b). Toți șoarecii au fost adăpostiți într-un singur ciclu LD 12:12 (LED alb,

15 lux la fundul cuștii) cu alimente și apă disponibile ad libitum timp de cel puțin două săptămâni înainte de hrănirea restricționată. Temperatura camerei a fost menținută la

22 ° C. În Experimentul 1, activitatea locomotorie a fost înregistrată continuu utilizând software-ul de achiziție și analiză de date Clocklab (Actimetrics, SUA). Toate procedurile au fost aprobate de Comitetul pentru îngrijirea animalelor al Universității Simon Fraser (Protocolul 1208P-16) și toate experimentele au fost efectuate în conformitate cu orientările și reglementările relevante.

Alimentare restricționată

Șoarecii din experimentul 1 (testul Y-labirint) au fost menținuți pe un program de hrănire restricționat timp de cel puțin 40 de zile înainte de testare pentru a asigura o antrenare stabilă la programul de hrănire. Programul a fost inițiat cu o lipsă de hrană de 18 ore începând cu Zeitgeber Time (ZT) 12 (unde ZT0 este aprins, prin convenție). Mâncarea a fost apoi pusă la dispoziție în fiecare zi la ZT3 (3 ore după aprinderea luminii; alimentarea cu ziua) sau ZT15 (la 3 ore după aprinderea luminii; alimentarea pe timp de noapte). Durata mesei a fost de 10 ore în prima zi, redusă cu 1 oră/zi pentru următoarele patru zile și menținută la 6 ore (ZT3-9 sau ZT15-21) până la sfârșitul testului NOR. Alimentele consumate și greutățile corporale au fost măsurate zilnic în primele 2 săptămâni.

Șoarecii din Experimentul 2 (test de câmp deschis NOR) și Experimentul 3 (alternanță spontană și teste contextuale de condiționare a fricii) au fost menținuți în programul de hrănire restricționat, așa cum este descris de Loh și colab. 12. În consecință, șoarecii au fost lipsiți de alimente timp de 24 de ore și apoi au furnizat alimente timp de 6 ore pe zi de la ZT3-9 sau ZT15-21 timp de 2 săptămâni, procedurile de testare începând în ziua 15 de hrănire restricționată.

Cronologiile și aparatele experimentelor pentru fiecare experiment sunt ilustrate în figura suplimentară S1.

Experimentul 1: test NOR în aparatul cu labirint Y

Labirintul Y are avantaje față de câmpul deschis pentru testarea memoriei obiectelor. Brațele înguste ale labirintului Y reduc anxietatea și, prin urmare, încurajează explorarea. Pereții înalți limitează utilizarea reperelor spațiale, încurajând atenția asupra obiectelor. Labirintul Y a fost realizat din Perspex alb opac omogen (descris în 24). Pereții aveau 30 cm înălțime și fiecare braț avea 16 cm lungime și 8 cm lățime. O cameră video digitală a fost montată deasupra labirintului pentru a înregistra toate încercările. Un braț a fost folosit ca braț de pornire, iar celelalte două brațe au fost folosite pentru a prezenta obiectele fixate pe podeaua labirintului folosind Blu-tack ™. Labirintul și obiectele au fost șterse cu o soluție de etanol 50% și uscate între probe. Obiectele folosite și partea laterală a labirintului în care a fost prezentat noul obiect au fost contrabalansate. Toate testele în labirintul Y au fost efectuate sub lumină slabă (alb incandescent,

Șoarecii au fost obișnuiți cu o manipulare ușoară timp de 3-4 minute, sesiuni de manipulare repetate zilnic

Cu 2 săptămâni înainte de testarea NOR. Șoarecii au fost obișnuiți cu labirintul Y prin plasarea în aparat timp de 10 minute în fiecare din cele două zile imediat anterioare primului test NOR. Fiecare test NOR a constat din două teste de familiarizare și un test de alegere, programate la intervale de 24 de ore în zile succesive. În timpul studiilor de familiarizare, șoarecii au fost așezați într-un capăt al labirintului Y cu două obiecte identice la celelalte două capete și au fost lăsați să exploreze timp de 5 minute. În timpul procesului de alegere, șoarecii au fost plasați în labirintul Y și au fost prezentați cu unul familiar obiect, care era identic cu obiectele prezentate în faza de familiarizare, și unul roman obiect, pe care șoarecii nu l-au mai întâlnit anterior. Șoarecii au primit 5 minute pentru a explora labirintul și obiectele. Șoarecii au fost apoi returnați în cuștile de acasă și au fost menținuți în programele de hrănire restricționate pentru încă 4 zile. Secvența de testare de 3 zile a fost apoi repetată la un alt moment al zilei și secvența completă de 7 zile a fost repetată până când fiecare șoarece a fost testat în toate cele patru puncte de timp (ZT3, 9, 15 și 21, contrabalansat pentru comandă).

Nivelurile de activitate exploratorie sunt afectate de foame. Prin urmare, în timpul celor 24 de ore anterioare fiecărui studiu de alegere, șoarecilor li s-a oferit o masă mică (25% din consumul mediu zilnic de alimente) la fiecare 6 ore (ZT3, 9, 15 și 21), în locul unei mese mari la ZT3 sau ZT15. Acest lucru a asigurat că timpul de la hrănirea durabilă a fost echivalent la fiecare test de alegere.

Experimentul 2: test NOR în aparate în câmp deschis

Procedurile utilizate în experimentul 2 au fost destinate să se potrivească cu cele ale lui Loh și colab. 12 cât mai aproape posibil. În consecință, testarea a fost efectuată în cutii albe opace (55 × 37 × 33 cm). Obiectele (din Experimentul 1) au fost plasate central, la distanță una de cealaltă și de laturile câmpului deschis. Testarea la ZT9 a fost efectuată în lumină (

30 lux) și testarea la ZT21 sub lumină roșie slabă (0,5 reprezintă o preferință de noutate.

Extracția hipocampului și reacția în lanț cantitativă a polimerazei

Ritmurile circadiene sunt conduse de bucle de feedback de transcriere-traducere autoreglare care implică un grup de gene de ceas care include Bmal1 și Per2 25. Genele ceasului sunt responsabile pentru oscilațiile circadiene la nivel celular și expresia poate fi utilizată pentru a evalua faza circadiană specifică țesutului. În ziua următoare testului NOR și a ultimei mese programate, șoarecii hrăniți pe timp de zi și hrăniți în noapte în Experimentul 2 au fost eutanasiați prin CO2 la ZT3, 6, 9 sau 15, fără să se hrănească în acea zi. Șoarecii au fost decapitați și creierele au fost extrase și răcite rapid în soluția de sare echilibrată de Hank (HBSS; Millipore-Sigma H1641, St Louis, MO) suplimentată cu tampon Hepes (Millipore-Sigma H0887, St Louis, MO) și NaCHO3 Millipore -Sigma S8761, St. Louis, MO). Creierele au fost menținute în secțiuni HBSS la 4 ° C și secțiuni de 1100 microni începând cu

1,58 mm posterioare de bregma 26 au fost secționate pe un vibratom. Hipocampul dorsal a fost separat folosind un bisturiu și plasat imediat într-un tub Eppendorf de 2 ml și congelat rapid pe gheață uscată. Țesutul a fost menținut la -80 ° C până la izolarea ARN. ARN-ul a fost izolat folosind reactivul Trizol (Thermo Fisher Scientific, 15596018, Waltham, MA) conform instrucțiunilor producătorului și concentrațiile au fost cuantificate folosind un spectrometru. ARN (500 ng) a fost transcris invers către ADNc utilizând trusa de transcripție inversă a ADNc de mare capacitate (Thermo Fisher Scientific, 4368814, Waltham, MA). Reacția în lanț cantitativă a polimerazei (qPCR) a Per2 a fost realizat folosind 2 μL de ADNc cu SYBR Green FastMix (Quanta Biosciences, 95073, Gaithersburg, MD) într-un sistem StepOnePlus PCR în timp real (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). expresie mARN a Per2 și Bmal1 a fost normalizat la Rplp0. Grundele utilizate sunt furnizate în tabelul suplimentar S1.

Experiment 3a. Alternanță spontană

Experimentul 3b. Condiționarea fricii contextuale

La două zile după testul alternativ spontan, în zilele 17 și 18 de hrănire restricționată, condiționarea contextuală a fricii a fost evaluată folosind o cameră de condiționare operantă dotată cu podea conductoare (29,53 × 23,5 × 20,96 cm; Med Associates VFC-008-LP, Fairfax, VT). Șoarecii hrăniți de zi și hrăniți de noapte au fost plasați în cameră (stimul condiționat) fie la ZT2, fie la ZT14 (ca în Loh și colab. 12) și a permis explorarea liberă timp de 3 minute. După această perioadă de familiarizare, șoarecii au primit un șoc ușor la picior de 2 sec, cu un curent de 0,2 mA (stimul necondiționat) livrat prin barele de podea. Șocul piciorului a fost repetat 64 de secunde mai târziu. După un interval final de 64 sec, șoarecii au fost înapoiați în cușca lor de acasă. Șoarecii au fost plasați în camera de șoc 24 de ore mai târziu și au fost înregistrați timp de 6 minute pentru a evalua înghețarea contextuală. Congelarea a fost definită ca imobilitate și evaluată de un coder experimentat, orb de condițiile experimentale. Observațiile au fost făcute la fiecare 8 secunde în intervalul de 64 sec imediat înainte de primul șoc al piciorului (8 observații) și pe parcursul întregii faze de test de 6 minute a doua zi (45 de observații). Datele au fost analizate ca un scor procent de îngheț (procentul observațiilor înregistrate ca îngheț).

Statistici

Scorurile NOR DI, procentul de alternanță, procentul de îngheț și datele qPCR au fost evaluate statistic utilizând model mix sau ANOVA-uri cu două căi obișnuite sau ANOVA cu un singur sens, după caz ​​(Prism 6, Graphpad Software Inc, La Jolla, SUA).

Rezultate

Experiment 1. Hrănirea în timpul zilei nu afectează NOR într-un labirint Y

Pentru a evalua dacă sincronizarea meselor afectează memoria obiectelor, NOR a fost testat de 4 ori pe zi într-un labirint Y. Procentul de studii pe care șoarecii au îndeplinit criteriul minim de explorare a obiectelor de 3 secunde nu a diferit între grupurile hrănite de zi (62/72) și hrănite de noapte (55/64)z = 0,029, p = 0,97). Majoritatea șoarecilor din ambele grupuri hrănite ziua și hrănite noaptea au prezentat un indice de discriminare> 0,5 la fiecare moment, indicând memoria obiectului întâlnit anterior (Fig. 1A; Fig. S2 suplimentar). O măsură repetată bidirecțională ANOVA a scorurilor indicelui de discriminare de la șoareci care au îndeplinit criteriul în toate studiile nu au confirmat niciun efect semnificativ al timpului din zi (F3,63 = 0,24, p = 0,87) sau program de hrănireF1,21 = 3,46, p = 0,08) și nicio interacțiune semnificativăF3,63 = 0,98, p = 0,40). Explorarea totală a obiectelor (roman plus familiar), de asemenea, nu a prezentat un efect semnificativ al timpului din ziF3,63 = 1,86, p = 0,14), program de hrănireF1,21 = 0,12, p = 0,73) sau interacțiuneF3,63 = 2,37, p = 0,08) (Fig. Suplimentară S3).

afectează

Efectele programelor de hrănire și ale orei din zi asupra performanței testului (A) Experiment 1. Indicele discriminării (DI, timpul petrecut explorând obiectul nou ca procent din timpul petrecut explorând ambele obiecte) scoruri la testul recunoașterii obiectelor noi (NOR) într-un labirint Y. Șanse de ploaie aproape de 0,5 (linie punctată roșie). (B) Experimentul 2. Scorurile DI la testul NOR într-un câmp deschis. (C) Experimentul 3a. Procentaje de alternanță într-un labirint Y. Șanse de ploaie de aproape 50% (linie punctată roșie). (D) Experimentul 3b. % De congelare în cutia de șoc, la 24 de ore după ce a primit șocul piciorului.

Experimentul 2. Hrănirea în timpul zilei nu afectează NIC într-un câmp deschis

Pentru a identifica potențiale variabile procedurale care ar putea explica discrepanța dintre rezultatele experimentului 1 și cele raportate anterior, s-a încercat un experiment de replicare după consultarea autorilor studiului original 12. În consecință, programele de hrănire au fost menținute timp de 14 zile mai degrabă decât> 40 de zile și NOR a fost evaluat într-un aparat de câmp deschis, în grupuri separate testate la ZT9 sau ZT21. Procentul de studii pe care șoarecii au îndeplinit criteriul minim de explorare a obiectelor de 3 secunde nu a diferit între grupurile hrănite de zi (15/20) și hrănite de noapte (18/20)z = 1,25 p = 0,21). Din nou, majoritatea șoarecilor din grupurile hrănite ziua și hrănite noaptea au prezentat un indice de discriminare> 0,5, indicând memoria obiectului întâlnit anterior, la ambele puncte de timp (Fig. 1B). Nu a existat un efect semnificativ al orei din zi (F1,28 = 0,49, p = 0,48) sau program de hrănireF1,28 = 0,05, p = 0,82) și fără interacțiune semnificativăF1,28 = 1,62, p = 0,21). Explorarea totală a obiectelor nu a prezentat niciun efect al orei din zi (F1,28 = 2,21, p = 0,14), program de hrănireF1,28 = 0,70, p = 0,41), sau interacțiuneF1,28 = 1,06, p = 0,31) (Fig. Suplimentar S3).

Experimentul 2. Programele de hrănire restricționate induc ritmuri robuste de activitate de anticipare a alimentelor

Programele de hrănire restricționate în timpul zilei sau noaptea induc un ritm zilnic de activitate anticipativă a alimentelor. Pentru a confirma că programele de hrănire restricționate de 14 zile folosite aici au fost eficiente în inducerea anticipării alimentelor, activitatea locomotorie în cușcă la domiciliu a fost monitorizată continuu utilizând senzori de mișcare în infraroșu. Așa cum era de așteptat, toți șoarecii din grupurile hrănite de zi și hrănite noaptea au prezentat o perioadă proeminentă de activitate începând cu 1-3 ore înainte de hrănirea programată în fiecare zi (Fig. 2).

Efectele programelor de hrănire și ale orei din zi asupra activității locomotorii din (A) hrănit de zi și (B) șoareci hrăniți noaptea în Experimentul 1. Datele de activitate pentru șoareci individuali au fost mai întâi normalizate și apoi mediate în ultimele 5 zile de hrănire restricționată înainte de sesiunile de obișnuință. Subgrupurile testate ziua și noaptea au fost reunite. Mijloacele de grup sunt reprezentate ± SEM. Ora meselor este notată prin umbrire verde.

O măsură repetată ANOVA în două direcții asupra consumului de alimente măsurată zilnic în primele 14 zile de hrănire restricționată înainte de testarea NOR a relevat efecte semnificative ale zilei de hrănire restricționată (F13,455 = 28,8, p Figura 3

Experiment 3a. Hrănirea în timpul zilei nu afectează alternanța spontană

O a treia cohortă de șoareci hrăniți ziua și hrăniți noaptea au fost testați pentru alternanță spontană și condiționare a fricii contextuale. După 14 zile de hrănire restricționată, grupuri separate de șoareci hrăniți pe timp de noapte și hrăniți pe timp de noapte au fost așezați într-un labirint Y timp de 8 minute fie la ZT2 (în timpul zilei), fie în ZT14 (în timpul nopții) (Fig. Suplimentară S1). A existat un efect semnificativ al mesei asupra numărului total de intrări în braț (F1,36 = 15,12, p = 0,0004), dar niciun efect semnificativ al timpului de testareF1,36 = 2,98, p = 0,093) și nicio interacțiune semnificativăF1,36 = 0,44, p = 0,51). Șoarecii hrăniți pe timp de noapte au prezentat mai multe intrări de brațe decât șoarecii hrăniți de zi la ambele ore de testare (p

Discuţie

În studiul de față, am examinat consecințele funcționale ale unei forme diferite de „desincronie” internă, una care este indusă atunci când hrănirea și ciclurile LD sunt în conflict. Animalele nocturne mănâncă în primul rând noaptea, dar dacă hrana este disponibilă doar la jumătatea zilei, există o realiniere marcată a ceasurilor circadiene în tot creierul și corpul. Rezultatul net este clar adaptativ, asigurându-se că organismul este treaz la momentul potrivit pentru a găsi hrană și pregătit fiziologic pentru un aflux mare de nutrienți. În prezența unui ciclu LD, stimulatorul cardiac SCN și alte câteva țesuturi (de exemplu, glanda pineală) sunt mutate relativ puțin sau deloc prin hrănirea restrânsă în timpul zilei și, prin urmare, există o schimbare substanțială în relațiile de fază dintre minoritate de ceasuri care rămân antrenate la LD și majoritatea, inclusiv hipocampul, care se aliniază la ora mesei. Această formă de „desincronie” internă diferă de cea indusă de deplasările LD deoarece este stabilă, benefică pentru supraviețuire (cu siguranță pe termen scurt) și indusă de condițiile care pot apărea în habitatele naturale. Prin urmare, ar părea mai potrivit să desemnăm acest lucru ca o stare de „sincronie internă modificată” mai degrabă decât „desincronizare”.

După cum am modificat procedurile Loh și colab. 12 în mai multe moduri, am încercat apoi o replicare mai formală, un prim pas necesar pentru identificarea variabilelor care ar putea sta la baza diferitelor rezultate. Cu asistența autorilor originali, am recreat aparatul, protocoalele de hrănire și procedurile de instruire și testare utilizate în studiul lor, până la marca de curățător folosită în camere după fiecare test. Din nou, nu am observat niciun deficit în memoria obiectelor în grupul alimentat cu ziua, comparativ cu grupul alimentat cu noaptea, și nici o dovadă a variației circadiene.

Performanță la testul NOR așa cum este configurat de Loh și colab. 12 și, în studiul de față, necesită cortex peririnal, dar nu și hipocampul 43,44. Prin urmare, am evaluat alternanța spontană și condiționarea fricii contextuale, două teste de memorie spațială cunoscute a fi dependente de hipocamp, într-o a treia cohortă de șoareci. Grupurile hrănite de zi și hrănite de noapte au arătat din nou performanțe echivalente la aceste teste. În experimentul de condiționare a fricii, scorurile de îngheț au fost mai mari în timpul testelor de zi, comparativ cu testele de noapte, rezultat în concordanță cu mai multe studii anterioare 21.45 .

Disponibilitatea datelor

Seturile de date analizate în studiul actual sunt disponibile de la autorul corespunzător, la cerere.