1 Pfizer Global R&D, Alameda, California 94502

1 Pfizer Global R&D, Alameda, California 94502

1 Pfizer Global R&D, Alameda, California 94502

1 Pfizer Global R&D, Alameda, California 94502

1 Pfizer Global R&D, Alameda, California 94502

1 Pfizer Global R&D, Alameda, California 94502

1 Pfizer Global R&D, Alameda, California 94502

Abstract

Efectele hrănirii cu conținut ridicat de grăsimi asupra dezvoltării obezității au fost evaluate la eliminarea intercelulară a moleculei de aderență 1 (ICAM-1) și la șoarecii masculi C57BL/6J (B6) hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi ≤50 de zile. Serul și țesuturile au fost colectate la momentul inițial și după 1, 11 și 50 de zile de dietă. După 11 zile de dietă, șoarecii cu deficiență de ICAM-1, dar nu și B6, șoarecii au dezvoltat ficat gras și au arătat o creștere semnificativă a greutății inguinale. La ziua 50, Șoarecii cu deficit de ICAM-1 au cântărit mai puțin, iar indicele lor de adipozitate și nivelurile de leptină circulante au fost semnificativ mai mici decât cele ale controalelor B6. Pentru a înțelege mai bine răspunsul diferențial timpuriu la dietă, expresia genei ficatului a fost analizată în trei momente de timp prin utilizarea Affymetrix GeneChips. La ambele tulpini, un model similar de expresie genică a fost detectat ca răspuns la dieta bogată în grăsimi. Cu toate acestea, proteina-1 care leagă elementul de reglare a sterolului, apolipoproteina A4 și mARN-urile adipsinei au fost induse în mod semnificativ la ficatul cu deficit de ICAM-1, sugerând că aceste gene și căile lor asociate pot fi implicate în răspunsul acut al dietei observat la șoarecii knockout.

efectele fiziologice ale compoziției dietei murine au fost în centrul multor studii, în special în ceea ce privește obezitatea, diabetul și ateroscleroza (11, 26, 29, 31, 37, 41, 44). Studiile acestor patologii umane au fost mult aprofundate prin utilizarea tulpinii consangvinizate C57BL/6J datorită susceptibilității sale la aceste tulburări, servind astfel ca model pentru bolile umane. Steatoza hepatică sau ficatul gras se caracterizează prin acumularea excesivă de lipide în hepatocite și este o patologie asociată cu obezitatea și diabetul de tip 2 (23, 36). Acumularea excesivă de lipide hepatice poate fi compusă din colesterol sau trigliceride sau ambele. Deși depunerea de lipide hepatice poate rezulta dintr-o serie de cauze, puține gene au fost corelate pozitiv cu această patologie (12, 19, 23,33, 36).

În acest raport, am caracterizat răspunsul șoarecilor C57BL/6J (B6) și ICAM-1 (-/-) la hrănirea bogată în grăsimi atât la nivel fiziologic, cât și la nivel molecular. Cu hrănirea pe termen scurt cu conținut ridicat de grăsimi (11 zile), șoarecii ICAM-1 (-/-) au acumulat semnificativ mai multe lipide adipoase și hepatice decât martorii B6. Cu toate acestea, după 50 de zile de hrănire cu conținut ridicat de grăsimi, șoarecii B6 au cântărit mai mult decât șoarecii ICAM-1 (-/-), iar acumularea de lipide hepatice a fost similară în cele două tulpini. Prin evaluarea nivelurilor de expresie a mii de gene prin utilizarea unei matrice Affymetrix GeneChip, am căutat să obținem informații despre evenimentele moleculare care sunt modificate în ficat în timpul dezvoltării obezității alimentare. Tehnologia Microarray a fost utilizată cu succes pentru a identifica diferențele în expresia genelor în diferite condiții metabolice modificate, inclusiv îmbătrânirea și restricția calorică, obezitatea genetică, diabetul și cancerul (5, 9, 21, 25, 38). Cu toate acestea, acesta este primul raport care descrie modificările globale ale expresiei genelor hepatice la hrănirea bogată în grăsimi.

Animale.

Chimia serică și colectarea țesuturilor.

Profilarea expresiei.

Analiza datelor și statisticilor.

Datele au fost analizate prin ANOVA bidirecțională (tulpină × dietă) cu SAS (Morrisville, NC) versiunea 8 și setul de programe ANALYST. Semnificația statistică în perechi a fost stabilită utilizând un student post hoct-Test. În unele cazuri, valorile aberante statistice au fost eliminate și analiza a fost revizuită; cu toate acestea, nu s-a constatat niciun efect asupra nivelurilor generale de semnificație. Datele sunt prezentate ca mijloace ± SE. Semnificația statistică este definită ca P De 2 ori și acelea

Tabelul 1. Comparația fenotipurilor între C57BL/6J și ICAM-1 (-/-) șoareci

C57BL/6JICAM-1 (-/-) ICAM-1 (-/-) vs. C57BL/6J,% P Valoare Înainte de o dietă bogată în grăsimi Greutate corporală, g20,771 ± 0,40820,769 ± 0,4601000,997 Indicele masei corporale, g/cm2 0,233 ± 0,0030,237 ± 0,0031020,320 Greutate hepatică, g1,093 ± 0,0271.097 ± 0,0371000,925 Grăsime inghinală gr., G0,244 ± 0,0150,274 ± 0,0161120,175 Grăsime epididimală, gr0,282 ± 0,0180,181 ± 0,00964 2 0,259 ± 0,0030,267 ± 0,0041030,110 Greutate hepatică, g1.116 ± 0,0331.428 ± 0,054128 2 0,349 ± 0,0070,314 ± 0,00590

Tabelul 2. Comparația lipidelor din sânge între C57BL/6J și ICAM-1 (-/-) șoareci

C57BL/6JICAM-1 (-/-) ICAM-1 (-/-) vs. C57BL/6J,% P Valoare 11 zile de dietă bogată în grăsimi Colesterol total, mg/dl169.698 ± 5.301196.402 ± 14.3001160,248 Colesterol VLDL, mg/dl10.202 ± 1.20114.896 ± 1.7941460,072 Colesterol LDL, mg/dl28.501 ± 1.70427.006 ± 1.687950,285 Colesterol HDL, mg/dl129.897 ± 4.999153.704 ± 14.0011180,295 Trigliceridă, mg/dl72.587 ± 8.295124.202 ± 11.7851710,00311 zile pe chow Colesterol total, mg/dl64.495 ± 5.10172.198 ± 4.8971120,271 Colesterol VLDL, mg/dl3.803 ± 0.8017,789 ± 0,6872050,001 Colesterol LDL, mg/dl8.298 ± 1.1017,501 ± 0,589900,509 Colesterol HDL, mg/dl52.104 ± 4.38656.496 ± 4.0011080,446 Trigliceride, mg/dl52.578 ± 7.201151.200 ± 11.101293

expresiei

FIG. 1.Secțiuni hepatice congelate derivate din C57BL/6J (A) și molecula de adeziune intercelulară-1 (ICAM-1) (-/-)B) șoarecii, care au fost hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi timp de 11 zile, au fost fixați în formalină și colorați cu ulei roșu O.

Pentru a caracteriza efectele hrănirii cu conținut ridicat de grăsimi asupra metabolismului glucozei, nivelurile de glucoză din sânge și insulină au fost măsurate în ambele tulpini. Nivelurile serice de insulină au fost mai mari la șoarecii cu deficit de ICAM-1 decât la șoarecii B6 înainte și, de asemenea, după 11 zile de hrănire cu conținut ridicat de grăsimi (Tabelul 1). Diferența dintre nivelurile de insulină din sânge a devenit nesemnificativă statistic între cele două tulpini după 50 de zile de hrănire bogată în grăsimi. În ciuda nivelurilor crescute de insulină în eliminările de la zile 0 și11, nivelurile de glucoză din sânge nu au fost semnificativ diferite în orice moment al celor două tulpini (Tabelul 1). Toleranța la glucoză și sensibilitatea la insulină au fost, de asemenea, evaluate după 6 săptămâni de dietă bogată în grăsimi, dar nu au diferit între tulpini (nu este prezentat).

Analiza profilelor lipidice din sânge ale șoarecilor B6 și ICAM-1 (-/-) a arătat că șoarecii knockout au avut niveluri mai ridicate de trigliceride serice și colesterol de lipoproteine ​​cu densitate foarte mică (VLDL) decât șoarecii B6 când au fost hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi 11 zile (Tabelul 2). Rezultate similare au fost obținute de la șoareci hrăniți cu o dietă chow, sugerând că diferențele observate nu depind de cantitatea sau compoziția de grăsimi din dietă. În schimb, nu s-au găsit diferențe semnificative între lipoproteinele cu densitate scăzută (LDL), lipoproteinele cu densitate mare (HDL) și nivelurile totale de colesterol dintre aceste două tulpini (Tabelul 2).

FIG. 2.Greutatea corpului și a țesuturilor șoarecilor hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi.A: greutatea corpului C57BL/6J (n = 14) și ICAM-1 (-/-)n = 13) șoarecistânga) sau ICAM-1 (+/+)n = 11) și ICAM-1 (-/-)n = 9) Colegii de gunoi din generația F2dreapta) a alimentat o dietă bogată în grăsimi timp de ≤50 de zile. B: greutăți hepatice, tampon de grăsime inghinală (ING) și tampon de grăsime epididimal (EPI) de la C57BL/6Jn = 14-18) și ICAM-1 (-/-)n = 13-17)stânga) sau de la ICAM-1 (+/+) (n = 7-13) și ICAM-1 (-/-)n = 6-11) Colegii de gunoi din generația F2dreapta) a alimentat dieta bogată în grăsimi timp de 50 de zile. Barele de eroare denotă SE; *P

FIG. 3.Northern blot care arată expresia genelor în ficatul ICO-1 (-/-) (I) și a șoarecilor C57BL/6J (C) hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi timp de 0, 1 și 11 zile. ME, enzimă malică; FAS, acizi grași sintaza; mal 1, proteină de legare a lipidelor keratinocite; Sq. Synth., Squalene sinthase; SREBP-1, proteina 1 care leagă elementul de reglare a sterolului; ApoA4, apolipoproteină A4. Mesajul 36B4 a fost utilizat ca control pentru nivelurile de expresie genică. Probele totale de ARN (20 μg) au fost preparate și sondate așa cum este descris în materiale și metode .

Pentru a valida rezultatele GeneChip, câteva gene implicate în metabolismul lipidelor au fost selectate în mod arbitrar, iar analiza Northern blot a fost utilizată pentru a confirma expresia diferențială. Lipsa mesajului ICAM-1 la șoareci knockout a fost, de asemenea, verificată prin această metodă (Fig. 3). Așa cum se arată în FIG. 3, modificările transcripționale observate prin analiza GeneChip pentru ME, FAS, mal 1, SREBP-1, apoA-4 și adipsină au fost confirmate. O comparație a gradului de diferențe în intensitatea hibridizării în timp din analiza Northern blot și datele Affymetrix este prezentată în Fig. 4. În general, această comparație grafică a datelor arată că rezultatele obținute prin cele două metode sunt foarte similare. Singura excepție este squalene sintaza, pentru care nivelurile mesajelor au fost dependente de metodă, atât în ​​ceea ce privește gradul de schimbare, cât și în tendința generală (Fig. 4).

FIG. 4.Comparația modificărilor expresiei genelor hepatice prin Northern blot și Affymetrix GeneChip după 0, 1 sau 11 zile pe dieta bogată în grăsimi pentru șoarecii C57BL/6J și ICAM-1 (-/-). Gradul de schimbare în expresia genelor se bazează pe ziua 0 nivelul de expresie de bază al C57BL/6J. Datele Affymetrix prezentate pentru SREBP-1 reflectă mediile celor 4 seturi de sonde Affymetrix.

S-a sugerat că calea factorului de transcripție PPARα este implicată în obezitatea ICAM-1 (-/-) (6). Așa cum se arată în Fig.5, nu s-a găsit nicio diferență în nivelurile mesajelor, fie de PPARα, fie de CPT-1, o genă controlată transcripțional de PPARα, între ficatul ICAM-1 cu deficit de ficat de control B6 la oricare dintre momentele examinate. Figura 5A arată pata nordică și Fig. 5B arată nivelul de expresie relativ, exprimat ca grade de diferență în timp, atât pentru analiza Northern blot, cât și pentru analiza GeneChip. Deși nivelurile de ARNm PPARα și CPT-1 nu au diferit între tulpini, rezultatele Northern blot au arătat că ambele gene au fost induse de aproximativ două ori după 11 zile de hrănire cu conținut ridicat de grăsimi (Fig. 5A). În schimb, nivelurile de ARNm PPARy au fost ușor crescute doar la ziua 11 și numai la șoareci knockout (Fig. 5, A și B).

FIG. 5.Compararea modificărilor expresiei genelor hepatice legate de receptorul α (PPARα) activat cu proliferatorul peroxizomului prin metode Northern blot și Affymetrix GeneChip după 0, 1 sau 11 zile în dieta bogată în grăsimi pentru ICAM-1 (-/-) ( I) și șoareci C57BL/6J (C). CPT-1, carnitina palmitoiltransferază 1. Mesajul 36B4 a fost utilizat ca control pentru nivelurile de expresie genică. Probele totale de ARN (20 μg) au fost preparate și sondate așa cum este descris în materiale și metode. Gradul de schimbare în expresia genelor se bazează pe ziua 0nivelul de expresie de bază al C57BL/6J.

Șoarecii deficienți de ICAM-1 au fost raportați anterior că dezvoltă spontan obezitate la debutul maturității, fără o creștere a aportului de alimente și, de asemenea, au demonstrat o susceptibilitate crescută la obezitate atunci când au fost hrăniți cu un tip occidental de dietă bogată în grăsimi (6). Acești autori au sugerat că leucocitele pot suprima depunerea excesivă de trigliceride și pot fi implicate în modularea transportului și stocării lipidelor. Am căutat să înțelegem mecanismul molecular de bază responsabil pentru aceste diferențe raportate în depunerea grăsimii la animalele ICAM-1 (-/-) comparativ cu animalele martor.

Interesant este că descoperirile noastre nu le-au confirmat pe cele ale lui Dong și colab. (6). Nu am observat obezitate spontană în niciunul dintre sexe, chiar și atunci când animalele ICAM-1 (-/-) au fost hrănite cu dieta chow mai mult de un an (datele nu sunt prezentate). Mai mult decât atât, după 50 de zile de hrănire cu conținut ridicat de grăsimi, nu a fost observată o creștere semnificativă a greutății corporale, a indicelui de adipozitate sau a greutăților tamponului de grăsime la șoarecii masculi ICAM-1 (-/-) peste cei ai controalelor B6 (Tabelul 1).

Deși nu putem exclude un rol al diferențelor de mediu, cum ar fi lotul de dietă, sursa de apă, tipul de cușcă, temperatura ambiantă și/sau mediul imunitar, credem că discrepanțele în rezultatele dintre cele două studii se datorează diferențelor de tulpină. fundal. Animalele pe care Dong și colab. (6) utilizate în munca lor au fost inițial stabilite pe un fundal mixt 129/B6/DBA2 și au fost încrucișate de patru ori (N4) cu fundalul B6. Animalele utilizate în acest studiu au fost similare, cu excepția faptului că au fost încrucișate de opt ori (N8) sau nouă (N9 pentru generația F2) de șoareci B6. Prin urmare, animalele noastre au avut un procent semnificativ mai mare de genom B6 decât șoarecii utilizați în studiul realizat de Dong și colab. Contribuția genomului 129/DBA2 la N4 este de așteptat statistic să fie de ± 4,7%, în timp ce ar trebui să fie * Acești autori au contribuit în mod egal.

NOTĂ DE PICIOASĂ

Adresa pentru solicitări de reimprimare și alte corespondențe: F. M. Gregoire, Metabolex, Inc., 3876 Bay Center Place, Hayward, CA 94545 (E-mail: [email protected] com).