Abstract

excesul de greutate și obezitatea sunt cunoscute a fi printre principalii factori de mediu responsabili de sindromul metabolic care ar putea duce la diabetul de tip 2 la subiecții predispuși (7, 33, 34). Printre evenimentele timpurii care caracterizează stările sindromului premetabolic, se observă frecvent suprasecreția de insulină indusă de glucoză asociată cu rezistența la insulină (15, 33). Această perioadă de hipersecreție de insulină poate fi urmată de o deteriorare suplimentară a secreției de insulină ca răspuns la glucoză (o insuficiență pancreatică și stabilirea diabetului de tip 2; vezi Ref. 14 și 15). Aceste anomalii ar putea fi legate de metabolismul afectat al acizilor grași liberi (FFA) (33), despre care se știe că contribuie la deteriorarea atât a secreției de insulină (47), cât și a acțiunii (13, 46).

insulină

Din studiile efectuate pe diferite modele animale, a reieșit că excesul de greutate bogat în grăsimi (IC) induce o creștere a concentrației plasmatice a trigliceridelor (TG) (6, 10, 11, 30) și/sau a stocării ectopice TG (5, 10 ), o situație care poate produce lipotoxicitate atât la nivel pancreatic (3) cât și la nivel periferic (10). Pe de altă parte, sa propus că disfuncția sistemului nervos autonom indusă de dietă ar putea fi, de asemenea, o componentă importantă a stărilor sindromului premetabolic (revizuită în Ref. 23 și 24). De exemplu, Levin (28) a arătat că a existat o reducere a fluctuației de noradrenalină (NE) în organe, inclusiv creier, la șobolanii predispuși la obezitate înainte de orice creștere a greutății corporale. În plus, prevalența ridicată a obezității și a diabetului de tip 2 în comunitatea indiană Pima ar putea fi consecința unui „genotip gospodar”, incluzând o activitate simpatică scăzută (40).

În studiul de față, șobolanii Wistar normali au fost supuși unei diete HF pentru a studia efectele pe termen scurt și lung asupra secreției și acțiunii insulinei. Am constatat că șobolanii HF au prezentat rapid hipersecreție de insulină ca răspuns la glucoză și rezistență la insulină hepatică (după 2 zile de dietă), urmată de intoleranță la glucoză (7 zile) și pierderea hipersecreției pancreatice de insulină (2 luni). Mai mult, ne-am propus să testăm dacă dieta HF ar putea induce modificări ale activității sistemului nervos central (SNC), concentrându-ne doar pe începutul dietei (a doua zi) când a apărut alterarea secreției și acțiunii insulinei. Într-adevăr, dislipidemia este adesea asociată cu disfuncția sistemului nervos autonom (29, 47) și s-a demonstrat anterior că un tonus simpatic scăzut ar putea fi parțial responsabil în hipersecreția de insulină ca răspuns la glucoză (31).

Animale.

Protocolul experimental a fost aprobat de comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea din Paris 7. Șobolanii masculi Wistar au fost randomizați la vârsta de 6 săptămâni în următoarele două grupuri: un grup a primit chow de laborator standard (113; UAR, Epinay sur Orge, Franța) ad libitum și cealaltă o dietă HF bazată pe untură (231H, UAR) ad libitum (șobolani HF). Dieta HF conținea 40% grăsimi (32,5% ca untură de porc și 7,5% ca ulei de porumb) vs. 4,5% pentru dieta chow și valorile energetice totale au fost, respectiv, 5.100 și 3.000 kcal/kg. Șobolanii au fost adăpostiți individual în cuști din oțel inoxidabil, într-o cameră menținută la 24 ± 3 ° C, cu lumini aprinse de la 7:00 la 19:00; aveau acces gratuit la apă.

Aportul alimentar.

Aportul zilnic de alimente a fost măsurat prin cântărirea peletelor și dieta HF între orele 9:00 și 10:00 AM.

Secreția de insulină indusă de glucoză.

Secreția de insulină ca răspuns la glucoză a fost investigată în fiecare zi după începerea dietei în prima săptămână, apoi în fiecare săptămână în restul de 7 săptămâni. Pe scurt, o doză unică de glucoză a fost injectată intraperitoneal (1 g/kg corp greutate) la șobolani lipsiți de hrană timp de 4 ore. Probele de sânge au fost extrase din vasele caudale la ora 0, 5, 10, 15, 20, 30, și 60 min după injectarea glucozei. Glicemia a fost imediat măsurată cu ajutorul unui analizor de glucoză (Roche Diagnostics, Meylan, Franța). Plasma a fost apoi îndepărtată și depozitată la -20 ° C până la RIA de insulină.

Pentru a aprecia posibila implicare a modificărilor activității simpatice în controlul secreției de insulină după 2 zile de dietă, secreția de insulină indusă de glucoză (GIIS) a fost, de asemenea, studiată în prezența unui agonist α2A-adrenoreceptor, oximetazolina (Sigma Chemical, St. Louis, MO). Răspunsul la insulină a fost testat în prezența 0,1, 1, 10 și 1000 pmol oximetazolină/kg corp, injectat intraperitoneal cu 5 minute înainte de încărcarea glucozei. Am măsurat indicele insulinogen din ora 0 (sarcină de glucoză) la timp 60 min (sfârșitul testului). Punctele de timp au fost 0, 5, 10, 15, 20, 30 și 60 de minute. Fiecare concentrație a corespuns unui grup diferit de șobolani.

Rata de rotație a glucozei.

Măsurătorile au fost efectuate în starea bazală și în timpul clemelor euglicemice-hiperinsulinemice. Șobolanii lipsiți de hrană timp de 4 ore au fost anesteziați cu pentobarbital sodic (50 mg/kg ip). Un cateter a fost introdus în vena jugulară dreaptă pentru prelevarea de sânge. Infuziile (insulină, glucoză marcată și nemarcată) au fost efectuate folosind ace de fluture care au fost introduse în vena safenă.

O doză de amorsare de [3-3 H] glucoză (5 μCi) a fost injectată prin vena safenă la -50 min, urmată de o perfuzie continuă cu o rată de 0,2 μCi/min pe tot parcursul studiului. Probele de sânge au fost extrase la -15, -10 și 0 min în perioada bazală și la timpul 70, 80, și 90 min în timpul clemei euglicemice la starea de echilibru pentru evaluarea ratei de eliminare a glucozei.

Cleme euglicemice-hiperinsulinemice.

Înainte de perfuzia cu insulină, au fost extrase două seturi de probe de sânge pentru determinarea nivelului bazic de glucoză din sânge, insulină plasmatică și niveluri de acid gras neesterificat (NEFA). O doză inițială de insulină (20 mU Actrapid; Novo, Copenhaga, Danemarca) dizolvată în soluție salină izotonică a fost injectată printr-o venă safenă urmată de o perfuzie continuă de insulină (0,4 U · kg -1 -1 h -1) la o rată constantă de 20 μl/min.

În timpul clemelor, sângele a fost prelevat prin vase caudale la fiecare 5 minute pentru a determina glicemia și pentru a ajusta rata perfuziei de glucoză nemarcată pentru a menține euglicemia (glicemia între 4,5 și 6 mM). Clema euglicemică a fost atinsă în decurs de 30-40 de minute și menținută timp de 40 de minute după aceea. Radioactivitatea specifică a glucozei la starea de echilibru și concentrațiile plasmatice de glucoză și insulină au fost determinate în ultimele 20 de minute ale clemei.

Metode analitice.

Glicemia a fost determinată folosind un analizor de glucoză (Roche Diagnostics). Pentru analiza radioactivității [3-3 H] glucozei, probele de sânge au fost deproteinizate cu Ba (OH) 2 și ZnSO4 și supernatantul a fost evaporat la sec la 50 ° C pentru a îndepărta apa tritiată. Reziduul uscat a fost dizolvat în 0,5 ml apă la care s-au adăugat 10 ml soluție Aqualuma plus scintilație (Lumac LSC, Groningen, Olanda), iar radioactivitatea a fost determinată într-un sistem de scintilație lichid Packard Tri-Carb 460C. Insulina plasmatică a fost determinată de un kit RIA (DiaSorin, Les Ullis, Franța). Concentrațiile NEFA au fost măsurate utilizând un test enzimatic (testul NEFA-C; Wako Chemicals).

Cinetica glucozei și exprimarea datelor.

În starea de echilibru bazală, rata de apariție a glucozei (Ra, rata de apariție, reflectând producția de glucoză hepatică) a fost egală cu rata de eliminare a glucozei (Rd, rata de dispariție, reflectând utilizarea glucozei). Rd a fost calculat conform formulei Rd = Ra = [3-3 H] viteza de perfuzie a glucozei [dezintegrări · min -1 (dpm) · min -1] împărțită la activitatea specifică glicemiei (dpm/mg), în ultimii 20 min de clemă de glucoză (50-70 min după debutul perfuziei de insulină). Rezultatele sunt date ca mijloace ± SE.

Rotația pancreasului, ficatului și creierului NE.

Analiza ficatului: conținut de glicogen și TG.

Ficatul (± 0,2 g) a fost măcinat în apă distilată cu Ultraturax (procedură rece ca gheața), iar apoi TG au fost testate în omogenizat folosind trusa comercială „GPO trinder” (Sigma Diagnostic). Glicogenul a fost, de asemenea, măsurat în omogenizat utilizând metoda Roehrig și Allred (42); a fost hidrolizat prin tratament cu amiloglucozidază fără extracție preliminară, iar glucoza a fost dozată printr-o metodă colorimetrică folosind glucoză oxidază.

Procedura de microdializă.

O descriere detaliată a procedurilor chirurgicale și tehnice a fost dată anterior (43). Pe scurt, cu cel puțin 5 zile înainte de experiment, animalul a fost plasat într-un cadru stereotaxic (Kopf Instruments). A fost implantată o canulă de ghidare pentru a introduce sonda de microdializă cu partea sa superioară în nucleul paraventricular (PVN) al hipotalamusului și partea inferioară în hipotalamusul ventromedial (VMH). Coordonatele tipului de ghid au fost (conform atlasului Paxinos și Watson; Ref. 37a) -1,9 mm posterioare bregmei, 0,5 mm laterale și 7 mm ventrale la dură. Sonda de dializă a ieșit la 2 mm dincolo de tubul de ghidare, iar vârful său a atins un punct ventral de 9 mm față de bregma. Ghidul canulei și cateterul venos au fost fixate pe craniu cu șuruburi din oțel inoxidabil și ciment dentar.

În ziua experimentului, un sistem de tuburi conectat la un pivot cu două canale plasat pe fascicul a permis infuzia de fluid în sondă și prelevarea de probe. Debitul (2 μl/min) a permis colectarea probelor de 30 μl la fiecare 15 min. Sonda de dializă a fost introdusă prin ghid la 9:00 AM și perfuzia a fost efectuată cu o soluție de tip Ringer conținând 147 mM Na +, 2,3 mM Ca 2+, 4 mM K + și 155,6 mM Cl -. Primele probe de microdializă au fost prelevate la 4 ore după introducerea sondei; această întârziere este necesară pentru a atinge niveluri stabile de catecolamină. După ce au fost colectate patru probe de bază de 15 minute, șobolanii au fost supuși unei injecții intraperitoneale de glucoză (1 g/kg corp greutate). Prelevarea a fost efectuată la fiecare 15 minute după injecție timp de cel puțin 3 ore.

Măsurarea NE hipotalamic.

Dializații au fost analizați prin intermediul cromatografiei lichide în fază inversă cu detecție electrochimică (Decadă; Antec) la un potențial de 750 mV. Sistemul cromatografic a constat dintr-o buclă de probă de 20 μl care duce la o coloană de 10 cm (Colochrom) cu un diametru intern de 3,2 mm și un ambalaj C18 de 3 μm. Faza mobilă a constat dintr-un tampon acetat conținând 100 μM EDTA, 1 mM acid octanesulfonic și 4% vol/vol acetonitril la pH 3,1. Acest sistem a permis detectarea NE la o sensibilitate de 0,1 nA și separarea acestuia de alți compuși monoaminergici.

Nivelurile medii de NE ale celor patru probe inițiale (înainte de injecția de glucoză) au fost calculate pentru fiecare animal. Procentul de variație în raport cu nivelurile bazale a fost calculat pentru fiecare animal la fiecare moment. Rezultatele au fost apoi exprimate ca mijloace procentuale din valoarea inițială ± SE.

analize statistice.

Analizele statistice au fost efectuate folosind un ANOVA cu măsuri repetate cu doi factori. Comparația dintre șobolanii martor și HF a fost evaluată de un student nepereche t-Test. P

tabelul 1. Greutatea corporală, aportul alimentar și parametrii plasmatici bazali la 2 zile, 1 săptămână și 8 săptămâni după începutul dietei

Valorile sunt medii ± SE. HF, dietă bogată în grăsimi; FFA, acid gras liber; TG, trigliceride.

* P

FIG. 1.Cursul de timp al concentrațiilor plasmatice de glucoză și insulină ca răspuns la încărcătura de glucoză la șobolanii hrăniți cu chow (linie punctată) și cu hrana bogată în grăsimi (linia solidă) după 2 zile de dietă (A și B), 1 săptămână de dietăC și D) și 8 săptămâni de dietă (E și F). Valorile sunt mijloace ± SE; n = 9 șobolani/grup. *P

GIIS la șobolani martor și HF după 2 zile de dietă în prezența oximetazolinei.

În absența oximetazolinei (Fig. 2), indicele insulinogen (ΔI/ΔG) a fost de 2,5 ori mai mare la șobolanii HF vs. control după 2 zile de dietă, care exprimă hipersecreția de insulină ca răspuns la glucoză (prezentat și în Fig. 1, A și B). La șobolanii HF, injecția de oximetazolină a redus semnificativ secreția de insulină ca răspuns la glucoză într-o manieră dependentă de doză: ΔI/ΔG a fost redusă cu 24% vs. valoarea bazală în prezența de 0,1 pmol/kg oximetazolină și redusă semnificativ cu 65, 74 și 93% în prezența de 1, 10 și, respectiv, 1.000 pmol/kg. În schimb, la șobolanii martor, ΔI/ΔG a rămas neschimbată atunci când animalelor li s-au administrat 0,1, 1 și 10 pmol/kg oximetazolină, în timp ce a fost redusă cu 74% în prezența a 1000 pmol/kg.

FIG. 2.Indicele insulinogen (ΔI/ΔG) ca răspuns la încărcarea glucozei în prezența unor cantități în creștere de oximetazolină la șobolanii martor (umpluți) și la șobolanii cu conținut ridicat de grăsimi (bare deschise). *P

Glucoza TR în condiții de clemă bazală și euglicemică-hiperinsulinemică.

Figura 3 prezintă glicemia TR atât în ​​condiții bazale cât și hiperinsulinemice-euglicemice la șobolani HF și șobolani hrăniți după 2 zile de dietă. Cifra de afaceri bazală a fost similară în ambele grupuri. În timpul clemelor hiperinsulinemice, concentrația plasmatică a insulinei a crescut de aproximativ șase ori peste valoarea bazală în ambele grupuri cu perfuzii de insulină de 0,4 U · kg -1 -1 h -1. În această condiție, hiperinsulinemia a fost similară în ambele grupuri și a atins 5001.500 pM (concentrația bazală de insulină plasmatică în ambele grupuri a fost de ± 250 pM). Creșterea indusă de insulină a utilizării glucozei (adică Rd) a fost similară la șobolanii hrăniți cu chow și HF (Fig. 3A); în schimb, scăderea producției de glucoză hepatică (adică Ra) a fost atenuată la șobolanii HF comparativ cu martorii (Fig. 3B). Prin urmare, rezistența la insulină hepatică a fost prezentă încă după 2 zile de dietă IC și a persistat pe tot parcursul studiului (datele nu sunt prezentate).

FIG. 3.Rata de rotație a glucozei în starea bazală (bare umplute) și în timpul clemelor euglicemice-hiperinsulinemice (bare deschise) la șobolani hrăniți cu chow sau o dietă bogată în grăsimi. A: rata de dispariție a glucozei (Rd), adică utilizarea glucozei. B: rata de apariție a glucozei (Ra), adică producția de glucoză hepatică. *P

Aspecte hepatice.

După 2 zile de dietă IC, a existat o creștere semnificativă a conținutului de TG hepatic (50,3 ± 3 mg/g ficat vs. 31,7 ± 2,4 mg/g la șobolanii hrăniți cu chow, P

masa 2. NE0 în pancreas, ficat și creier, k și TR de NE la șobolani HF și martori

Valorile sunt medii ± SE. NE0, nivel bazal al concentrației de noradrenalină (NE); k, constanta ratei de eflux NE; TR, rata cifrei de afaceri.

* P

FIG. 4.Procentul concentrației inițiale de norepinefrină extracelulară la 30 de minute după o injecție ip de glucoză (1 g/kg corp greutate) la șobolani cu conținut ridicat de grăsimi (bare deschise) și martori (bare umplute). NA, diafragmă numerică. *P

Acest studiu demonstrează că dieta HF are ca rezultat rapid un GIIS crescut (2 zile) și o rezistență la insulină hepatică, urmată de o intoleranță la glucoză (1 săptămână). După 8 săptămâni, hipersecreția de insulină ca răspuns la glucoză nu mai este observată, ceea ce se poate explica prin incapacitatea pancreasului de a menține hipersecreția pentru a face față rezistenței la insulină de lungă durată. Șobolanii supuși dietei IC au devenit masiv intoleranți la glucoză, dar nu au prezentat hiperglicemie bazală sau hiperinsulinemie. Mai mult, la 60 de minute după injectarea glucozei, glicemia lor a revenit la nivelul șobolanilor martor (Fig. 1), indicând faptul că insulina era încă suficient de eficientă pentru a menține normoglicemia bazală.

În concluzie, șobolanii Wistar supuși unei diete HF au prezentat rapid o dereglare a secreției și acțiunii insulinei, însoțită de modificări ale activității SNC și independent de o creștere periferică a TG sau FFA. Intoleranța la glucoză s-a instalat în prima săptămână a dietei și s-a agravat, în timp ce hipersecreția de insulină ca răspuns la glucoză a scăzut. Astfel, acest model ar putea fi convenabil pentru studiul rezistenței la insulină indusă de dietă și a intoleranței la glucoză, în special pentru a evalua prin ce mecanisme o supraîncărcare lipidică din dietă ar putea acționa asupra activității SNC și ar putea regla homeostazia glucozei prin acest mod indirect.