Sylwia W. Brooks

o Școală de Medicină, West Virginia University, Morgantown, WV, SUA

colesterol

b Blanchette Rockefeller Neurosciences Institute, Morgantown, WV, SUA

Ava C. Dykes

c Facilitatea principală de biologie moleculară, centre pentru controlul și prevenirea bolilor/Institutul Național pentru Sănătate și Securitate în Muncă, Morgantown, WV, SUA

Bernard G. Schreurs

o Școală de Medicină, West Virginia University, Morgantown, WV, SUA

b Blanchette Rockefeller Neurosciences Institute, Morgantown, WV, SUA

Abstract

INTRODUCERE

Pe măsură ce populația țărilor occidentale îmbătrânește, demența devine o problemă majoră de sănătate. În ultimele decenii, au fost studiați numeroși factori de risc care au contribuit la dezvoltarea tardivă a bolii Alzheimer (AD). Acestea includ diabetul zaharat, hipertensiunea arterială, ateroscleroza și hipercolesterolemia [1]. Colesterolul seric ridicat la vârsta mijlocie este asociat cu un risc crescut de AD [2-4]. Mai mult, persoanele obeze cu hipertensiune arterială și colesterol ridicat au șase ori mai multe șanse de a dezvolta AD decât persoanele fără acești factori de risc [5]. Majoritatea cercetărilor existente care investighează rolul colesterolului în creșterea riscului de AD s-au concentrat asupra modului în care colesterolul afectează procesarea precursorului amiloid-β proteinei (AβPP) și clearance-ului proteinei amiloide-β (Aβ) [6-9], chiar dacă descoperirile recente din subiecții în vârstă sănătoși din punct de vedere neurologic indică faptul că acumularea de Aβ ar putea fi un proces reactiv cu o conexiune mecanică redusă la dezvoltarea bolii [10].

O legătură între colesterol și agregarea Aβ caracteristică AD într-un model animal a fost arătată pentru prima dată la iepurii hrăniți cu colesterol [11] și, de atunci, numeroase experimente au descoperit că colesterolul crește Aβ în modelele in-vitro și in-vivo ale AD [12- 14]. Tratamentul rozătoarelor cu colesterol din dietă a dus la afectarea memoriei caracteristică AD [15, 16], ceea ce am arătat că este și cazul la iepurele hrănit cu colesterol [17-21]. Incapacitatea colesterolului de a traversa bariera hematoencefalică și faptul că o dietă bogată în colesterol nu modifică conținutul de colesterol din creierul iepurelui [12, 17] sugerează că colesterolul seric nu crește singur riscul de AD. Această ipoteză a fost validată într-un studiu care a raportat afectarea memoriei la șoarecii hrăniți cu colesterol, dar nu și la șoarecii mutanți hrăniți cu colesterol lipsiți de enzima CYP27A1 care metabolizează colesterolul în 27-OHC [16]. Acest studiu a sugerat că 27-OHC a mediat efectele negative ale colesterolului asupra memoriei. În plus, s-au găsit niveluri crescute de 27-OHC în creierele AD [22]; prin urmare, fluxul crescut al acestui metabolit al colesterolului în creier ar putea juca un rol important în cascada evenimentelor care conduc la dezvoltarea AD cu debut tardiv [23, 24].

O perspectivă semnificativă asupra unui posibil mecanism care stă la baza relației dintre 27-OHC și AD a apărut odată cu descoperirea că 27-OHC este un modulator endogen al receptorului selectiv de estrogen (SERM) [25, 26]. SERM-urile pot acționa ca liganzi pentru diferite izoforme ale receptorului de estrogen (ER), inclusiv ERα și ERβ, într-o manieră agonistă sau antagonistă a țesutului [27-32].

Scopul acestui studiu a fost explorarea potențialelor modificări mediate de 27-OHC în hipocampul iepurilor hrăniți cu o dietă bogată în colesterol. Am ales să ne concentrăm asupra hipocampului, deoarece este o zonă a creierului importantă pentru învățare și memorie și afectată precoce și profund în patologia AD [33]. Am examinat nivelurile de 27-OHC în țesutul hipocampic al animalelor hipercolesterolemice și de control, precum și expresia ER țintă, mitocondriile și markerul postsinaptic PSD-95. Am emis ipoteza că niveluri mai ridicate ale metabolismului colesterolului în periferie ar duce la un flux crescut de 27-OHC în creier și că creșterea acestui SERM în hipocampus ar afecta semnalizarea ER și țintele sale din aval - mitocondriile și sinapsele.

METODE

Animale, dietă și colectare de țesuturi

Nivelul colesterolului seric

Nivelurile totale de colesterol seric au fost evaluate la sfârșitul experimentului folosind un kit colorimetric (BioAssay Systems, ECCH-100) urmând instrucțiunile producătorului.

Neurodegenerare: colorare cu fluor-jad C.

Colorare cu anticorpi fluorescenți

Extracția 27-OHC din probe de ser

Metodele de extracție cu oxisterol au fost adaptate de la Ahonen și colab. [35]. Pe scurt, 1 ml de metil t-butil eter (MTBE) a fost adăugat la un 150 μL de ser de iepure. Proba a fost agitată timp de 1 min și centrifugată la 2000 rpm timp de 5 min. Faza MTBE a fost filtrată într-o fiolă de probă de sticlă printr-un filtru de seringă de 0,2 μm (Corning Incorporated) și evaporată la sec. Probele au fost reconstituite în 100 μL de acetat de amoniu 5% (50 mM, pH 4,5 cu acid acetic): metanol: acetonitril (1: 3: 6, v/v) și vortexate chiar înainte de analiza prin cromatografie lichidă-spectrometrie de masă (LC) -MS).

Extracția 27-OHC din hipocamp

Metodele de extracție a oxisterolului din creier au fost dezvoltate pe baza lui Ahonen și colab. [35]. Pe scurt, hipocampii stângi intacti au fost cântăriți și omogenizați utilizând ultrasunete și 0,5 ml diclormetan (DCM): amestec de metanol (1: 1, v/v) a fost adăugat în țesut și sonicat pe o baie de gheață timp de 1 min. Probele au fost centrifugate la 13200 rpm timp de 5 minute, apoi supernatantele au fost îndepărtate și procedura a fost repetată. După a doua extracție, supernatantele au fost colectate și evaporate la sec. Imediat înainte de analiza prin LC-MS, probele au fost reconstituite în 100 μL de metanol, centrifugate la 13200 rpm timp de 5 minute și supernatanții colectați în flacoane de probă de sticlă.

Niveluri 27-OHC: Cromatografie lichidă-spectrometrie de masă

Extracte din țesut hipocampic și ser de iepure (1 μL) au fost injectate într-un sistem Dionex UltiMate 3000RS Nano LC (ThermoScientific) folosind o coloană personalizată 2,5 μm XBridge BEH C8, 300 μm × 150 mm (Waters) cu un debit de 5 μL/min. 27-OHC a fost eluat folosind un gradient de 20% A (apă cu 5 mM de formiat de amoniu) și 80% B (100% metanol cu ​​5 mM de formiat de amoniu) timp de 10 min. Gradientul a fost apoi tranziționat de la 80 la 99% B timp de 5 minute, apoi menținut la 99% B timp de 10 minute, urmat de o perioadă de reechilibrare când coloana a fost readusă la 80% B în 5 minute și menținută până la sfârșitul anului alergarea de 35 de minute. 27-OHC eluat la 20,56 min.

Analiza occidentală

Nivelurile de proteine ​​au fost cuantificate folosind un sistem automat „Western” simplu Western de la ProteinSimple [36, 37]. Este un test de electroforeză capilară care încarcă, separă și detectează automat proteinele. Procedurile au fost efectuate cu reactivii producătorului, în conformitate cu protocolul producătorului. Pe scurt, lizatul a fost amestecat cu amestec master standard fluorescent și încălzit la 95 ° C timp de 5 minute. Probele, reactivii de blocare, anticorpii primari și secundari și substratul chemiluminiscent au fost distribuite într-o microplacă inclusă în trusa producătorului. Microplaca pregătită și cartușul capilar au fost plasate într-un instrument Wes (ProteinSimple), iar programul a fost rulat folosind setările implicite. În timpul electroforezei, proteinele au fost separate prin mărime și imobilizate în peretele capilar, iar semnalele chemiluminescente au fost citite de software-ul Compass (versiunea 2.6.5 ProteinSimple) care a analizat zona de sub curbă pentru fiecare anticorp. Zona de sub curbă reprezintă intensitatea semnalului reacției chemiluminescente și este proporțională cu cantitatea de proteină țintă într-un capilar respectiv [38]. Datele au fost analizate de un cercetător orb (SWB) și normalizate la nivelurile de β-actină (anti-β-actină monoclonală de șoarece (sc-47778, Santa Cruz Biotechnology, Inc.)).

Anticorpii utilizați pentru analiza occidentală includ: diluție monoclonală anti-mitocondrie de șoarece (ab3298, Abcam) 1:50, diluție monoclonală de șoarece (MA1-27107, ThermoScientific) diluție 1:50, iepure policlonal ERβ (PA5-16476, ThermoScientific) diluție 1: 50, mouse monoclonal PSD-95 (MA1-046, ThermoScientific) diluție 1:50.