De la Secția de Cardiologie (M.F., T.L.W., B.P.R., D.L.G., R.S.D.), Departamentul de Medicină, Universitatea din Illinois din Chicago și West Side Division Veterans Administration (M.F., B.P.R., R.S.D.), Chicago Health Care System, Chicago, Ill.

De la Secția de Cardiologie (M.F., T.L.W., B.P.R., D.L.G., R.S.D.), Departamentul de Medicină, Universitatea din Illinois din Chicago și West Side Division Veterans Administration (M.F., B.P.R., R.S.D.), Chicago Health Care System, Chicago, Ill.

De la Secția de Cardiologie (M.F., T.L.W., B.P.R., D.L.G., R.S.D.), Departamentul de Medicină, Universitatea din Illinois din Chicago și West Side Division Veterans Administration (M.F., B.P.R., R.S.D.), Chicago Health Care System, Chicago, Ill.

De la Secția de Cardiologie (M.F., T.L.W., B.P.R., D.L.G., R.S.D.), Departamentul de Medicină, Universitatea din Illinois din Chicago și West Side Division Veterans Administration (M.F., B.P.R., R.S.D.), Chicago Health Care System, Chicago, Ill.

De la Secția de Cardiologie (M.F., T.L.W., B.P.R., D.L.G., R.S.D.), Departamentul de Medicină, Universitatea din Illinois din Chicago și West Side Division Veterans Administration (M.F., B.P.R., R.S.D.), Chicago Health Care System, Chicago, Ill.

Vizualizați cea mai recentă versiune a acestui articol. Versiunile anterioare:

Abstract

Aminopeptidaza N (APN) este o metallohidrolază abundentă la marginea pensulei a celulelor tubulare proximale ale rinichilor care degradează angiotensina III (Ang III) la angiotensină IV (Ang IV) și, împreună cu dipeptidilaminopeptidaza, degradează Ang IV. Am examinat impactul unei diete bogate în sare asupra activității APN renale și a abundenței de transcrieri la tulpinile de șobolan Sprague-Dawley și Dahl sensibile la sare (SS/Jr). Abundența transcrierii APN și abundența de proteine ​​au fost de aproximativ 2 ori mai mari (P 1 Ang III împarte multe dintre funcțiile fiziologice ale Ang II în sistemul cardiovascular și nervos, inclusiv stimularea secreției de vasopresină, aldosteron și catecolamină. 1 Similar cu Ang II, acționează ca un agent pro-inflamator prin stimularea producției de citokine MCP-1 și activarea NF-kB și AP-1. Ang III a fost postulat pentru a contribui la răspunsul inflamator și la creșterea celulelor cu progresia bolii renale. 2,3 Cu toate acestea, se crede că Ang IV are activitate biologică minoră, deoarece receptorii Ang II AT1 și AT2 au o afinitate slabă pentru Ang IV, iar perfuzia Ang IV nu provoacă efecte dependente de Ang II. 4.5 Recent, receptorii pentru Ang IV au fost detectați în canalele colectoare corticale și celulele mezangiale 6 și Ang IV, spre deosebire de Ang III, sa dovedit a crește fluxul sanguin renal și vasodilatația cerebrală. 7 Astfel, APN poate fi într-o poziție critică pentru a modula absorbția de sare în nefroni și rezistența vasculară renală prin controlul metabolismului Ang III până la Ang IV. Am emis ipoteza că APN poate juca un rol mecanic în adaptarea la sare și hipertensiune.

APN este un constituent major al membranelor de la marginea periei a celulelor tubulare proximale ale rinichilor și a enterocitelor. 8,9 APN (nomenclatura enzimatică IUBMB ec 3.4.11.2, ap-n), cunoscută și sub denumirea de aminopeptidază microsomală sau aminopeptidază M, este o aminopeptidază homodimerică, legată de membrană, peptidază dependentă de zinc, care eliberează preferențial aminoacizi neutri din capătul N-terminal al oligopeptidelor și are specificitate similară cu cea a leucinei aminopeptidazei citosolice. 10.11. APN aparține familiei M1 a clanului MA al peptidazelor, care include glicoproteine ​​de tip II legate de membrană și a fost clonată din 6 specii de mamifere diferite. În studiul de față, am examinat impactul conținutului de sare din dietă asupra APN renal la șobolanii normotensivi și Dahl sensibili la sare (SS).

Metode

Animale

Protocoalele de utilizare a animalelor au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor pentru administrarea veteranilor din Chicago-West Side. Șobolanilor masculi Sprague-Dawley, Lewis și Dahl SS/Jr cu o greutate cuprinsă între 250 și 300 de grame și obținuți de la Harlan Sprague-Dawley (Indianapolis, Ind) li s-au administrat diete bazice (0,3%) și cu conținut ridicat de sare (8%) Purina seria 5500) timp de 10 zile. Sodiul urinar a fost măsurat pentru a confirma dietele. Măsurătorile intra-aortice ale tensiunii arteriale au fost efectuate așa cum s-a descris anterior. Au fost raportate anterior măsurători telemetrice ale tensiunii arteriale ale acestor sosiri. 12

Prepararea ARN-ului

Rinichii au fost îndepărtați și congelați rapid în azot lichid. ARN-ul total a fost izolat cu TRIzol (Invitrogen), cu îndepărtarea ulterioară a contaminanților reziduali utilizând trusa de izolare a ARN-ului total RNeasy (Qiagen). Pentru ARNm poli (A) + de înaltă calitate, ARN-ul total preparat de TRIzol a fost urmat de utilizarea kitului de ARNm Oligotex (Qiagen).

Reacție în lanț în timp real a polimerazei

Amplificările cu reacție în lanț de polimerază verde SYBR (PCR) au fost efectuate așa cum s-a descris anterior. 12 grunduri APN au fost proiectate pe baza numărului de acces la baza de date GenBank AFO39890 (gena Rattus norvegicus APN, exonul 2 și CD-uri parțiale) folosind Primer Express Software versiunea 1.0 (PE Applied Biosystems) și verificate prin rularea PCR virtuală (înainte: 5 ′ TCCTGGAGCCTGGTGAATCC 3 ′; invers: 5, GGAAAGGCGGTGACACTAAT 3 ′). Grundele pentru GAPDH au fost după cum urmează: înainte = 5 ′ GAAGGGCTCATGACCACAGT 3 ′; invers = 5 ′ GGATGCAGGGATGATGTTCT 3 ′. PCR a produs benzi unice de dimensiunile prevăzute. Secvențierea acestor produse clonate a verificat specificitatea genei. Near-log - a fost observată amplificarea liniară, amplificarea având loc între ciclurile 26 și 32. Fiecare probă și reacție au fost reproduse de 3 ori. Expresia a fost normalizată la GAPDH ca referință endogenă și relativă la expresia genei de sare bazală ca calibrator.

Analiza occidentală

Analiza imunoblot a omogenatului de rinichi a fost efectuată așa cum s-a descris anterior. 12 membrane au fost imunoprobate cu anticorp APN policlonal antiuman uman (CD13 Ab-3 Laboratory Vision). Anticorpul secundar a fost un anticorp conjugat anti-șoareci de capră IgG HRP (Santa Cruz Biotechnology). Bloturile au fost controlate pentru diferențele de încărcare a probei prin normalizare la actină.

Activitate APN

Activitatea APN a fost măsurată în extractul renal total (preparat așa cum este descris pentru Western blot) prin metodele lui Ryan și colab 13 și Salardi și colab, 14 cu excepția faptului că am folosit mai degrabă substrat fluorogen Arg-Phe-AFC (Enzyme System Products, Livermore, California) decât substratul radioactiv. Rata de creștere a fluorescenței a fost liniară timp de> 20 de minute. Substratul fără extract de rinichi a fost folosit ca martor. Activitatea enzimatică a fost exprimată ca micromoli de AFC produși pe minut pe miligram de proteine ​​folosind AFC autentic ca calibrator.

Cartografierea hibridă a radiațiilor

A fost utilizat un panou hibrid șobolan - hamster format din 106 clone cu o rată medie de retenție a locusului de 28% creată de Peter Goodfellow (Cambridge, Marea Britanie) (Research Genetics, Huntsville, AL). Fiecare marker a fost testat separat (niciunul nu a fost multiplexat) și ecranat cel puțin de două ori. Prezența sau absența genei aminopeptidazei a fost determinată prin PCR utilizând primeri specifici genei (înainte: 5 ′ ATTTGCCCCCTTTTTACGAG 3 ′; invers: 5 ′ ACTGCATGGGAATGTCACAA 3 ′; mărimea produsului prevăzută: 448 bp). Produsele PCR au fost rezolvate pe un gel de agaroză de 3% și analizate folosind sistemul de documentare a gelului Bio-Rad. Datele au fost transmise la Otsuka Gene Research Institute (http://e4000.otsuka.gr.jp:8012/cgi-bin/RH/rhNgv.pl) pentru testare împotriva hărților cadru.

Markerii locusului genetic au fost integrați în harta comparativă virtuală (http://rgd.mcw.edu/tools/vcmap/vcmap.cgi?Ver=5.0) și au legătură cu locusul trăsăturilor cantitative cunoscute (QTL) și markerii hormonilor de șobolan utilizând Medical College din Ohio (http://home.mco.edu/depts/physiology/research/rat/marker.html), Massachusetts Institute of Technology (http://www-genome.wi.mit.edu/rat/public/), Oxford (http://www.well.ox.ac.uk/rat_mapping_resources/) și Arb (http://www.niams.nih.gov/rtbc/ratgbase/index.htm) legături și hărți ale hormonilor de șobolan.

Statistici

Abundența de transcriere/proteine ​​și activitățile din cadrul tulpinilor au fost comparate utilizând ANOVA și schimbarea între tulpini pe două fețe t Test. Semnificația a fost stabilită la un nivel de P

nacl

figura 1. Abundența APN în rinichi de la șobolani Sprague-Dawley, Lewis și Dahl SS/Jr pe diete cu sare de 8% sau 0,3% (vezi Metode). A, abundența transcrierii APN măsurată prin RT-PCR (cinetică) folosind SYBR verde. B, abundența de proteine ​​APN determinată de analiza occidentală (vezi Metode). Exprimarea genelor în cadrul tulpinilor comparate de ANOVA și schimbarea între tulpini pe două fețe t Test. Media ± SE; n = numărul șobolanilor.

Activitate renală APN

Activitatea APN a fost măsurată în extracte de membrană din rinichi după 10 zile, fie cu diete de sare cu 8%, fie cu 0,3% (Figura 2). La o dietă cu sare de 0,3%, activitatea a fost de aproximativ 3 ori și de 2 ori mai mare la șobolanii Dahl SS/Jr și Lewis comparativ cu șobolanii Sprague-Dawley. Activitatea APN a fost crescută de ~ 10 ori și de 2 ori la șobolanii Sprague-Dawley și, respectiv, la șobolani Lewis de 8% față de 0,3% cu sare. Cu toate acestea, nu a existat nicio modificare a activității la șobolanii Dahl SS/Jr pe aceleași diete.

Figura 2. Activitatea APN totală în extracte de membrană din rinichi de șobolani Sprague-Dawley, Lewis și Dahl SS/Jr pe diete de sare de 8% și 0,3% (vezi Metode). Exprimarea genelor în cadrul tulpinilor comparate de ANOVA și schimbarea între tulpini pe două fețe t Test. Media ± SE; n = numărul șobolanilor.

Cartografierea cromozomială a genei APN

Markerul a fost detectat la 26% dintre hibrizi. Scorul LOD din analiza în 2 puncte a arătat o strânsă corelație a locusului cu D1Rat42, D1Rat38, D1Got122 și D1Got115. Cea mai apropiată legătură a fost cu D1Rat42 (θ = 0,086, LOD = 17,749). D1Rat42 și D1Rat38 se aflau în tensiunea arterială QTL 1b, care a fost definită în mod congenic în Dahl SS/Jr X Lewis. 15 Relația cu alți markeri și încrucișări este indicată în Figura 3.

Figura 3. Diagrama schematică a unui cromozom virtual 1 cu poziția relativă a hărții APN față de tensiunea arterială QTL și alți markeri. Pozițiile marcatorului în cruci definite așa cum sunt proiectate în partea dreaptă a figurii (vezi Metode).

Discuţie

Rezultatele sugerează că APN poate intermedia adaptarea la sare și poate juca un rol în patogeneza hipertensiunii SS. Adaptarea la o dietă bogată în sare la șobolanii Sprague-Dawley și Lewis este însoțită de o creștere a abundenței și activității APN, sugerând că metabolismul crescut al Ang III la Ang IV poate fi un mecanism pentru reducerea absorbției Na + și a rezistenței vasculare renale în adaptarea la o dietă bogată în sare. Din studiile prezente, nu este posibil să se determine dacă o modificare a activității APN contribuie la dezvoltarea versus menținerea presiunii în adaptarea la sare, deoarece relația temporală a creșterii tensiunii arteriale cu creșterea transcrierii APN la șobolani a fost Neevaluat. În schimb, o dietă bogată în sare nu mărește abundența sau activitatea renală APN la șobolanii Dahl SS/Jr. Acest lucru este în concordanță cu ipoteza că activitatea APN redusă contribuie la sensibilitatea la sare. Deoarece Ang III acționează asupra receptorilor AT2, care sunt prezenți în bucla ascendentă groasă a Henle, o metabolizare mai redusă a Ang III la șobolanii Dahl SS pe o dietă cu sare de 8% poate fi un mecanism pentru absorbția crescută de sodiu în bucla ascendentă groasă a Henle în războiul Dahl SS. 16-18

Deoarece nivelurile reduse de plasmă Ang I și Ang II, renină și aldosteron au fost găsite la șobolanii Dahl SS, 19-25, sistemul RAS s-a considerat, în general, că suferă modificări compensatorii normale ca răspuns la hipertensiune și nu joacă un rol în patogenie. de hipertensiune în această tulpină. Cu toate acestea, constatările prezente ridică posibilitatea ca Ang III și IV să joace un rol mecanic în adaptarea sării și în patogeneza hipertensiunii. Aceste măsurători pot ajuta, de asemenea, să explice constatarea unei activități APN renale mai mari în Dahl SS/Jr decât în ​​Sprague-Dawley pe o dietă cu sare de 0,3%, chiar dacă există o absorbție renală mai mare de Na + la șobolanul Dahl SS/Jr . Pentru a aborda în continuare acest lucru necesită măsurători ale metaboliților angiotensinei, inclusiv angiotensinelor II, III și IV, la aceste tulpini de șobolan. Posibilitatea ca alți substraturi APN, care includ o varietate de aminoacizi N-terminali ramificați alifatici, 26 să joace un rol în tensiunea arterială nu poate fi exclusă.

Suport suplimentar pentru APN ca genă candidată la hipertensiune arterială la șobolanul Dahl SS/Jr este oferit prin constatarea faptului că mapează o tensiune arterială raportată QTL pe cromozomul 1. 27,28 Acest lucru este în concordanță cu APN, dar nu demonstrează acest lucru. genă vinovată în QTL care afectează tensiunea arterială. Deoarece acest QTL a fost determinat dintr-o serie de tulpini de șobolani congenici cu segmente de cromozom 1 de la șobolani Lewis introgresați în Dahl SS/Jr, 27,28, acesta oferă suport suplimentar pentru APN ca genă candidată la șobolanul Dahl SS/Jr, deoarece au identificat-o comparând tulpina Lewis și tulpina de șobolan Sprague-Dawley, care este tulpina progenitoare, cu șobolanul Dahl SS/Jr.

Deoarece selecția din prezentul studiu s-a bazat pe diferențe în abundența transcrierii genelor, speculăm că polimorfismele funcționale/alelele genei APN asociate cu hipertensiunea SS se află în regiunile flancante necodificate și/sau intronice ale genei APN, deoarece există o reglare modificată a abundența transcrierii. Gena APN este formată din 20 de exoni care codifică segmente care diferă în mărime de la 18 la 205 aminoacizi. 11 Cu toate acestea, posibilitatea existenței unor diferențe funcționale în regiunea de codificare nu poate fi exclusă, mai ales că activitatea APN este diferită la șobolanii Sprague-Dawley față de Lewis și Dahl SS/Jr pe diete cu sare de 0,3%, chiar dacă abundența de proteine ​​APN este aceeași. . Dacă modificările post-translaționale ale APN, mai degrabă decât gena APN, sunt importante în patogeneza hipertensiunii, genele modificatorilor vinovați (de exemplu, kinaze, fosfataze și altele asemenea) ar trebui să se cosegregeze mai degrabă cu hipertensiunea decât cu gena APN. Secvențierea și analiza ulterioară a cosegregării ar trebui să ajute la rezolvarea acestui lucru în viitor.

Perspective

Rolul pe care îl joacă aminopeptidazele și APN în tensiunea arterială umană rămâne să fie determinat. Au fost identificate treizeci și trei de polimorfisme din gena leucinei aminopeptidazei derivate din adipocite, dintre care unul (un polimorfism Lys528Arg) a fost asociat recent cu hipertensiunea umană esențială. 29 Gena APN a fost atribuită regiunii brațului lung (q11-qter) a cromozomului uman 15, regiune în care există dovezi pentru un QTL pentru tensiunea arterială. 30