Contribuție de Gail R. Martin, 12 mai 2006

celulelor

D. ‡ D.B. și B.D.Y. a contribuit în mod egal la această lucrare.

Abstract

Moartea celulară joacă un rol cheie atât în ​​stările de boală, cât și în dezvoltarea normală. Unul dintre cele mai vechi evenimente din embriogeneza șoarecilor, formarea cavității proamniotice, este un proces dependent de apoptoză (1). Până în prezent, se știe puțin despre mecanismele moleculare care reglează apoptoza normală la embrionul de mamifer. Inactivarea genelor individuale din calea caspazei, care sunt considerați efectorii principali ai morții celulare, nu pare să prevină decesele celulare normale în embriogeneza timpurie (2). În schimb, s-a raportat că inactivarea Pcdc8, gena care codifică factorul inducător de apoptoză (AIF), blochează cavitația în corpii embrioni (3), un model in vitro pentru formarea de cavități proamniotice (1). Aceste date au sugerat că funcția Aif este un mediator esențial al apoptozei normale în embriogeneza timpurie a șoarecelui.

AIF a fost identificat mai întâi ca o proteină mitocondrială care poate induce modificări caracteristice apoptozei în nucleele izolate. Șoarecele și genele umane Aif sunt legate de X și codifică proteine ​​foarte conservate, care împărtășesc o omologie semnificativă cu NADH-oxidoreductazele bacteriene. În celulele sănătoase, proteina AIF exprimată omniprezent este limitată la mitocondrii. Cu toate acestea, după tratamentul cu agenți care induc apoptoza, AIF poate fi găsit în citosol și nucleu (4). Pe baza acestor date și a altor date, s-a propus că AIF are o funcție de acceptor/donator de electroni (oxidoreductază) și o a doua funcție apoptogenă independentă (5). AIF are astfel caracteristici comune cu citocromul c, care este implicat în transferul de electroni între complexele lanțului respirator (RC) din mitocondrii și devine un efector al morții celulare după eliberarea în citosol de către stimuli apoptotici. Cu toate acestea, în timp ce se crede că citocromul c își exercită efectul apoptogen în citosol participând la activarea caspazelor călăului (6), AIF pare să-și exercite efectul apoptogen prin interacțiunea directă cu ADN (5), funcționând astfel printr-o caspază. cale independentă.

Ipoteza că AIF mediază moartea celulară la embrionul timpuriu nu a fost testată genetic până acum. Un efort inițial de a produce șoareci nul Aif prin direcționarea genelor nu a avut succes, deoarece celulele ES masculine care purtau o alelă nulă Aif pe cromozomul X unic nu au reușit să formeze șoareci himerici după injectarea în blastocisti gazdă. O explicație potențială pentru această observație este că prezența celulelor Aif -/Y ES incapabile să sufere apoptoză normală a împiedicat dezvoltarea embrionilor himerici (3). Aici, explorăm funcția Aif în embriogeneza normală utilizând Aif flox, o alelă nulă condițională Aif descrisă recent, în care exonul 7 este flancat de site-uri loxP. Prin urmare, recombinarea mediată de cre șterge nucleotidele 694 până la 778, perturbând astfel cadrul de citire (7). Datele noastre oferă dovezi că Aif nu este necesar pentru apoptoză în stadiile incipiente ale dezvoltării și, în schimb, este necesar pentru supraviețuirea celulei începând cu aproximativ ziua embrionară 9 (E9). Moartea celulară cauzată de pierderea funcției Aif a dus la un fenotip intrigant care a demonstrat că formarea modelului la șoarece poate avea loc independent de dimensiunea embrionului și numărul de celule.

Rezultate

Funcția AIF nu este necesară pentru apoptoză în corpurile embrionare sau embrionii timpurii ai șoarecilor.

Deși aceste date au lăsat deschisă posibilitatea ca capacitatea de cavitație să fie din cauza persistenței proteinei AIF materne produse în ovocit înainte de fertilizare, au sugerat cu tărie că funcția AIF nu este necesară pentru formarea cavității proamniotice în timpul embriogenezei. Pentru a explora această problemă în continuare, am căutat să determinăm dacă celulele ES derivate din blastocist AIF nule care au suferit dubluri de ≈20 pentru a dilua orice proteină AIF reziduală ar forma corpuri embrioide care au cavitat. Prin urmare, am stabilit noi linii celulare ES din descendența unei încrucișări între femelele Aif flox/flox sau Aif flox/+ și masculii β-Ac-cre Tg/Tg. Din 48 de blastocisti cultivați, am obținut 32 de linii celulare ES, dintre care 14 au purtat un cromozom Y. Jumătate din aceste linii celulare ES masculine au purtat alela AIF (nulă) recombinată și nu conțin proteine ​​AIF (Fig. 1 B și C și datele nu sunt prezentate). Rata de proliferare celulară a fost aceeași pentru toate liniile celulare Aif nule, heterozigote și sălbatice ES în timp ce acestea au fost stabilite și menținute ulterior în cultură (datele nu sunt prezentate).

Pentru a investiga dacă AIF este necesar pentru moartea normală a celulelor într-o etapă ulterioară a embriogenezei, am examinat embrionii nul Aif la aproximativ E8,5 [8-9 stadiu somit (som)] când embrionii normali prezintă moartea celulară la joncțiunea plăcii neuronale și ectodermul de suprafață în timpul închiderii tubului neural. Embrionii AIF nulați colectați în această etapă nu aveau proteine ​​AIF, așa cum se arată în analiza Western blot a embrionilor Aif nuli într-o etapă anterioară (0 som; Fig. 1 B și C) și nu se distinge morfologic de colegii lor de tip sălbatic. Am observat o distribuție similară a celulelor pozitive TUNEL în embrioni de tip sălbatic și Aif nul (Fig. 1 F - I), demonstrând că, în acest stadiu, moartea normală a celulelor apoptotice poate apărea în absența AIF.

Pierderea funcției AIF determină moartea celulară extinsă începând cu E9, dar modelarea embrionară este normală.

Până la E9, embrionii nul Aif s-au distins de colegii lor de tip sălbatic. Deși încă extrem de normal, dimensiunea creierului anterior și a somiților a fost ușor redusă (Fig. 2 A). Odată cu creșterea vârstei gestaționale, aceste diferențe au devenit mai pronunțate, iar embrionii nul Aif au fost semnificativ mai mici decât embrionii de tip sălbatic în același stadiu somit (Fig. 2 B - D). Până la aproximativ E11,5, puțini embrioni nul Aif examinați erau moribondi. Pentru a determina cauza diferenței de mărime, am colectat embrioni de tip somit AIF nulați și de tip sălbatic, i-am disociat și am determinat numărul total de celule pe embrion. Aif embrioni nuli la 20–21 som conțineau doar ≈1/3 la fel de multe celule ca și colegii lor de tip sălbatic. În următorii 10 soms (≈20 h), numărul total de celule din embrionii nul Aif a crescut cu doar ≈40%, comparativ cu ≈500% în colegii lor de tip sălbatic (Fig. 2 E). Inspecția vizuală a celulelor din embrioni disociați și analiza împrăștierii înainte au indicat faptul că celulele din embrionii mutanți au fost similare ca mărime (diametru) cu celulele normale (datele nu sunt prezentate). Astfel, dimensiunea redusă a embrionilor nul Aif pare a fi datorată în primul rând numărului mai mic de celule.

Numărul mediu de perechi de somite (± SD) de embrioni recoltați în diferite zile de gestație de la o cruce care produce atât embrioni nul, cât și embrioni de tip sălbatic

Pentru a determina de ce embrionii nul Aif nu au reușit să crească, am analizat încorporarea BrdU în diferite țesuturi la 20-25 som. Nu s-a detectat nicio diferență semnificativă în procentul de celule marcate între embrioni Aif nuli și embrioni de tip sălbatic (Tabelul 2), sugerând că o rată redusă de proliferare celulară nu a fost cauza principală a numărului scăzut de celule la embrioni Aif nuli. Cu toate acestea, testele pentru TUNEL la 24-25 som au arătat o moarte anormală celulară extinsă la embrioni nul Aif (Fig. 3 A și B). Aceste observații explică numărul total de celule reduse la embrioni nul Aif. Nu este clar de ce moartea anormală a celulelor nu a fost detectată la embrionii mutanți în stadiile anterioare ale somitei (de exemplu, 8-9 som; Fig. 1 H și I), chiar dacă Aif a fost inactivat în toate celulele de către stadiul cu 64 de celule și proteina AIF nu a fost detectat la 0 som (Fig. 1 C și datele nu sunt prezentate).

Procentul de celule BrdU-pozitive în secțiuni ale țesuturilor indicate de embrioni de tip sălbatic și Aif cu 20-25 de somite.

Pierderea funcției Aif determină moartea răspândită a celulelor embrionare. (A și B) Secțiuni coronale prin embrioni de tip sălbatic și Aif nuli la 24-25 som analizați pentru TUNEL (verde); nucleele au fost colorate cu DAPI (roșu). Diagrama arată nivelurile la care au fost luate aceste secțiuni. Pozițiile ochiului și otocistului sunt indicate în diagramă; locațiile lor în secțiuni adiacente celor prezentate au fost folosite ca repere în interpretarea planurilor secțiunii. Rețineți numărul mare de celule TUNEL-pozitive din creierul anterior, mezenchimul capului anterior și primul arc ramificat al embrionului nul Aif. BA1, primul arc branchial; BA2, al doilea arc ramificat; Hei, ochi; Fb, creierul anterior; Fg, foregut; Hb, creierul posterior; HM, mezenchim cap; Ot, otochist.

Pierderea funcției AIF afectează activitatea complexului mitocondrial RC I (CI) la embrionii din stadiul somitului timpuriu.

Pierderea funcției Aif afectează activitatea complexului RC I (CI). (A) Comparația activității RC CI la embrioni individuali la 7-13 soms. (B) Comparația raporturilor de activități ale diferitelor complexe RC în embrioni individuali, arătând că reducerea activității CI în embrioni individuali nu se datorează diferențelor în numărul de celule sau de mitocondrii. (C) Test imunoblot pentru proteinele respiratorii CI în lizatele embrionilor individuali la 9-10 som. Rețineți reducerea semnificativă a nivelurilor proteinelor 39-kDa și 30-kDa ale CI la embrioni nul Aif.

Pentru a evalua efectele pierderii funcției Aif asupra proteinelor complexului RC, am extras imunoblotate de embrioni individuali la 9-10 som. Nivelurile componentelor 39-kDa și 30-kDa ale CI au fost reduse semnificativ, iar componenta de 17 kDa a fost redusă modest în Aif nul în comparație cu embrionii de tip sălbatic. În schimb, componenta nucleului 2 al CIII nu a fost afectată (Fig. 4 C). Aceste date sunt în concordanță cu ipoteza că pierderea funcției Aif afectează activitatea RC mitocondrială prin scăderea nivelului de proteine ​​CI (7, 9).

Discuţie

Se crede că AIF are două funcții independente, una în cadrul mitocondriilor și alta în calitate de promotor al morții celulare după eliberarea sa din mitocondrii și translocarea în nucleu. Aici am analizat consecințele inactivării funcției Aif în stadiul de blastocist și am constatat că fenotipul principal este creșterea morții celulare. Observația noastră că activitatea mitocondrială RC CI a fost compromisă înainte de detectarea morții celulare extinse anormale sugerează că afectarea metabolismului energetic ar putea fi cauza fenotipului mutant nul. Metabolismul energetic anormal poate explica, de asemenea, incapacitatea celulelor Aif -/Y ES de a participa la formarea himerei (3). Interesant este că fenotipul nul Aif este considerabil mai ușor decât cel observat atunci când toată activitatea mitocondrială RC este inhibată, la fel ca în embrionii Tfam sau citocrom c nul, care sunt sever retardați de E8.5 (12, 13).

Datele noastre sunt în concordanță cu studiile care arată că moartea anormală a celulelor în cerebelul și retina postnatală la șoarecii care poartă mutația Harlequin (Hq) este cauzată de o reducere severă a funcției Aif. Moartea celulară la mutanții Hq a fost atribuită unui rol pentru AIF în controlul nivelurilor celulare de antioxidanți (14, 15). Cu toate acestea, creșterea markerilor stresului oxidativ și a altor efecte observate la mutanții Hq poate fi secundară respirației mitocondriale afectate, deoarece activitatea CI și expresia subunităților CI sunt reduse în creierul și retina Hq (9). Până în prezent, nu se știe cum funcționează AIF pentru a menține nivelul normal al activității RC CI și al proteinelor. AIF nu pare să facă parte din CI atunci când este izolat prin proceduri standard și nu afectează transcrierea subunităților CI (9).

Având în vedere problema confuză conform căreia pierderea funcției AIF determină moartea extinsă a celulelor la embrioni (Fig. 3 și Tabelul 2) și adulți (14, 15), astfel de studii pot necesita utilizarea unei mutații care codifică o proteină AIF care nu are apoptogenul presupus funcție, dar are în continuare funcția de metabolism energetic/funcție antioxidantă (10). Această abordare a fost utilizată recent pentru a demonstra că citocromul c, o proteină, de asemenea, presupusă a avea funcții independente în metabolismul energetic și ca promotor al morții celulare (6), este necesar pentru moartea celulară în unele țesuturi, dar numai târziu în embriogeneză (18) . Interesant este faptul că inactivarea Apaf1, caspazei 3 sau caspazei 9 previne, de asemenea, moartea celulară doar în unele țesuturi târziu în embriogeneză (2) și poate să nu aibă niciun efect asupra unor medii genetice (19, 20), lăsând deschisă întrebarea despre ce gene sau combinații de gene sunt necesare pentru a promova moartea celulară la embrionul timpuriu.

Metode

Genotipare și analiză fenotipică.

Genotipurile au fost determinate prin teste PCR folosind ADN extras din conuri ectoplacentale, saci gălbenușului, cozi sau celule ES ca șablon. Pentru alelele Aif, am folosit trei primeri: P1, 5'-TCCCAAACTTCCATTCGGATTTACT-3 '; P2, 5'-GAATCTGGAATATGGCACAGAGG-3 '; și P3, 5'-GTAGATCAGGTTGGCCAGAAACTC-3 '. Produsele de amplificare PCR au fost ≈500 bp (flox, P1 + P2), 350 bp (wild-type, P1 + P2) și 420 bp (Δex7, P2 + P3). Prezența transgenei β-Ac-cre a fost detectată folosind doi primeri: 5'-CGACCAGTGTTTGCCTTTTATGG-3 'și 5'-ATTCAACTTGCACCATGCC-3'. Embrionii pentru analize morfologice sau histologice au fost colectați în PBS rece, fixați în 4% paraformaldehidă și depozitați în 70% etanol la -20 ° C. Amiaza zilei când a fost detectat un dop vaginal a fost considerată aproximativ E0,5. Protocoalele standard au fost utilizate pentru hibridizarea și colorarea in situ a ARN-ului cu un anticorp al moleculei de adeziune a celulelor plachetare/endoteliale (553370; BD PharMingen). Numărul de celule pe embrion a fost determinat prin prepararea unei suspensii de celule unice din fiecare embrion așa cum este descris (24) și numărarea celulelor într-un hemacitometru. Pentru fiecare embrion, numărul celulei a fost determinat de două ori, iar datele au fost calculate în medie.

Testele de proliferare celulară și apoptoză.

Pentru testele de proliferare celulară, femelele însărcinate au fost injectate i.p. cu BrdU la 100 mg/kg greutate corporală, iar embrionii au fost colectați 1-2 ore mai târziu. Detectarea celulelor care au încorporat BrdU a fost efectuată pe secțiuni deparafinizate de 5 μm utilizând un kit de etichetare și detectare BrdU (Roche) cu următoarele modificări. Lamelele deparafinizate au fost tratate cu soluție de demascare a antigenului (Vector Laboratories), denaturate cu HCI 1 M și permeabilizate cu proteinază K înainte de incubarea cu anticorp. Diapozitivele au fost contracolorate cu Sytox Green (Invitrogen) și montate în mediu de montare Vectashield conținând DAPI (Vector Laboratories). Moartea celulară a fost detectată pe parafină de 5 μm tratată cu proteinază K sau secțiuni de vibratom de 100 μm conform instrucțiunilor din trusa de detectare a morții celulare in situ, Fluoresceina (Roche).

Izolare și cultură celulară ES.

Liniile celulare ES au fost izolate din blastocisti individuali în esență așa cum este descris (25), cu excepția faptului că înlocuitorul seric eliminat (nr. 10828 028; GIBCO) a fost înlocuit cu ser bovin (20% vol/vol) și mediu condiționat de celule CHO care exprimă LIF recombinant ( Institutul de Genetică, Cambridge, MA) a fost adăugat (10% vol/vol) la mediul de cultură. Odată stabilite, liniile celulare ES au fost menținute în stare nediferențiată prin subcultură frecventă pe celule de fibroblast de embrion de șoarece sau STO și s-a obținut dezvoltarea corpului embrionar așa cum este descris (1). Corpurile embrionare au fost colectate, încorporate în plastic, secționate la 10 μm și colorate cu Sytox Green.

Imunoblotarea.

Western blot a fost efectuat așa cum este descris (7) utilizând anticorpi la porțiunea C-terminală a AIF (AB16501; Chemicon), actină (A-2066; Sigma), citocrom c (PharMingen) și subunități RC CI 39 kDa, 30 kDa și 20 kDa (toate de la sonde moleculare).

Activități complexe RC.

Testele activităților enzimei RC au fost efectuate pe digonină (0,01%; greutate/vol) celule permeabilizate așa cum este descris (26). NADH chinon reductază sensibilă la rotenonă (CI; EC 1.6.5.3), succinat citocrom c reductază sensibilă la malonat (CII + CIII), citol crom c-reductază sensibilă la antimicină (CIII; EC 1.10.2.2) și citocrom c sensibil la cianură oxidaza (CIV; EC 1.9.3.1) au fost măsurate spectrofotometric folosind un spectrofotometru cu lungime de undă duală (DW-2000; SLM - Aminco, Urbana, IL) utilizând proceduri standard (27). Derivatul chinonic utilizat pentru măsurarea CIII a fost decilubiquinol. Toate măsurătorile au fost efectuate la 37 ° C. Nivelurile de proteine ​​au fost determinate prin metoda lui Bradford folosind BSA ca standard. Toate substanțele chimice au fost de calitate reactivă analitică de la Sigma.

Mulțumiri

Mulțumim lui Cori Bargmann, Bruce Edgar, Olivier Pourquie, Cliff Tabin și Patrick Tam pentru discuții iluminatoare; Christina Ahn, Prajakta Ghatpande și Ariana Nemati pentru asistență tehnică; și colegii noștri din laboratorul Martin pentru comentarii critice asupra manuscrisului. B.D.Y. este beneficiarul premiilor National Institutes of Health KO8 și American Skin Association. Această lucrare a fost susținută de granturi de cercetare de la Asociația Française împotriva Miopatiilor și a Uniunii Europene (proiectul EUMITOCOMBAT) (către P.B. și P.R.); Banca Națională a Austriei, Institutul de Biotehnologie Moleculară al Academiei Austriece de Științe și Uniunea Europeană (grantul Marie Curie de excelență) (către J.M.P.); Fundația pentru Cercetarea Diabetului Juvenil (către M.F.); și Institutul Național pentru Sănătatea Copilului și Dezvoltarea Umană (Grant R37-HD25331) (către G.R.M.).

Note de subsol

    ‡› Cui trebuie să i se adreseze corespondența. E-mail: gail.r.martinucsf.edu

Contribuțiile autorului: D.B., B.D.Y. și G.R.M. cercetare proiectată; D.B., B.D.Y., N.J., P.B., P.R. și G.R.M. cercetări efectuate; J.M. și M.F. a contribuit cu noi reactivi/instrumente analitice; D.B., B.D.Y., P.B., P.R. și G.R.M. date analizate; și P.R., J.M.P. și G.R.M. a scris ziarul.

Declarație privind conflictul de interese: nu s-au declarat conflicte.