Abstract

fundal

Acidul eicosapentaenoic (EPA) și acidul α-lipoic (α-LA) au fost investigate pentru efectele lor benefice asupra obezității și a factorilor de risc cardiovascular. În cercetarea actuală, obiectivul a fost evaluarea modificărilor metabolomice în urma suplimentării dietetice a acestor două lipide, singure sau combinate la femeile sedentare supraponderale/obeze sănătoase care urmează o dietă cu restricție energetică. În acest scop, a fost realizată o abordare metabolomică nedestinată pe probe de urină utilizând cromatografie lichidă cuplată cu spectrometria de masă în timp de zbor (HPLC-TOF-MS).

Metode

Acesta este un studiu pe termen scurt dublu orb controlat cu placebo, cu un design nutrițional paralel, care a durat 10 săptămâni. Participanții au fost repartizați la unul dintre cele 4 grupuri experimentale [Control, EPA (1,3 g/d), α-LA (0,3 g/d) și EPA + α-LA (1,3 g/d + 0,3 g/d)]. Toate grupurile de intervenție au urmat o dietă cu restricție energetică cu 30% mai mică decât cheltuielile totale de energie. Au fost analizate măsurători biochimice relevante clinic. Probele de urină (24 ore) au fost colectate la momentul inițial și după 10 săptămâni. S-a efectuat o analiză metabolomică nedestinată pe probe de urină și s-au efectuat analiza componentelor principale (PCA) și analiza parțială a discriminării celor mai mici pătrate (PLS-DA) pentru recunoașterea tiparului și identificarea metaboliților caracteristici.

Rezultate

Probele de urină au fost împrăștiate în graficele scorurilor PCA ca răspuns la suplimentarea cu α-LA. În total, 28 de metaboliți discriminanți putativi în ionizarea pozitivă și 6 în ionizarea negativă au fost identificați printre grupurile clar diferențiate în funcție de administrarea α-LA. Remarcabil este prezența unui metabolit intermediar ascorbat (unul dintre izomerii trihidroxi-dioxohexanoatului sau dihidroxi-oxohexanedionat) în grupurile suplimentate cu α-LA. Acest fapt ar putea fi asociat cu proprietățile antioxidante atât ale α-LA, cât și ale acidului ascorbic. Corelațiile dintre parametrii fenotipici și metaboliții putativi ai informațiilor suplimentare furnizate cu privire la existența unei relații directe sau inverse între ei. De un interes deosebit sunt corelația negativă dintre metabolitul intermediar ascorbat și dimetilarginina asimetrică (ADMA) și cea pozitivă dintre superoxid dismutază (SOD) și suplimentarea cu α-LA.

Concluzii

Această abordare metabolomică susține că efectele benefice ale administrării α-LA asupra reducerii greutății corporale pot fi explicate parțial prin proprietățile antioxidante ale acestui acid carboxilic organosulfur mediat de izomerii trihidroxi-dioxohexanoatului sau dihidroxi-oxohexanedionatului.

Înregistrarea procesului

fundal

Alți acizi grași, cum ar fi acidul eicosapentaenoic (EPA), care este unul dintre principalii acizi grași polinesaturați omega-3 (n-3 PUFA) de origine marină, sunt asociați cu proprietăți antiinflamatorii [17]. În acest context, un studiu de intervenție a arătat că EPA modulează genele legate de inflamație în țesutul adipos [18]; în plus, EPA promovează modificări ale genelor de remodelare a matricei extracelulare a țesutului adipos pe lângă o creștere a factorilor chimiotactici și a macrofagelor asociate cu repararea plăgilor [19]. S-au efectuat diferite studii metabolomice asupra EPA și n-3 PUFA [9, 20]. Astfel, un studiu lipidomic a contribuit la cunoașterea generală a EPA cu privire la progresia sindromului metabolic (MetS), a inflamației și a stresului oxidativ [20]. Un studiu la om a arătat asocieri indirecte cu specii moleculare lipidice și variabile clinice de interes în evaluarea MetS după o dietă bogată în n-3 PUFA și polifenoli [9]. Prin urmare, scopul prezentului studiu a fost de a evalua efectul suplimentării dietetice cu α-LA și EPA, separat sau în combinație în timpul unei diete hipocalorice, asupra metabolomului urinar, pentru a evalua prezența modificărilor metabolomice între diferitele grupuri de intervenția.

Metode

Participanți și proiectarea studiului

La momentul inițial și la punctul final, femeile, după aproximativ 10-12 ore de post, au vizitat Unitatea Metabolică a Universității din Navarra pentru a fi intervievate de către medic, dietetician și asistentă. Măsurătorile antropometrice au fost efectuate în conformitate cu protocoalele de rutină standardizate, așa cum sunt detaliate în altă parte [18, 23]. Criteriile de includere și excludere au fost descrise anterior [21].

Studiul a fost aprobat de Comitetul de cercetare al Universității din Navarra Nu. 007/2009 și înregistrat la clinictrials.gov ca NCT01138774. Toți funerarii au semnat consimțământul informat înainte de a fi recrutați în test. Intervenția a fost efectuată în conformitate cu cele mai recente linii directoare ale Declarației de la Helsinki.

Măsurarea biochimică în sânge și urină

Eșantioanele de sânge de la subiecții la jeun peste noapte au fost drenate în săptămânile 0 și 10 în tuburi de activare a cheagurilor de ser (4 ml Vacuette®) și în tuburi cu EDTA tripotasic (4 ml Vacuette®). Probele de plasmă au fost extrase din tuburile EDTA după centrifugare la 1500 g timp de 15 minute la 4 ° C. Toate probele au fost stocate în mod adecvat la - 80 ° C pentru analize posterioare adecvate.

Concentrațiile serice de glucoză, colesterol total, HDL-colesterol, trigliceride, acizi grași liberi (FFA) și β-hidroxibutirat au fost evaluate de rutină folosind auto-analizorul Pentra C200 (HORIBA medical, Madrid, Spania). Valorile colesterolului LDL au fost calculate utilizând ecuația Friedewald. De asemenea, concentrațiile plasmatice de dimetilarginină asimetrică (ADMA) și insulină au fost măsurate conform instrucțiunilor producătorului pentru kituri comerciale ELISA disponibile furnizate de DLD Diagnostics GMBH (Hamburg, Germania) și respectiv Mercodia (Uppsala, Suedia), respectiv [18]. Evaluarea modelului homeostaziei (HOMA-IR) a fost definită ca insulină serică în post (mU/L) x glucoză plasmatică în post (mmol/L)/22,5 [24]. Activitatea superoxid dismutazei (SOD) a fost măsurată cu un kit conform instrucțiunilor producătorului (Assay Designs, PA, SUA), așa cum este descris în altă parte [21]. ADMA a fost evaluată în eșantioane ca un marker al manifestărilor sindromului metabolic, un statut oxidativ [25], iar SOD a fost măsurat ca un marker biologic al stresului oxidativ [26], ca fiind pozitiv legat de proprietățile antioxidante α-LA.

Probele complete de urină de 24 de ore au fost preluate cu o zi înainte de începerea și cu o zi înainte de punctul final al studiului. Probele de urină au fost colectate într-un recipient pentru urină și răcite la 4 ° C. Așa cum a fost proiectat, probele de urină au fost depozitate în flacoane de 1 ml la - 80 ° C până la analiză.

Pregătirea probelor și analiza HPLC-TOF-MS

Toți solvenții utilizați au fost de cromatografie lichidă-spectrometrie de masă (LC-MS) și cumpărați de la Scharlau (Scharlab, Sentmenat, Spania). Apa analitică (18,2 MΩ) a fost furnizată dintr-un sistem ultramatic de la Wasserlab (Barbatáin, Navarra, Spania). Alte standarde au fost de calitate analitică sau superioară și au fost furnizate de Sigma Aldrich (Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, Steinheim, Germania).

Pentru a evalua calitatea în această abordare metabolomică, a fost aplicată o procedură raportată anterior, cu unele modificări minore [28, 29]. Au fost implementate două tipuri de control al calității probei (QC): i) soluție standard de amestec implementată de citozină, clorhidrat de L-carnitină, betaină, leucină, dezoxiadenozină și dezoxiguanozină la o concentrație de 1 mg/L. ii) urina colectată a fost preparată amestecând volume egale din fiecare dintre cele 130 de probe. Aceste probe au fost injectate de 5 ori la începutul cursei pentru a asigura echilibrarea sistemului și apoi la fiecare 5 probe pentru a monitoriza în continuare stabilitatea analizei. În cele din urmă, probele au fost randomizate pentru a reduce eroarea sistematică asociată cu măsurători de variabilitate. Probele de urină au fost analizate secvențial în seturi de 15 probe/zi.

Prelucrarea datelor și identificarea metaboliților

Datele LC-MS au fost analizate cu software-ul XCMS Online (https://xcmsonline.scripps.edu) pentru a identifica și alinia caracteristicile [30,31,32,33,34]. Alinierea a aplicat un timp de retenție de 0,2 min și o fereastră de toleranță de masă 0,002 Da.

Un studiu pilot a fost efectuat pentru a caracteriza metaboliții prin intermediul METLIN (https://metlin.scripps.edu/index.php), cu o precizie de masă sub 5 mDa, literatura științifică și căile metabolice descrise în Kyoto Encyclopaedia of Genes and Baza de date Genomes (KEGG) (http://www.genome.jp/kegg/), Baza de date cu metabolici umani (HMDB) (http://www.hmdb.ca/) și Lipidmaps (http://www.lipidmaps.org /). În acele cazuri în care căutarea METLIN a oferit mai mulți metaboliți, utilizarea modelelor comerciale ne-a permis să aruncăm unele dintre opțiunile rezultate, permițând o aproximare mai precisă la metabolitul putativ.

analize statistice

Analizele statistice au fost efectuate cu Stata Statistical Software (versiunea 12. College Station, StataCorp LLC, TX, SUA). Pentru toate testele efectuate, semnificația statistică (față-verso) a fost stabilită la p

Rezultate

Subiecte

Sunt raportate principalele caracteristici ale participanților și parametrii biochimici la momentul inițial și modificările după intervenția de 10 săptămâni referitoare la cele 4 brațe experimentale după dietele hipocalorice și administrarea α-LA/EPA (Tabelul 1). Cele patru grupuri experimentale au fost aparent omogene la momentul inițial, unde nu au fost găsite diferențe statistice la începutul studiului în niciuna dintre variabilele evaluate. IMC, masa de grăsime și reducerile HOMA-IR au fost semnificativ mai mari (p Tabelul 1 Caracteristicile biochimice și antropometrice ale voluntarilor la momentul inițial și procentul modificării

Profil metabolomic urinar

Metoda HPLC-TOF-MS a permis detectarea a 4.752 caracteristici în modul ESI + și 4.713 caracteristici în modul ESI (datele nu sunt afișate). Mai mult, o analiză statistică univariată efectuată pentru a selecta acele variabile care demonstrează diferențe semnificative (p Fig. 1

nedestinat

Analiza componentelor principale (PCA) a analizei metabolomice ne țintite a probelor de urină, inclusiv grupuri LIPOIC FINAL, LIPOIC INITIAL, NO LIPOIC FINAL și NO LIPOIC INITIAL. A PCA în modul de ionizare pozitivă (ESI +). b PCA în modul de ionizare negativă (ESI-)

Pentru a identifica metaboliții responsabili de discriminarea între profilurile metabolomice, scorul VIP a fost utilizat pentru a selecta cei cu cea mai semnificativă contribuție într-un model PLS-DA. Scorurile VIP sunt o sumă ponderată a greutăților PLS pentru fiecare variabilă și măsoară contribuția fiecărei variabile predictive la model. Compușii care prezintă scorul VIP mai mare sunt variabilele mai influente. În această lucrare, scor VIP> 4 au fost folosite ca criteriu pentru selectarea caracteristicilor care au fost îndeplinite de 28 de funcții în modul ESI + și 6 caracteristici în modul ESI astfel selectate pentru identificare ulterioară.

Identificarea metaboliților putativi

Corelațiile dintre parametrii fenotipici și metaboliții putativi ar putea oferi informații cu privire la existența unei relații directe sau inverse între ei (Tabelul 4). Remarcabil de interesantă este corelația negativă dintre metabolitul 14 și ADMA, FFA și β-hidroxibutiratul sau pozitivul cu SOD, care susțin interacțiunea administrării α-LA cu starea oxidativă.

Discuţie

Reducerile mai mari ale IMC și ale masei grase în acele grupuri suplimentate cu α-LA ar putea fi explicate prin efectele directe sau indirecte ale acestui compus organosulfuric derivat din acidul caprilic asupra metabolismului adipocitelor, reglarea biogenezei mitocondriale, rotația lipidelor (lipoliză/lipogeneza) sau inflamația [18, 23], precum și legat de rolul său de antioxidant [37] și efectele sale benefice asupra hiperlipidemiei [38] sau a riscului cardiovascular [39].

Metabolomica a fost aplicată pentru recunoașterea tiparelor și identificarea caracteristică a metabolitului [40, 41], precum și pentru aderența dietei [27] amprente metabolice [42], monitorizarea bolii [43] și rezultatele post-tratament [44]. Analizele metabolomice ne țintite ale probelor de urină colectate la momentul inițial și la finalul unei intervenții nutriționale ar putea oferi informații despre prezența metaboliților discriminanți în rândul grupurilor experimentale, deoarece metabolomica a contribuit la descifrarea răspunsurilor corpului la diferite tratamente la subiecții cu obezitate [45], diabet [46], ficat gras [47] și BPOC [48]. Unii dintre acești metaboliți discriminanți, inclusiv aminoacizi și peptide, specii de lipide sau derivați alimentari, ar putea fi stabiliți ca biomarkeri pentru studii ulterioare [49,50,51] și au fost descriși în unele situații de modificări ale adipozității [52] sau inflamației [53]. În acest context, evaluarea efectelor administrării α-LA (derivat dintr-un acid carboxilic cu 8C) și EPA (20C) la femeile obeze/supraponderale în timpul pierderii în greutate [21] poate beneficia de abordări metabolomice.

Metaboliții discriminanți dintre diferitele grupuri sugerează că α-LA are o importanță remarcabilă în profilul metabolomic urinar, independent de efectul restricției energetice. Prin urmare, metaboliții discriminanți dintre grupuri ar trebui să fie în principal legați de aportul de α-LA. Deși într-o măsură mai mică, metaboliții discriminanți ar putea fi asociați cu o reducere mai mare a greutății corporale, modificări ale metabolismului lipidic și sensibilitate la insulină observate în grupurile LIP. În orice caz, implicarea pierderii în greutate ușor, dar semnificativ mai mare observată în grupurile suplimentate cu α-LA nu a putut fi aruncată [45] sau rolul obezității în sine, deoarece pot fi implicați aminoacizi, acizi grași și alte specii. [54,55,56].

În acest caz, metaboliții discriminanți sunt crescuți în grupul LIP la final cu privire la celelalte grupuri, sugerând că catabolismul proteinei/lipidelor este crescut cu suplimentarea cu α-LA. În acest context, studiile anterioare au sugerat acțiuni lipolitice ale α-LA atât în ​​adipocite cultivate [57], cât și după suplimente alimentare [19]. Mai mult, s-a raportat că administrarea α-LA afectează metabolismul glucozei prin inhibarea căilor de glicoliză și Thr-Gly-Ser [58], precum și prin furnizarea de grupe de carbon ciclului acidului tricarboxilic [59]. Mai mult, α-LA (combinat cu ulei de semințe de in) pare să amelioreze stresul oxidativ hepatic și acumularea de lipide [60] sau scade oxidarea LDL [61] pe lângă proprietățile sale antioxidante recunoscute [37]. Într-adevăr, antioxidanții pot modula stresul oxidativ și răspunsurile inflamatorii prin mecanisme interdependente [62]. Prin urmare, α-LA dietetic poate colabora cu mașini antioxidante endogene la apărarea sistemului preventiv sau de reparare, unde pot apărea interacțiuni și suprapuneri cu alți antioxidanți exogeni [63].

Corelațiile dintre metabolitul 14 și ADMA sau SOD ar putea fi mediate de puterea antioxidantă a α-LA, descrisă anterior în mai multe studii [68], și care implică și beneficii asupra adipozității corpului [18, 21], unde interacțiunile cu vitamina C nu pot fi eliminate [74]. În cele din urmă, corelațiile metabolitului 14 cu FFA și hidroxibutiratul [75] ar putea fi asociate cu un IMC mai mic observat în grupurile de suplimentare α-LA la final.

Concluzii

Rezumând, această abordare metabolomică susține ipoteza că efectele benefice ale administrării α-LA asupra reducerii greutății corporale pot fi explicate parțial prin proprietățile antioxidante ale acestui acid carboxilic organosulfuric, în care interacțiunile cu acidul ascorbic trebuie luate în considerare mediate de dioxohexanoat sau dihidroxi-oxohexanedioat.