• Găsiți acest autor pe Google Scholar
  • Găsiți acest autor pe PubMed
  • Căutați acest autor pe acest site
  • Pentru corespondență: jini38 @ sejong.ac.krtaeilkim @ skku.edu

Editat de John A. Rogers, Northwestern University, Evanston, IL și aprobat pe 12 noiembrie 2018 (primit pentru examinare 14 aprilie 2018)

cronic

Semnificaţie

În această lucrare, am proiectat o sondă electrofiziologică flexibilă care ar putea fi implantată în glanda suprarenală a unui animal viu. Ne-a permis să măsurăm semnalele electrofiziologice ale glandei suprarenale ca răspuns la eliberarea hormonului stresului indusă de stresul acut. Acest raport colectează semnale electrofiziologice ale glandei suprarenale in vivo cu implantare cronică.

Abstract

Prezentăm semnale electrofiziologice (EP) corelate cu activitățile celulelor celulare din cortexul suprarenal și medulla utilizând o sondă EP flexibilă implantabilă a glandei suprarenale. Cu o astfel de sondă, am putut observa semnalele EP de la cortexul suprarenal și medulla ca răspuns la diferiți stimuli de stres, cum ar fi activitatea hormonală îmbunătățită cu hormonul adrenocorticotrop, un biomarker pentru răspunsul la stres cronic și un mediu de stres real, cum ar fi un înot forțat. Test. Această tehnică ar putea fi utilă pentru a monitoriza continuu creșterea nivelului de cortizol, un indicator util al stresului cronic care poate provoca diferite boli.

Astfel, aici prezentăm o sondă flexibilă implantabilă longitudinal care poate fi utilizată pentru a cuantifica relația dintre nivelul de eliberare a cortizolului și semnalele EP de la glanda suprarenală pe baza senzorilor flexibili EP. Am găsit o schimbare semnificativă a semnalului EP atunci când cortizolul a fost eliberat în injecția cu ACTH sau într-un mediu de stres real, cum ar fi un test de înot forțat. Experimentele noastre au fost făcute folosind sonde flexibile special concepute EP, care ar putea pătrunde în glanda suprarenală. Patru electrozi de pe sondă sunt capabili să măsoare continuu semnalele EP atât în ​​cortexul suprarenal, cât și în zona medulară și ne permit să determinăm cu succes activitățile celulelor hormonale și modificarea relativă a nivelului hormonului cortizol într-un mediu de stres model animal in vivo.

Rezultat

Pregătirea sondei EP pentru glanda suprarenală.

Implantarea sondei EP în glanda suprarenală.

Pentru testul in vivo pe animale, sonda a fost implantată în glanda suprarenală a unui șobolan mascul de 8 săptămâni anesteziat prin incizie dorsală (Fig. 1 F și G). După ce sonda a pătruns complet în glanda suprarenală, așa cum se arată în ilustrația schematică din Fig. 1C și imaginea foto din Fig. 1F, a fost fixat pe capsula glandei suprarenale prin ancorarea vârfului vârfului săgeții pe partea opusă a stratului capsulei fibroase a glandei suprarenale (Fig. 1F) (47, 48). După ce sonda a fost blocată, am rupt mecanic arborele navetei, astfel încât să putem elimina stratul gros de navetă pur și simplu retrăgându-ne înapoi (Anexa SI, Fig. S5). În consecință, în stratul suprarenal a rămas doar stratul senzor subțire și flexibil (~ 7 μm). Flexibilitatea materialului PI și natura ultra subțire a senzorului au garantat minimizarea invaziei cu daune biologice minore. Cei patru pini ai conectorului au fost expuși din pielea suturată după operație, în timp ce restul sistemului a fost scufundat (Fig. 1G).

Schimbarea semnalului EP în glanda suprarenală prin stimularea ACTH.

Înainte de a colecta in vivo semnalele EP de la glanda suprarenală, am măsurat semnalele EP de la o glandă suprarenală enucleată in vitro (Anexa SI, Fig. S6). Am implantat sonda în glanda suprarenală enucleată cu soluție salină într-o cutie Petri. Am măsurat apoi semnalul glandei suprarenale ca referință, folosind un instrument comercial de colectare a datelor timp de aproximativ 30 de minute. Apoi, am adăugat 60 ng de ACTH în mediul salin. Amplitudinea și frecvența vârfurilor electrice înregistrate de la glanda suprarenală au fost semnificativ crescute după adăugarea de ACTH.

Semnal EP în glanda suprarenală prin stres acut.

De asemenea, am măsurat schimbarea semnalului EP în întreaga glandă suprarenală indusă de stresul real. Sonda a fost implantată în glanda suprarenală a șobolanilor masculi și au fost reabilitate timp de 2 săptămâni. După 2 săptămâni de recuperare, am colectat semnalul EP inițial al glandei suprarenale ca date de referință, așa cum este descris în Schimbarea semnalului EP în glanda suprarenală prin stimularea ACTH. Apoi, animalul a fost așezat ușor într-o baie cu nivel de apă la 30 cm de jos pentru un test de înot forțat (Fig. 3 A și B și SI Anexa, Fig. S10). După 5 minute de înot, am anesteziat șobolanul pentru înregistrarea EP. Interesant este că semnalul EP a fost prezent atât în ​​cortexul suprarenal, cât și în medulă (Fig. 3 C și D), spre deosebire de cazurile de injecție ACTH (53 ⇓ –55). Concentrația de catecolamină din sânge a scăzut lent până când animalul a fost complet recuperat în perioada poststimulare (54, 56, 57). De asemenea, din moment ce animalul era umed și hipotermic, semnalele hormonale și neuronale active erau încă înregistrate din glanda suprarenală. De asemenea, am anesteziat șobolani cu ketamină anestezică de scurtă durată și am conectat rapid conectorul pentru comunicare. După 2 minute de înregistrare, șobolanii au început să se trezească și s-au deplasat liber în jurul cuștii (Fig. 3 E și F și Anexa SI, Fig. S11). Astfel, concluzionăm că sonda este de asemenea aplicabilă pentru identificarea răspunsurilor căilor neuronale și hormonale.

Aplicarea sondei suprarenale la modelul de stres actual. (A și B) Imagini ale unui șobolan cu test de înot forțat pentru a aplica stres acut. (C) Semnalele EP colectate de la cortexul suprarenal și medular suprarenal înainte și după înotul forțat. Semnalul cortexului suprarenal după înotul forțat (roșu) este îmbunătățit comparativ cu cel dinaintea înotului forțat de 5 minute. Comparativ cu injecția cu ACTH, semnalul EP în medula suprarenală (albastru) este activat dramatic de stresul acut. (D) Înălțimea semnalului mediată de înotul forțat. Numărul de vârfuri pe minut de la cortexul suprarenal (roșu) înainte și după înot a crescut mult după înot, la fel cum numărul de vârfuri pe minut al medularei suprarenale (albastru) s-a modificat după înot. (E) Imaginea unui șobolan în mișcare liber al cărui conector a fost legat de un stadiu principal comercializat pentru a colecta semnalul glandei suprarenale. (F) Semnalul a fost colectat din cortexul suprarenal și medular înainte și după trezire din anestezie. Frecvențele vârfurilor din cortex și medulă au fost ambele crescute imediat după trezire.

Implantarea longitudinală pentru monitorizarea cronică.

Pentru monitorizarea longitudinală cu implantare cronică, trebuie asigurate inflamația minimă și mai puțin invazivă a țesutului și stabilitatea cronică a sondei. Este evident că geometria ultra-subțire la microscop pentru invazia minimă și interconectarea longitudinală cu structuri în formă de cârlig prin organ sunt benefice pentru înregistrarea pe termen lung. Am pregătit două grupuri de animale cu sonda suprarenală. Pentru un grup, a rămas un substrat gros de ~ 7-μm, după îndepărtarea unei navete groase și rigide. Pentru celălalt grup, am lăsat naveta cu grosimea de 250 μm printre țesutul suprarenal. După 2 săptămâni de implantare, animalele au fost complet recuperate ca aspect (Fig. 4A), iar rata lor de supraviețuire pentru 2 săptămâni a fost de 98,2% (n = 165). De asemenea, am examinat felii de glandă suprarenală colorate cu H&E (40 μm grosime). Comparativ cu felia suprarenală goală fără nicio implantare (Fig. 4B, Sus) ca referință, feliile suprarenale cu navetă au arătat disiparea masivă a țesutului indusă de deteriorarea mecanică și țesutul cicatricial din jurul navetei (Fig. 4B, Mijloc). Cu toate acestea, pe feliile suprarenale fără navetă, țesutul suprarenal a fost recuperat complet fără nicio deteriorare semnificativă (Fig. 4B, Partea de jos). Analiza cantitativă a comparat aria secțiunii transversale a țesutului vacant și a țesutului cicatricial între grupul suprarenalian cu și fără navetă între 20 de felii de țesut suprarenal pe grup (Fig. 4C). Feliile suprarenale la 1 săptămână (solid negru) și 2 săptămâni (solid roșu) după implantare (cu o navetă rigidă) nu au prezentat leziuni tisulare semnificativ diferite. Cu toate acestea, feliile suprarenale la 2 săptămâni după implantare (solid albastru; fără navetă rigidă) au prezentat leziuni neglijabile. Cicatrizarea cauzată de daune poate susține, de asemenea, acest rezultat (liniuță neagră, implantare 1 săptămână; liniuță roșie, 2 săptămâni după implantare cu navetă rigidă; și linie albastră, 2 săptămâni după implantare fără navetă rigidă; date statistice mai detaliate pentru supraviețuirea chirurgicală sunt în legenda apendicelui SI, fig. S9). Acest rezultat arată că îndepărtarea navetei permite minimizarea invaziei și deteriorarea glandei suprarenale și, prin urmare, este potrivită pentru implantarea pe termen lung.

De asemenea, am comparat semnalul și impedanța EP în prima săptămână și în a noua săptămână după operație, deoarece calitatea achiziției semnalului EP a fost fiabilă pentru implantarea pe termen lung (Fig. 4D). Am observat creșteri ale semnalului după o injecție cu ACTH de 180 ng. Natura flexibilă a sondei poate funcționa în mod durabil datorită efectelor secundare minimizate, chiar și cu mișcarea animalelor în timpul implantării. Substratul flexibil ajută, de asemenea, la menținerea impedanței scăzute a electrodului (Fig. 4E). Impedanța sondei convenționale în formă de ac a crescut rapid la aproximativ (4, 5) săptămâni după implantare, din cauza defectării sondei și a inflamației țesuturilor. Cu toate acestea, sonda de ancorare a vârfului de săgeată și-a menținut impedanța peste 13 săptămâni după implantare.

Pentru a afla biocompatibilitatea generală a sondei, am implantat-o ​​pe stânga, pe dreapta și pe ambele suprarenale și am comparat schimbările de greutate cu animalul de control (Fig. 4F). Nu au existat diferențe semnificative în schimbarea greutății între cele patru grupuri. Deoarece glanda suprarenală joacă un rol important în metabolismul animalelor, acest rezultat arată că sonda nu a afectat funcția glandei suprarenale. De asemenea, am verificat dacă sonda implantată ar putea provoca stres fizic sau mental animalului. Am monitorizat comportamentul animalelor într-o cușcă în câmp deschis și le-am urmărit mișcarea locomotivei (Fig. 4G). Am stabilit o cușcă în câmp deschis de (60 cm × 60 cm) în camera întunecată și am lăsat șobolanul de control și șobolanul implantat să se miște liber în cușcă. În compararea distanței deplasate și a vitezei medii de locomoție a celor două grupuri de șobolani, nu a existat nicio diferență semnificativă între cele două grupuri; apoi am ajuns la concluzia că sonda nu a cauzat daune grave animalului (Fig. 4H).

Discuţie

Am fabricat senzori EP cu tehnica sistemelor micro-electromecanice (MEMS) pentru a estima modificările hormonului cortizol și a înregistra activitățile celulare adrenocorticale. Semnalul EP în cortexul suprarenal ca răspuns la nivelul crescut de ACTH din sânge poate fi măsurat. Am constatat că frecvența vârfului a crescut în câteva secunde până la câteva minute după administrarea ACTH, în special în cortexul suprarenal. Nivelul de cortizol și nivelul de glucoză din sânge au fost, de asemenea, crescute odată cu creșterea frecvențelor de vârf după injecția cu ACTH. Mai mult, când am injectat o doză mai mare de ACTH, frecvența vârfurilor a crescut foarte mult. Aceste rezultate au arătat că sonda ar putea fi aplicată analizei exocitozei cantitative a hormonului de stres. O astfel de sondă este, de asemenea, aplicabilă unui model de stres real, cum ar fi un test de înot forțat al animalului în mișcare liberă. În acest caz, am constatat că semnalele EP atât în ​​medulă cât și în cortex au fost crescute.

Aceste rezultate arată că sonda ar putea fi utilizată cu succes pentru a înregistra activitățile în timp real ale celulelor suprarenale. Aceste avantaje sugerează că o astfel de sondă nu poate fi utilizată numai pentru studierea sistemului suprarenal, dar poate fi folosită și pentru studiul altor organe hormonale. În concluzie, această tehnică poate oferi o paradigmă pentru diagnosticul și tratamentul bolilor cronice induse de stres și a altor boli hormonale adrenocorticale, cum ar fi boala Cushing și boala Addison. Pentru a realiza potențialul, trebuie efectuate cercetări suplimentare, inclusiv un sistem de alimentare fără fir complet implantabil și un sistem de transmitere a datelor ultraminimizat.

Metode

Detalii despre fabricarea dispozitivului, procedura chirurgicală, implantarea dispozitivului, măsurarea semnalului EP, injecția ACTH, măsurarea nivelului de cortizol și glucoză, inhibarea cortizolului, testarea înotului forțat, testul animalului în mișcare liberă, testul comportamentului în câmp deschis și testul histologic sunt descrise în apendicele SI, Materiale și metode. Toate studiile pe animale au fost efectuate în conformitate cu ghidurile din Coreea pentru Administrația Alimentelor și Medicamentelor. Toate procedurile pentru animale au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea Sungkyunkwan (permisiunea nr. SKKUIACUC-17-1-4-2).

Mulțumiri

Îi mulțumim prof. P. J. Yoo și Dr. K. S. Kim (Universitatea Sungkyunkwan) pentru măsurarea cortizolului, Dr. Y. B. Kim (Institute of Basic Science) pentru analiza datelor EP, și Prof. J. Jo (Universitatea Națională Chonnam) pentru discuții utile. Această cercetare a fost susținută de Programul Pioneer Research Center prin Fundația Națională de Cercetare din Coreea, finanțat de Ministerul Științei și Proiectului TIC, NRF-2014M3C1A3053029.

Note de subsol

  • ↵ 1 Cui îi poate fi adresată corespondența. E-mail: jini38sejong.ac.kr sau taeilkimskku.edu .