Mengxue Sun, Jie Hua, Gaoshuang Liu, Peiyun Huang, Ningsheng Liu, Xiaopu He; Mirul induce apoptoza și inhibă proliferarea și migrația celulelor canceroase gastrice prin expresia ciclooxigenazei-2 care reglează în jos. Biosci Rep 29 mai 2020; 40 (5): BSR20192372. doi: https://doi.org/10.1042/BSR20192372

induce

Descărcați fișierul de citare:

Abstract

Obiectiv: Prezentul studiu este conceput pentru a evalua efectele antitumorale ale smirnei asupra cancerului gastric uman atât in vitro, cât și in vivo. Metode: Proliferarea celulelor cancerului gastric a fost determinată prin testul MTT. Apoptoza a fost măsurată prin citometrie în flux și colorare Hoechst 33342. Vindecarea rănilor a fost efectuată pentru a evalua efectele mirului asupra migrației. Expresiile COX-2, PCNA, Bcl-2 și Bax au fost detectate prin analiza Western blot. A fost stabilit un model de șoareci nud xenogrefați de cancer gastric uman pentru a evalua efectul anticancer al smirnei in vivo. Rezultate: Mirul a inhibat semnificativ proliferarea celulară, migrația și apoptoza indusă in vitro, precum și inhibarea creșterii tumorale in vivo. În plus, smirna a inhibat expresia PCNA, COX-2 și Bcl-2, precum și a crescut expresia Bax în celulele cancerului gastric. Concluzie: Mirul poate inhiba proliferarea și migrația celulelor canceroase gastrice, precum și induce apoptoza lor prin reglarea în jos a expresiei COX-2.

Introducere

La nivel global, cancerul gastric (GC) este cea mai diagnosticată afecțiune malignă și a doua cauză principală de deces cauzată de cancer [1,2]. În ciuda opțiunilor multiple de tratament, cum ar fi chirurgia, radioterapia, chimioterapia convențională, terapia moleculară, biologică și terapia țintită [3,4], prognosticul GC rămâne slab. Sunt încă necesare tratamente noi pentru cancerul gastric.

Mirul, un exudat rășinos din familia Commiphora [5], a fost folosit de mult timp pentru tratamentul bolilor inflamatorii. Numeroase studii farmacologice au investigat mecanismele sale antiinflamatorii. Guggulsterona, un extract funcțional de bază din smirnă, inhibă creșterea tumorii GC la modelele animale și îmbunătățește sensibilitatea chimică a celulelor cancerului de sân [6,7]. În plus, Commiphoramyrrha induce apoptoza cancerului de prostată uman și a celulelor carcinomului hepatocelular [8-10]. Cu toate acestea, eficacitatea smirnei în tratarea GC nu a fost studiată. Prezentul studiu este prima încercare de a explora efectul mirului asupra morfologiei celulelor GC

Ciclooxigenaza (COX) este o țintă potențială în tratamentul și prevenirea tumorii [11]. În GC, COX-2 participă la procese asociate tumorii, cum ar fi angiogeneza, invazia și evaziunea imună, și indică subtipul histologic, dimensiunea tumorii și stadiul de dezvoltare [12]. COX-2 este supraexprimat în celulele GC umane și este asociat cu o supraviețuire generală slabă [13,14]. Inhibitorii selectivi de ciclooxigenază-2 (COX-2) suprimă proliferarea și induc apoptoza celulelor GC [15]. În studiul de față, au fost aplicate două linii celulare GC umane BGC-823 și SGC-7901 pentru a evalua efectele antitumorale ale smirnei asupra cancerului gastric uman. În plus, expresiile COX-2, antigenul celular proliferant (PCNA) și proteinele legate de apoptoză au fost detectate pentru a elucida în continuare mecanismul ascuns.

Materiale și metode

Extract de mir de decoctare a apei

Mir (# 71202500) a fost achiziționat de la Spitalul de Medicină Tradițională Chineză din provincia Jiangsu (Nanjing, China). Extractul de smirnă a fost preparat așa cum s-a descris anterior [16,17]. Rășina de smirnă sub formă de pulbere (1,0 kg) a fost extrasă cu suficient solvent (2 × 10 L) cu o durată de 1 oră. Procesul de extracție a fost repetat de două ori. Apoi, soluția extrasă a fost fiartă într-un dispozitiv de condensare la reflux timp de 2 ore, răcită în mod natural la temperatura camerei și centrifugată la 3500 rpm timp de 20 min pentru a îndepărta reziduurile. Apoi, supernatantul a fost evaporat într-un evaporator rotativ timp de 12 ore pentru a obține pulberea de smirnă. Pentru a prepara decoctul de extracte de smirnă, 100 mg pulbere de smirnă s-au dizolvat în 5 ml PBS (pentru experimentul in vivo) sau mediu de cultură celulară (pentru experimentul in vitro) într-o baie de apă la 90 ° C - 100 ° C pentru 12 h. Amestecul a fost centrifugat la 10.000 rpm timp de 20 min (de două ori) pentru a obține un supernatant, a trecut printr-un filtru de 0,22 μm și a fost depozitat la 4 ° C.

Liniile celulare și cultura celulară

Liniile celulare umane BGC-823 slab diferențiate și SGC-7901 moderat diferențiate au fost obținute de la Shanghai Institute of Cell Biology (Shanghai, China). Toate celulele au fost cultivate în mod obișnuit în mediu RPMI 1640 (BioInd, Israel) suplimentat cu 10% ser fetal bovin (FBS) și 1% penicilină/streptomicină (Gibco, Carlsbad, CA, S.U.A.). Toate celulele au fost menținute la 37 ° C într-o atmosferă umidificată cu incubator cu 5% CO2.

Testul MTT

Efectul mirului asupra viabilității celulelor GC a fost determinat folosind testul 3 - (4,5 - dimetiltiazol - 2 - il) -2,5 - bromură de difeniltetrazoliu (MTT, Sigma). Celulele BGC-823 și SGC-7901 au fost însămânțate în microplacă cu 96 de godeuri (4 × 103 celule per godeu) și incubate peste noapte în mediu FBS 10%. După 24 de ore, celulele au fost incubate cu diferite concentrații de smirnă (0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5 și 3 mg/ml) timp de 12, 24 sau 48 de ore la 37 ° C. Mediul fără celule a fost utilizat ca martor martor. Ulterior, 200 μl de soluție MTT (0,5 mg/ml) s-au adăugat la fiecare godeu și s-au incubat timp de 4 ore la 37 ° C. După aceea, 200 pl de dimetil sulfoxid (DMSO, Sigma) s-au adăugat la fiecare godeu. Efectele inhibitoare ale proliferării fiecărei combinații au fost evaluate utilizând un cititor de microplăci (MJ Research Inc.) la 570 nm [18].

Analiza citometriei de flux

Apoptoza celulelor GC a fost măsurată cu citometrie în flux utilizând anexaină V, trusa de detectare a apoptozei FITC (Dojindo, Japonia). Pentru fiecare tratament, s-au recoltat 2 × 105 celule (0, 1, 1,5 și 2 mg/ml de smirnă timp de 24 de ore) și s-au spălat de două ori utilizând o soluție salină rece tamponată cu fosfat (PBS). Apoi, celulele au fost resuspendate în 0,6 ml de tampon de legare și lăsate să reacționeze cu 10 ofl de anexină V marcată cu FITC și 10 ul de iodură de propidiu (PI) timp de 15 min la temperatura camerei în întuneric. Ulterior, celulele au fost analizate pe un citometru de flux (Becton Dickinson, CA, S.U.A.). Apoptoza a fost evaluată prin anexina V-FITC și colorarea cu iodură de propidiu.

Colorare Hoechst 33342

Modificările morfologice au fost demonstrate prin microscopie fluorescentă folosind colorarea Hoechst. Celulele BGC823 și SGC7901 au fost tratate cu diferite concentrații de smirnă (0, 1, 1,5 și 2 mg/ml timp de 24 de ore), spălate de două ori cu PBS și fixate. După spălare de două ori cu PBS timp de 3 minute, celulele au fost colorate cu 10 pg/ml Hoechst 33342 (Beyotime, China) timp de 5 minute la temperatura camerei și examinate prin microscopie fluorescentă (Eclipse E-800; Nikon, Tokyo, Japonia). Celulele apoptotice au fost identificate prin fragmentarea nucleară și condensarea cromatinei.

Test in vitro de vindecare a rănilor

Celulele BGC823 și SGC7901 au fost însămânțate în plăci cu șase godeuri și cultivate într-un incubator până la formarea monostraturilor confluente. Celulele au fost înfometate cu ser timp de 12 ore. Plăgile cu zgârieturi au fost create prin răzuirea stratului celular pe fiecare placă de cultură folosind vârful unei pipete de 10 pl. Resturile au fost îndepărtate prin spălarea celulelor cu PBS. În acest moment de pornire (t = 0 h), marginile plăgii au fost observate folosind microscopia cu contrast de fază și fotografiate. Apoi, mediul fără ser conținând 0 sau 1 mg/ml smirnă a fost adăugat pe plăci și celulele au fost incubate timp de până la 48 de ore la 37 ° C. Aceleași câmpuri ale marginii plăgii au fost fotografiate la 24 și 48 de ore.

Analiza xenografică

Analiza Western blot

Analiza Western blot a fost efectuată după cum se descrie în rapoartele noastre anterioare [19]. Celulele cultivate și țesuturile tumorale au fost omogenizate în tampon de liză RIPA (Biyuntian, China) cu un cocktail inhibitor de protează. Apoi, extractele de țesut sau celule au fost centrifugate la 12.000 rpm la 4 ° C și fracțiile supernatante au fost colectate. Proteina totală a fost determinată cu un kit de testare a proteinelor BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL, S.U.A.). Probele de proteine ​​au fost rezolvate pe gel SDS-PAGE 10% și apoi transferate în fluorură de polipropilenă (Millipore, S.U.A.). Membranele au fost blocate în lapte uscat fără grăsimi 5% conținând 0,1% Tween-20 în TBST timp de 2 ore la temperatura camerei. Apoi, membranele au fost incubate la 4 ° C peste noapte cu următorii anticorpi primari. Anticorpi: PCNA (1: 4000, Abcam), Bcl-2 (1: 1000, Abcam), Bax (1: 2000, Abcam), COX-2 (1: 2000, Abcam) și GAPDH (1: 10,000, Sigma– Aldrich). După spălare, probele au fost incubate cu IgG de capră anti-iepure sau anti-șoarece conjugată cu HRP la temperatura camerei timp de 1 oră. Semnalele au fost detectate folosind un reactiv de chemiluminescență îmbunătățit (WBKLS0500, Millipore, S.U.A.). Toate benzile de proteine ​​au fost cuantificate folosind software-ul de analiză a imaginii densitometrice (Quantity One, Bio-Rad, Hercules, CA, S.U.A.). Expresiile relative ale PCNA, Bcl-2, Bax și COX-2 au fost normalizate la cea a GAPDH.

analize statistice

IC50 . . Media (SD) . . 12 h. 24 h. 48 h .
BGC823 2,5017 (0,20) 2,0711 (0,26) 1,3578 (0,09)
SGC7901 2,4530 (0,05) 2.2118 (0,34) 1,4624 (0,03)
IC50 . . Media (SD) . . 12 h. 24 h. 48 h .
BGC823 2,5017 (0,20) 2,0711 (0,26) 1,3578 (0,09)
SGC7901 2,4530 (0,05) 2.2118 (0,34) 1,4624 (0,03)

Datele sunt reprezentate ca media ± SD din trei experimente independente

Mirul a indus apoptoza celulelor BGC823 și SGC7901

Testul AnnexinV-FITC/PI bazat pe citometrie în flux a fost efectuat pentru a investiga apoptoza indusă de mir (Figura 2A). În graficele cu punct fluorescent cu parametri duali, au fost numărate celulele în apoptoză timpurie (anexina V +/PI -, Q3) și apoptoza tardivă (anexina V +/PI +, Q2). Mirul a indus apoptoza ambelor celule BGC-823 și SGC-7901 într-o manieră dependentă de doză (Figura 2C). Pentru a confirma acest efect, aceste celule tratate cu smirnă au fost identificate prin colorarea nucleară Hoechst 33342. Așa cum se arată în Figura 2B, nucleul din celulele GC tratate cu smirnă a fost condensat și fragmentat, a emis fluorescență strălucitoare, care au fost fenomene timpurii de apoptoză.

Mirul induce apoptoza în celulele GC

Mirul a inhibat migrarea celulelor BGC-823 și SGC-7901

A fost investigat efectul smirnei de 1 mg/ml asupra migrației celulelor GC. După 24 și 48 de ore de tratament cu smirnă, spațiul dintre răni s-a lărgit (Figura 3), indicând astfel că vindecarea a fost inhibată. Capacitatea migratorie a celulelor GC a fost slăbită în celulele BGC-823 și SGC-7901 tratate cu mir.

Mirul inhibă vindecarea rănilor monostrat ale celulelor GC

Myrrh a schimbat expresiile PCNA, Bcl-2, Bax și COX-2 în celulele cancerului gastric

Efectele mirului asupra proteinelor legate de apoptoză au fost evaluate prin analiza Western blot. După 24 de ore de tratament cu smirnă, expresia proteinei pro-apoptotice Bax a fost reglată în sus și cea a proteinei anti-apoptotice Bcl-2 a fost reglată în jos într-o manieră dependentă de doză în celulele BGC-823 și SGC-7901. În plus, smirna a scăzut semnificativ expresiile PCNA și COX-2 într-o manieră dependentă de doză în celulele BGC-823 și SGC-7901 (Figura 4).

Efectele smirnei asupra nivelurilor de expresie PCNA, Bcl-2, Bax și COX-2

Mirul a inhibat creșterea tumorilor gastrice cu xenogrefă in vivo

A fost examinat efectul smirnei asupra xenogrefelor de celule BGC823 și SGC7901 (Figura 5). Șoarecii implantați cu celule GC au fost tratați zilnic cu smirnă timp de 2 săptămâni. Nu a avut loc deces în decurs de 2 săptămâni. Nu a existat nicio diferență semnificativă în greutatea corporală între grupurile de șoareci nudi martor și cei tratați cu smirnă (Figura 5B, F). Volumul mediu al tumorii la șoarecii goi tratați cu smirnă a fost semnificativ mai mic decât cel de la șoarecii nud de control (Figura 5C, G).

Mirul inhibă creșterea tumorilor gastrice in vivo

Mirul a reglementat în jos expresia COX-2 în modelul XC cu grefă

Așa cum se arată în Figura 5D, proteina H, COX-2 a fost supraexprimată în țesuturile GC ale șoarecilor nud. Administrarea intragastrică a smirnei a redus supraexpresia COX-2 în țesuturile tumorale ale șoarecilor goi, sugerând astfel că smirna poate inhiba creșterea tumorilor la șoarecii goi prin reglarea în jos a expresiei COX-2 în țesuturile GC.

Discuţie

GC este o afecțiune malignă digestivă cu o incidență și o mortalitate ridicate la nivel global [20]. În ciuda îmbunătățirii terapeutice, rămâne o cauză principală de deces asociat cancerului [21]. GC poate fi diagnosticat precoce prin endoscopie și tratat prin excizie chirurgicală în timp util, dar supraviețuirea pe termen lung a pacientului este încă amenințată de metastaze ridicate, recurență și rezistență la medicamente [22-24]. Compușii medicinali activi din surse naturale au oferit opțiuni alternative de tratament. Mir, exudat rășinos al Commiphora Myrrha (Nees) Engl, prezintă proprietăți antitumorale in vivo și in vitro [6,9,25]. În prezentul studiu, am explorat pentru prima dată efectele smirnei asupra proliferării, apoptozei și migrației celulelor GC.

COX-2, o enzimă nedetectabilă în majoritatea țesuturilor normale, este indusă de diverși citokini, hormoni și factori de creștere și este foarte exprimată în țesuturile inflamatorii și tumorale [26-28]. COX-2 provoacă malignitate prin reglarea în sus a producției de prostaglandine, în principal prostaglandină E2 (PGE2). COX-2 supraexprimat participă la invazie și metastază și agravează prognosticul GC prin căi multiple [29,30]. COX-2 este o potențială moleculă țintă anticanceroasă pentru tratamentul și prevenirea tumorilor maligne [31]. Mirul poate inhiba proliferarea celulelor canceroase ale capului și gâtului prin reducerea expresiei COX-2 [32]. Prezentul studiu este primul care a investigat efectul mirului asupra proliferării și apoptozei celulelor GC. Am arătat că smirna a redus semnificativ expresia COX-2 în celulele BGC-823 și SGC-7901.

Tumorigeneză rezultă din dezechilibrul dintre proliferarea celulară și apoptoză [33]. Pentru a clarifica mecanismele moleculare ale smirnei în tumorigeneză gastrică, expresiile proteinelor asociate cu proliferarea celulară și apoptoză au fost examinate in vitro. Un model de șoarece tumoral a fost construit pentru a observa efectul antitumoral al smirnei in vivo. PCNA, o proteină esențială pentru replicarea și deteriorarea și repararea ADN-ului, este un marker eficient pentru evaluarea fracției de creștere a unei colonii celulare [34,35]. Experimentele noastre au demonstrat că mirul a redus în mod dependent expresia PCNA în celulele BGC-823 și SGC-7901. Proteinele familiei Bcl-2 sunt implicate în mașinile anti-apoptotice și sunt supraexprimate în diferite malignități [36]. Bcl-2 și proteinele citoplasmatice înrudite sunt regulatori cheie în apoptoza celulară. Sunt inhibitori (Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, A1 și Mcl-1) sau acceleratori (Bax, Bim, Bak și Bcl-XS) [37]. Reglarea descendentă a expresiei COX-2 poate induce apoptoza celulelor canceroase prin reglarea în jos a expresiei Bcl-2 și reglarea în sus a expresiei Bax [38,39].

Studiile noastre anterioare au demonstrat că harmina poate regla în jos expresia PCNA și COX-2 în celulele cancerului gastric uman. În plus, harmina crește semnificativ nivelul proteinei Bax și scade nivelul proteinei Bcl-2 în celulele GC umane [40]. Rezultatele noastre sunt în concordanță cu cercetările anterioare și sugerează că mirul inhibă proliferarea și induce apoptoza celulelor GC, probabil prin reglarea în jos a expresiei COX-2 în celulele GC. O diagramă schematică a proteinei relevante de interes (Figura 6) a arătat reglarea simultană a expresiei Bax și reglarea descendentă a expresiei Bcl-2 și a COX-2 în celulele GC tratate cu mir. Rezultatele studiului in vitro oferă dovezi că mirul induce apoptoza celulelor GC într-o manieră dependentă de doză. Mirul ar putea reduce rata de migrare a celulelor GC in vitro. Mai mult, odată cu creșterea timpului administrativ, inhibarea mirului migrației celulelor GC poate crește.