Subiecte

Abstract

Introducere

Virusurile gripale A (IAV) reprezintă o amenințare substanțială pentru sănătatea publică la nivel mondial. În secolul trecut, au existat trei mari pandemii de gripă care au cauzat niveluri ridicate de mortalitate, inclusiv cea mai gravă pandemie din istoria înregistrată, gripa spaniolă din 1918, care a fost responsabilă pentru peste 50 de milioane de decese umane 1,2. Subtipul H5N1 extrem de patogen și subtipul H7N9 raportat recent au arătat potențialul de a provoca noi pandemii de gripă umană 3,4,5. Mutabilitatea ridicată a IAV-urilor patogene le permite să devină rezistente la diferite tratamente preventive, inclusiv vaccinuri și anticorpi 6. Caprifoi (HS, Lonicera japonica), o cunoscută plantă chineză, a fost folosită pentru tratarea eficientă a infecției gripale de mii de ani. Mai multe rapoarte au arătat că decoctul HS poate suprima replicarea virusului gripal 7.8. Cu toate acestea, compușii activi din decoctul HS și mecanismul prin care blochează replicarea virală au rămas neclare.

Pe de altă parte, studiul nostru anterior a arătat că MIR168a derivat din plante alimentare poate trece prin tractul gastrointestinal (GI) și poate intra în circulație și în diferite organe ale șoarecilor. În ficatul de șoarece, planta MIR168a vizează proteina adaptor 1 a receptorului de lipoproteine ​​cu densitate mică (LDL) (LDLRAP1), ceea ce duce la creșterea nivelului de colesterol LDL în plasmă 9. Acest studiu a deschis o cale de explorare a funcției fiziologice a microARN-urilor de plante exogene (miARN) la om și animale. Cu toate acestea, implicațiile reglementării regnului încrucișat mediate de miARN de plante și mecanismele responsabile de absorbția și transferul miARN de plante rămân în mare parte necunoscute, subliniind necesitatea unor investigații suplimentare. Având în vedere că pacienții cu infecție gripală au fost administrați în mod tradițional cu decoct HS, presupunem că miARN de plante din decoct HS este capabil să pătrundă în corpul uman prin tractul GI pentru a exercita un efect terapeutic. În prezentul studiu, am arătat că un miARN de plante îmbogățit în decoct HS, numit MIR2911, vizează direct diferite subtipuri de gripă A atât in vitro și in vivo.

Rezultate

Planta MIR2911 este absorbită și livrată în plămâni la șoareci după administrarea decoctului HS sau MIR2911 sintetic

caprifoi

Absorbția a fost evaluată la șoareci cărora li s-au administrat 500 μl de decoct HS (concentrație MIR2911: ± 0,12 pmol/ml) prin hrănire cu un singur gavaj. Concentrația bazală de MIR2911 în plasma de șoarece a fost de 242,0 ± 23,8 fM; concentrația plasmatică a MIR2911 a crescut la 517,1 ± 133,6 fM la 3 ore, a atins un vârf de 1189,2 ± 323,1 fM la 6 ore și a scăzut la 923,0 ± 189,3 fM la 12 ore după administrarea decoctului HS (Figura 1E). Figura 1F a arătat că nivelul MIR2911 din plămânii de șoarece a crescut continuu, a atins un nivel maxim la 6 ore și a scăzut la nivelul bazal la 12 ore după administrare. Cea mai mare parte a MIR2911 din sângele periferic al șoarecilor a fost detectată în fracțiunea care conține microvesicule derivate din celule (MV) (informații suplimentare, Figura S3A), ceea ce înseamnă că MIR2911 din decoctul HS ar putea fi inițial preluat din tractul GI, reambalat în MV de celulele epiteliale intestinale și în cele din urmă secretate în circulație. Datele de imunoprecipitare au arătat că majoritatea MIR2911 din MV derivate din sângele periferic al șoarecelui a fost asociată cu complexul Argonaute 2 (AGO2) (Informații suplimentare, Figura S3B).

MIR2911 de plante se leagă direct de unele tipuri de IAV și inhibă expresia proteinelor PB2 și NS1 codificate de virusul H1N1, precum și replicarea virală H1N1 in vitro

MIR2911 de plante salvează pierderea în greutate indusă de inocularea virusului și inhibă replicarea virală la șoarecii inoculați H1N1

Efectul antiviral al decoctului HS și al MIR2911 a fost testat în continuare la șoareci infectați cu H1N1. În acest experiment, șoarecilor femele BALB/c de 6 săptămâni li s-a administrat MIR2911 sintetic (0,1 nmol pe zi) prin gavaj sau li s-a permis să bea decoct HS cu o zi înainte de a fi inoculați cu virusul EID50 H1N1. După inocularea virusului, șoarecii au fost tratați continuu cu decoct MIR2911 sau HS timp de 7 zile. Așa cum se arată în Figura 3A, șoarecii infectați cu H1N1 singuri sau co-tratați cu H1N1 și ncRNA au pierdut rapid ± 20% din greutatea lor în ziua 7. În schimb, atât administrarea de MIR2911 sintetic, cât și consumul continuu de decoct HS au prevenit în mod eficient pierderea în greutate (6 EID50), în care siturile de legare MIR2911 din genele PB2 și NS1 au fost mutate fără a schimba secvențele de aminoacizi (informații suplimentare, Figura S6), a fost utilizată pentru infectarea șoarecilor. Așa cum se arată în Figura 3D și 3E, mutantul H1N1 a cauzat, de asemenea, pierderea în greutate și a avut un titru viral ridicat similar cu cel al H1N1 de tip sălbatic. În schimb, nici MIR2911 sintetic, nici decoctul HS nu au avut efecte asupra pierderii în greutate și asupra titlului de virus la șoarecii infectați cu H1N1 mutant (Figura 3D-3F).

MIR2911 de plante inhibă replicarea virală H5N1 și H7N9 in vitro și in vivo și salvează mortalitatea indusă de inoculare H5N1

Au fost de asemenea testate efectele inhibitoare ale decoctului sintetic MIR2911 și HS asupra virusului gripal H7N9 raportat recent. A/Anhui/1/2013 (H7N9), izolat anterior de un pacient din China 5, a fost utilizat în următoarele experimente. Așa cum se arată în Figura 4G și 4H, replicarea virusului H7N9 în celulele MDCK infectate a fost puternic suprimată de MIR2911 sintetic sau ARN total extras din decoctul HS (valoarea log a TCID50/ml pentru MIR2911 sintetic a fost redusă de la 3,86 ± 0,16 la 2,80 ± 0,25 la 12 ore și de la 6,02 ± 0,17 la 5,13 ± 0,16 la 24 de ore după transfecție, valoarea log a TCID50/ml pentru ARN total extras din decoctul HS a fost redusă de la 4,17 ± 0,08 la 2,99 ± 0,38 la 12 ore și de la 6,24 ± 0,04 până la 5,49 ± 0,15 la 24 de ore după transfecție). Efectul inhibitor al ARN-ului total decoct HS a fost din nou abolit prin co-transfecție cu antagomirul anti-MIR2911 (Figura 4H). Au fost de asemenea evaluate efectele decoctului sintetic MIR2911 sau HS asupra pierderii în greutate la șoarecii infectați cu H7N9. Așa cum se arată în Figura 4I, șoarecii tratați numai cu virus sau H7N9 plus ncRNA au prezentat o pierdere în greutate de aproape 30% sau respectiv 20%, în ziua 8 după infecție. MIR2911 sintetic a prevenit parțial pierderea în greutate indusă de H7N9 (

Discuţie

În medicina tradițională chineză, ierburile sunt fierte în general timp de câteva ore pentru a pregăti decoctul. Se crede în mod obișnuit că ARN-ul va fi distrus în timpul acestui proces. Într-adevăr, datele noastre au arătat că majoritatea miARN-urilor (de exemplu, MIR166g și MIR2914) îmbogățite în HS au fost degradate în timpul procesului de fierbere. Cu toate acestea, un miARN special, MIR2911, sa dovedit a fi în mare parte intact în decoctul HS final. MIR2911, raportat anterior ca miARN de plantă în Populus euphratica, Nicotiana tabacum și Helianthus annuus 15,16,17, este un miARN atipic deoarece este derivat din ARN ribozomal (ARNr) și nu urmează biogeneza clasică a miARN 18,19,20. Deși mecanismul care stă la baza stabilității ridicate a MIR2911 în timpul procesului de fierbere rămâne necunoscut, datele noastre indică faptul că o secvență unică și un conținut ridicat de GC pot contribui la stabilitatea acesteia. Rezistența MIR2911 la procesul de fierbere sau chiar tratamentul cu RNase a fost abolită după ce secvența a fost modificată și conținutul de GC a fost scăzut. Rezultatele arată că miARN poate fi o componentă importantă, potențial eficientă, dar nerecunoscută anterior în ierburile chinezești.

Unul dintre semnele de întrebare cu privire la funcția biologică potențială a miARN-ului unei plante în celulele mamiferelor este nivelul acelui miARN exogen. Deoarece întâlnirea țintă are loc prin acțiune în masă și miARN-urile exprimate slab au o probabilitate mai mică de a îndeplini transcrierile care conțin țintă 21, un miARN exprimat sub o concentrație prag (22, numărul mediu de copii ale MIR2911 în fiecare celulă pulmonară de șoarece ajunge la 300-400, care este cu mult peste nivelul minim cerut pentru miARN-urile pentru a-și executa funcția. În concordanță cu aceasta, am arătat că concentrația MIR2911 în plămânii de șoarece a fost aproape egală cu cea a miR-25 endogen. Astfel, MIR2911 îndeplinește cerința pentru o concentrație prag de miARN În sprijinul acestui lucru, in vivo Studiul a arătat că MIR2911 ar putea inhiba replicarea virală H1N1, H5N1 și H7N9 în modelul șoarecilor, previne pierderea în greutate indusă de infecția virală și chiar reduce mortalitatea cauzată de infecție.

În concluzie, studiul de față oferă primele dovezi că planta extrem de stabilă MIR2911 poate viza direct mai multe gene virale ale diferitelor IAV și astfel poate suprima infecțiile virale. Cu activitatea sa anti-virală cu spectru larg împotriva IAV-urilor, decoctul HS care conține MIR2911 și MIR2911 poate reprezenta o nouă strategie terapeutică eficientă care poate fi utilizată pentru a supune infecțiile mortale cu IAV. Este important de reținut că de când Fleming a descoperit penicilina în urmă cu aproape un secol, antibioticele au fost dezvoltate pentru a viza diverse infecții bacteriene și au salvat viețile a milioane de oameni. Din păcate, până în prezent nu a fost identificat niciun produs natural care să fie eficient împotriva infecției virale. Sugerăm că, ca primul produs natural care vizează în mod direct IAV-urile, MIR2911 este „penicilina virologică” care servește ca un agent terapeutic și preventiv nou împotriva gripei A, dar potențial și a altor tipuri de viruși.

Material si metode

Declarație privind securitatea biologică

Toate experimentele cu virusuri H5N1 și H7N9 vii au fost efectuate în cadrul facilității îmbunătățite a nivelului de biosiguranță animală 3 (ABSL3 +) din HVRI al CAAS care a fost aprobat pentru o astfel de utilizare de către Ministerul Agriculturii din China și Serviciul Național de Acreditare din China pentru Evaluarea Conformității. Toate studiile pe animale au fost aprobate de către Consiliul de revizuire al HVRI, CAAS.

Viruși

Virusul H1N1 A/Sichuan/1/2009 (SC/09) a fost izolat din primul caz uman de pandemie de gripă din 2009 în China 11. Virusul H5N1 A/Anhui/2/2005 (AH/05) a fost izolat din probele respiratorii ale unui pacient cu rezultat letal din provincia Anhui din China în 2005 14. Virusul H7N9 A/Anhui/1/2013 (AH/13) a fost izolat din probele respiratorii ale unui pacient cu rezultat letal din provincia Anhui din China în 2013 5. Mutantul SC/09 a fost generat de genetică inversă. Toate virusurile salvate au fost secvențiate pentru a exclude orice mutație nedorită. Stocul de virus a fost propagat în ouă de pui specifice fără patogeni.

Caprifoi

HS a fost cumpărat de la un magazin chinezesc de plante medicinale. Decoctul HS a fost preparat prin fierbere 10 g de HS în 100 ml apă timp de 30 min, rezultând decoct ± 50 ml.

Secvențierea profundă Illumina

ARN-urile mici au fost izolate din 1 g de HS sau 5 ml de decoct HS folosind kitul Universal MicroRNA Plant (Bioteke, Beijing, China) conform instrucțiunilor producătorului. Secvențierea Illumina a probelor de ARN a fost efectuată de BGI (Shenzhen, China). După îndepărtarea secvențelor adaptorului din datele brute, citirile curate au fost comparate cu precursorii cunoscuți miARN și miARN maturi din baza de date miRBase 14.0 pentru a identifica miARN-urile de plante conservate pe baza algoritmului Smith-Waterman. Toate datele au fost încărcate în baza de date GEO (numărul de acces GEO: GSE55268).

Izolarea ARN și RT-qPCR a miARN maturi

ARN-uri mici (metoda −ΔΔCt. Pentru a calcula nivelurile absolute de expresie ale miARN-urilor țintă, o serie de oligonucleotide sintetice de miARN la concentrații cunoscute au fost transcrise invers și amplificate. Cantitatea absolută a fiecărui miARN a fost apoi calculată în raport cu curba standard. Cantitativ PCR a fost efectuată folosind o mașină PCR ABI-7900.

Analiza Northern Blotting

Sondele oligonucleotidice complementare miARN-urilor mature au fost marcate la final cu y-32 P-ATP folosind polinucleotid kinaza T4 (Takara, Dalian, China), iar sondele marcate au fost purificate folosind o coloană de spin Sephadex G25 (Roche, Indianapolis, IN, SUA). ARN mic a fost extras din 10 g HS sau 10 ml decoct HS. Probele de ARN au fost fracționate prin PAGE utilizând un gel de poliacrilamidă denaturant 15%. ARN-ul a fost apoi transferat pe o membrană de nailon (Hybond N +, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, SUA) prin electroblotare la 400 mA în 0,5 × TBE tampon timp de 1,5 ore. Membrana a fost reticulată și uscată. A fost efectuată o etapă de prehibridare prin incubarea membranei cu 10 ml soluție ULTRAhyb-Oligo (Ambion, Austin, TX, SUA) la 37 ° C timp de 1 oră. Sonda radiomarcată a fost adăugată direct la soluția ULTRAhyb-Oligo și membrana a fost incubată peste noapte la 37 ° C cu rotație într-un cuptor de hibridizare. După hibridizare, membrana a fost spălată de două ori la stringență scăzută în 2 × SSC, 0,1% SDS la 42 ° C timp de 10 min. Membrana a fost înfășurată într-o folie de plastic și expusă la un film cu raze X la -80 ° C.

Izolarea MT

VM au fost izolate din plasmă prin centrifugare diferențială conform publicațiilor anterioare 23. Pe scurt, după îndepărtarea celulelor și a altor resturi prin centrifugare la 300 × g, 1.200 × g și 10.000 × g, supernatantul a fost centrifugat la 110.000 × g timp de 2 ore (toate etapele au fost efectuate la 4 ° C). MV-urile au fost colectate din pelete și resuspendate în mediu fără FBS.

Imunoprecipitare

MV-urile au fost resuspendate într-un volum adecvat de tampon de liză de imunoprecipitare complet (20 mM Tris-HCI, pH 7,5, 150 mM NaCI, 0,5% NP-40, 2 mM EDTA, 0,5 mM ditiotreitol (DTT), 1 mM NaF, 1 × protează inhibitor și 1 × PMSF) timp de 30 de minute pe gheață. Lizatele au fost imunoprecipitate cu anticorp monoclonal anti-AGO2 de șoarece sau IgG normal de șoarece, urmate de margele de proteină G-Agaroză. După purificare, ARN-ul imunoprecipitat a fost extras cu miRNeasy Mini Kit (Qiagen) și analizat prin RT-qPCR folosind sonde TaqMan miARN (Applied Biosystems).

Analiza bioinformatică

Genomurile virusului gripal au fost colectate din resursele virusului gripal la NCBI 24. RNAhybrid 10 a fost utilizat pentru a scana potențiale ținte ale MIR2911 în secvența virală urmând două reguli. În primul rând, energia minimă de pliere a fost sub -20 kcal/mol. În al doilea rând, regiunea hibridă dintre regiunea semințelor miARN și secvența virală nu conținea nepotriviri. O regulă opțională pentru predicția țintă a impus conservarea situsurilor de legare supuse printre aceleași subtipuri de gripă A.

Conducerea plasmidei și testul luciferazei

Secvențele de legare ale țintelor MIR2911 și ale mutanților (Invitrogen) au fost plasate sintetic în regiunea 3'UTR a plasmidei de raport pMIR (Ambion), iar inserția eficientă a fost confirmată prin secvențiere. Pentru testele de reporter de luciferază, 0,2 μg de plasmidă reporter de luciferază licurică, 0,2 g de vector de expresie β-galactozidază (Ambion) și cantități egale (20 pmol) de MIR2911 sau ncRNA mature au fost transfectate în celule în plăci cu 24 de godeuri. Vectorul β-galactozidază a fost utilizat ca control al transfecției. La 24 de ore după transfecție, celulele au fost analizate folosind un kit de testare a luciferazei (Promega, Madison, WI, SUA).

Analiza Western blot

PB2 sau NS1 plasmidele au fost co-transfectate cu MIR2911 sintetic sau ARNc în celule HEK293T utilizând Lipofectamina 2000 (Invitrogen) conform instrucțiunilor producătorului. Probele de celule cultivate au fost lizate în tampon RIPA (0,5% NP-40, 0,1% deoxicolat de sodiu, 150 mM NaCI, 50 mM Tris-HCI, pH 7,5); lizatele au fost rezolvate cu 10% SDS-PAGE, transferate la o membrană PVDF (Millipore, Bedford, MA, SUA) și testate cu anticorp anti-PB2, anti-NS1 sau anti-GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruze, CA, STATELE UNITE ALE AMERICII).

In vitro studiu

MIR2911 sau ARNc a fost transfectat în celule MDCK utilizând Lipofectamina 2000 (Invitrogen) conform instrucțiunilor producătorului. Apoi, celulele MDCK tratate au fost infectate cu un virus la o multiplicitate de infecție de 0,1 la 37 ° C. După 1 oră de incubație, celulele au fost spălate cu PBS cald și incubate în mediu DMEM suplimentat cu 100 U/ml penicilină, 100 μg/ml streptomicină, 2 μg/ml tripsină tratată cu TPCK și 0,2% fracție de ser albumină bovină V. au fost colectate după 12 sau 24 de ore și depozitate la -70 ° C pentru testul TCID50. Într-un experiment separat, celulele MDCK au fost transfectate cu ARN total extras din HS sau din HS plus antagomir anti-MIR2911. Tratamentele au fost efectuate așa cum s-a descris mai sus.

Studiul mouse-ului

Pentru a studia cinetica MIR2911 la șoareci, șoarecii au fost hrăniți cu decoct HS (concentrație MIR2911: 0,12 nM) sau 0,1 nmol MIR2911 sintetic. Pentru decoct HS, s-au obținut probe de plasmă de cinci grupuri de șoareci (6 șoareci per grup) înainte de tratament ca martori. Șoarecii au fost apoi hrăniți cu decoct HS. La fiecare interval de timp (0,5, 1, 3, 6 sau 12 ore), șoarecii au fost sacrificați, probele de plasmă au fost colectate și ARN-ul total a fost extras. Pentru a colecta probe de țesut, șase grupuri de șoareci (5 șoareci pe grup), inclusiv grupul martor, au fost sacrificate la intervalul de timp fixat. Pentru MIR2911 sintetic, cinci grupuri de șoareci (5 șoareci pe grup) au fost hrăniți cu 100 pmol MIR2911 sintetic. După un interval de timp fixat (0,5, 1, 3, 6 sau 12 ore), șoarecii au fost sacrificați, probe de plasmă și probe de țesut au fost colectate. Probele de plasmă și probele de țesut au fost, de asemenea, colectate de la șoareci fără tratamente pentru a servi drept martori.

Într-un experiment separat, două grupuri de șoareci au fost hrăniți cu decoct HS (concentrație MIR2911: 0,06 nM) sau apă sterilă timp de 3 zile, urmată de colectarea plasmei și a țesuturilor. ARN total a fost extras din aceste probe. A fost efectuat un RT-qPCR pentru a detecta nivelul MIR2911 în aceste probe.