Abstract

OBIECTIV Factorul de creștere a fibroblastelor 21 (FGF21) este un mediator cheie al oxidării acizilor grași și al metabolismului lipidelor. Dozele farmacologice de FGF21 îmbunătățesc toleranța la glucoză, scad acizii grași fără ser și conduc la pierderea în greutate la șoarecii obezi. În mod surprinzător, totuși, nivelurile de FGF21 sunt crescute la șoarecii obezi ob/ob și db/db și se corelează pozitiv cu IMC la om. Cu toate acestea, efectele benefice așteptate ale FGF21 endogen pentru a crește toleranța la glucoză și a reduce trigliceridele circulante sunt absente în obezitate.

creștere

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII Pentru a testa ipoteza că obezitatea este o stare de rezistență la FGF21, am evaluat răspunsul șoarecilor obezi la administrarea exogenă de FGF21. Făcând acest lucru, am evaluat impactul obezității induse de dietă asupra semnalizării FGF21 și a evenimentelor transcripționale rezultate în ficat și țesutul adipos alb. De asemenea, am analizat impactul fiziologic al rezistenței la FGF21 prin evaluarea parametrilor serici care sunt reglați acut de FGF21.

REZULTATE Când șoarecii obezi sunt tratați cu FGF21, aceștia prezintă atât un răspuns de semnalizare atenuat semnificativ, astfel cum este evaluat prin fosforilarea proteinei kinazei 1 și 2 (ERK1/2) extracelulare, precum și o inducție afectată a genelor țintă FGF21, inclusiv cFos și EGR1. Aceste efecte au fost observate atât în ​​ficat, cât și în grăsimi. În mod similar, modificările parametrilor serici, cum ar fi scăderea glucozei și a acizilor grași liberi, sunt atenuate la șoarecii DIO tratați cu FGF21.

CONCLUZII Aceste date demonstrează că șoarecii DIO au crescut nivelurile endogene de FGF21 și răspund slab la FGF21 exogen. Prin urmare, propunem că obezitatea este o stare rezistentă la FGF21.

Factorul de creștere a fibroblastului 21 (FGF21) a apărut ca un mediator cheie al stării de post și contribuie la reglarea lipolizei în țesutul adipos alb (WAT) (1-3), precum și la creșterea utilizării substratului prin creșterea oxidării acizilor grași în ficat (4 ). În plus, alte studii au descoperit că FGF21 crește absorbția glucozei independentă de insulină în adipocitele 3T3L1. Tratamentul șoarecilor ob/ob cu doze farmacologice de FGF21 duce la o toleranță îmbunătățită la glucoză și la trigliceride serice reduse (5). Studiile ulterioare au raportat că tratamentul cronic al șoarecilor obezi induse de dietă (DIO) cu FGF21 duce, de asemenea, la un profil metabolic îmbunătățit (6,7). Un efect similar a fost raportat la maimuțele diabetice (8). În concordanță cu acțiunile sale privind oxidarea lipidelor în ficat și lipoliza în WAT, șoarecii lipsiți de FGF21 demonstrează un fenotip de obezitate ușoară și un răspuns atipic la hrănirea unei diete ketogenice (9).

FGF21 se leagă de izoforme ale receptorilor FGF 1, 2, 3 și 4 (10-12) în prezența unui co-receptor critic numit „βKlotho”. Acest lucru duce la dimerizarea rapidă și autofosforilarea receptorului FGF, care recrutează și activează cascada de semnalizare a kinazei ras/raf MAP. Aceasta duce în cele din urmă la activarea proteinei kinazei 1 și 2 activate mitogen extracelular (ERK1/2), care se translocează în nucleu și activează un subset de factori de transcripție. O parte a acestui proces este activarea factorilor de transcripție care reglează elementele răspunsului seric, ducând la inducerea expresiei genei timpurii imediat. Acum este bine stabilit că tratamentul exogen al FGF21 duce la o inducere rapidă a fosforilării ERK1/2 în depozitele de țesut adipos (13-15). În plus, laboratorul nostru și alții (15) au găsit rezultate similare în ficat.

Bogăția de date despre această peptidă sugerează că FGF21 poate fi o moleculă excelentă candidat pentru tratamentul terapeutic al diabetului și al bolilor cardiovasculare asociate cu obezitatea. Prin urmare, este surprinzător faptul că în stările obeze, care sunt de obicei asociate cu intoleranța la glucoză, nivelurile serice de FGF21 sunt ridicate. De fapt, atât la obezii induse de dieta rozătoarelor (DIO) (16), cât și la șoarecii obezi genetici db/db (17) și ob/ob, expresia FGF21 este crescută în WAT și ficat (18). În plus, la om, nivelurile circulante de FGF21 s-au dovedit a fi corelate pozitiv cu IMC (17,19). Această creștere a nivelurilor circulante se observă în contextul toleranței la glucoză afectată și a acumulării crescute de lipide în ficat. Acest lucru sugerează că, în starea obeză, FGF21 nu reușește să-și exercite efectele scontate asupra homeostaziei glucozei și a oxidării lipidelor. În concordanță cu acest lucru, un articol recent a constatat că perfuzia acută continuă de FGF21 pentru controlul șoarecilor duce la scăderea cantității de glucoză hepatică și la sensibilitate crescută la insulină, fără a avea niciun efect asupra șoarecilor ob/ob obezi (20). Aceste date ne-au condus la ipoteza că obezitatea este o stare rezistentă la FGF21.

Pentru a testa această ipoteză, am examinat efectele FGF21 exogene asupra transducției semnalului și a expresiei genice în ficat și WAT a șoarecilor DIO și slabi. Am constatat că șoarecii DIO afișează un răspuns de semnalizare sever afectat la FGF21 și un efect atenuat pentru a induce expresia genelor țintă. În plus, tratamentul cu doză mică de FGF21 a fost asociat cu o îmbunătățire afectată a parametrilor serici la șoarecii DIO. Aceste constatări sunt în concordanță cu obezitatea fiind o stare rezistentă la FGF21.

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Animale.

Toate studiile au fost efectuate folosind șoareci masculi C57Bl6 obținuți de la Laboratorul Jackson (Bar Harbor, ME) și menținuți la 24 ° C pe un ciclu de lumină-întuneric 12: 12-h. Pentru studiile DIO, șoarecii au fost plasați pe o dietă obezogenă bogată în grăsimi/bogată în zaharoză (Research Diets, New Brunswick, NJ) timp de 22 de săptămâni pentru a obține un câștig în medie de 10 g. Șoarecii au fost aclimatizați la o manipulare excesivă timp de cel puțin 10 zile înainte de experimentare. Toate studiile au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor din Centrul Medical Beth Israel Deaconess (IACUC).

Proteina FGF21.

FGF21 uman recombinant a fost exprimat în Escherichia coli și repliat in vitro așa cum s-a descris anterior (5).

Analiza semnalizării FGF21.

Pentru analiza evenimentelor acute de semnalizare în ficat și WAT, FGF21 a fost administrat prin vena cavă inferioară la șoareci adulți anesteziați. Pe scurt, șoarecii au fost anesteziați prin injectarea intraperitoneală a unui cocktail de ketamină/xilazenă. Cavitatea peritoneală a fost apoi expusă și FGF21 sau soluție salină a fost injectată direct în vena cavă inferioară într-un volum total de 20 μl. După 10 minute, ficatul și țesutul adipos perigonadal au fost disecate, congelate rapid și depozitate la -80 ° C. Proteina a fost extrasă utilizând un tampon de test radioimunoprecipitare și evaluată utilizând o tehnică Western blot. După procesare, bloturile au fost sondate folosind anticorpi împotriva pERK1/2 (Cell Signaling, Danvers, MA) și ERK1/2 (AbCam, Cambridge, MA).

Analiza răspunsului genetic timpuriu imediat.

Pentru a evalua răspunsul genetic precoce imediat, șoarecii au fost injectați intraperitoneal fie cu soluție salină (n = 6), fie cu diferite doze de FGF21 recombinant (n = 6) într-un volum total de 200 μl. Șoarecii au fost apoi așezați înapoi în cușca lor de acasă fără acces la alimente pentru restul experimentului. După 2 ore, șoarecii au fost uciși. Țesuturile au fost congelate rapid în azot lichid înainte de depozitare la -80 ° C. Sângele a fost colectat prin puncție cardiacă și fracționat folosind centrifugarea la 10.000 rpm timp de 10 min. Serul a fost separat și depozitat la -20 ° C. Expresia ARNm de Egr1 și cFos a fost evaluată folosind RT-PCR cantitativă. Expresia proteinei Egr1 a fost evaluată folosind Western blot cu un anticorp primar crescut împotriva Egr1 (Cell Signaling, Danvers, MA).

RT-PCR cantitativ.

ARN, din țesut congelat rapid, a fost extras folosind un kit de țesut lipidic ARN (Qiagen, Germantown, MD) conform instrucțiunilor. A fost inclusă o etapă de digestie DNAse (Qiagen) pentru a preveni contaminarea ADN-ului genomic. ADNc a fost generat din 0,5 μg ARN, folosind oligo (dt) și primeri hexamer aleatori și transcriptaza inversă a virusului leucemiei murinice Moloney (Quantitech RT pentru PCR; Qiagen) și s-a diluat de 10 ori până la 0,5 ml. PCR cantitativă a fost realizată utilizând ciclatorul termic 7800HT (Applied Biosystems, Foster City, CA) și mixul master SYBR Green (Applied Biosystems). Exprimarea fiecărei gene țintă a fost cuantificată prin transformare împotriva unei curbe standard și normalizată la expresia ciclofilinei, cu excepția cazului în care se specifică altfel. Grundurile au fost proiectate folosind software-ul online Primer3 (Open Source) și obținute de la Invitrogen (Carlsbad, CA) așa cum este detaliat în Tabelul 1 suplimentar (disponibil într-un apendice online la http://diabetes.diabetesjournals.org/cgi/content/full/db10 -0193/DC1).

Western blot.

Pe scurt, țesuturile au fost omogenizate în tampon de test radioimunoprecipitare (150 mmol/l NaCI, 1,0% NP-40, 0,5% deoxicolat de sodiu, 0,1% SDS, 50 mmol/l Tris, pH 8,0) suplimentat cu un mini-protează complet inhibitor Cocktail Roche, Basel, Elveția) și inhibitori ai fosfatazei. Concentrațiile de proteine ​​au fost determinate cu testul proteinei BCA (Pierce, Thermo Scientific). Un total de 20 μg de proteine ​​au fost analizate prin SDS-PAGE pe un gel Tris/HCI 4-15% Criterion (Bio-Rad, Hercules, CA) și transferate pe nitroceluloză (Protran; Schleicher și Schuell, Keene, NH). Bloturile au fost apoi sondate cu fiecare anticorp primar specificat, iar bloturile au fost dezvoltate cu reactiv chemiluminiscent Super Signal West Pico (Pierce, Thermo Scientific, Rockford, IL).

Hormoni și metaboliți serici.

Probele de sânge au fost colectate pe gheață și fie heparinizate sau filate la temperatura camerei înainte de stocarea plasmei la 4 ° C sau lăsate să se coaguleze și filate la 4 ° C înainte de congelarea rapidă a serului în azot lichid. Metaboliții serici au fost măsurați prin test enzimatic la scară mică pentru glucoză (Stanbio Laboratory, Boerne, TX) și acizi grași neesterificați (NEFA) (Wako Diagnostics, Richmond, VA). Nivelurile endogene de FGF21 au fost determinate printr-o analiză specifică imunosorbentă legată de enzima șoarecelui (ELISA) (BioVendor, Candler, NC) și nivelurile exogene evaluate utilizând un ELISA uman specific (BioVendor).

analize statistice.

Semnalizarea FGF21 este atenuată în ficat și WAT la șoareci obezi. Pentru a testa dacă semnalizarea FGF21 este afectată la șoarecii obezi, am evaluat fosforilarea ERK1/2 mediată de FGF21 în ficat (A) și WAT (B). Rezultatele de la fiecare Western blot sunt prezentate în fiecare caz, afișând atât forma fosforilată, cât și expresia totală ERK1/2. Deasupra fiecărei pete, densitometria este prezentată pentru toate regimurile experimentale și este calculată ca pERK/ERK total. Datele sunt afișate ca medie ± SE.

Inducerea expresiei genice timpurii imediat în aval de semnalizarea FGF21 este afectată la șoarecii obezi.

Inducerea expresiei genice timpurii imediat în aval de semnalizarea FGF21 este afectată la șoarecii obezi. Pentru a confirma dacă semnalizarea FGF21 este afectată la șoarecii obezi, am evaluat expresia genetică timpurie imediată în aval de ERK la șoarecii obezi și slabi. Ambele niveluri de mARN și proteine ​​au fost analizate în ficat (A) și WAT (B). Pentru fiecare țesut, creșterea pliului ARNm este afișată ca un grafic cu bare și un Western blot care prezintă expresia proteinei Egr1 prezentată mai jos. ARNm cFos este, de asemenea, prezentat în ficat (C) și WAT (D). Datele sunt mijloace ± SE.

Reducere afectată a glucozei circulante și a NEFA ca răspuns la administrarea de doze mici de FGF21 la șoareci obezi.

Administrarea de FGF21 duce la reducerea acută a glucozei circulante și a NEFA la șoareci. Pentru a vedea dacă acest răspuns este afectat la șoarecii obezi, am examinat efectul unei doze de 200 ng/g de FGF21 asupra acestor parametri. La această doză, FGF21 a redus nivelurile de glucoză circulante cu 17,4% la șoarecii slabi (Fig. 4A; soluție salină 164,4 ± 6,10 mg/dl; FGF21 135,8 ± 7,81 mg/dl; P = 0,0211). Deși a existat o ușoară reducere a șoarecilor obezi, aceasta nu a atins semnificația statistică (soluție salină 167,6 ± 10,58 mg/dl; FGF21 153,7 ± 4,98 mg/dl; P = NS). Deoarece capacitatea FGF21 de a reduce nivelurile de glucoză circulante se crede că se datorează, parțial, expresiei crescute a GLUT1 în țesutul adipos, am evaluat expresia ARNm GLUT1 în WAT a acestor șoareci (Fig. 4B). Deși a existat o mică inducție în expresia GLUT1 la șoarecii obezi (1,7 ori, P = 0,0048), răspunsul a fost mult mai proeminent la șoarecii slabi (2,8 ori, P = 0,0003).