Abstract

fundal

Hipercolesterolemia este un factor de risc important pentru dezvoltarea bolilor coronariene. Unii polifenoli dietetici, cum ar fi polifenolii din cafea (CPP), reduc nivelul colesterolului. Mecanismul acestui efect de scădere a colesterolului nu este pe deplin înțeles, deși sa raportat că 5-CQA, o componentă majoră a CPP, inhibă biosinteza colesterolului. Aici, am investigat mecanismul efectului de scădere a colesterolului CPP pe baza expresiei genei în ficat a metabolismului colesterolului. De asemenea, am examinat efectele CPP asupra acumulării de lipide vasculare la peștele zebră cu hipercolesterolemie indusă de dietă cu colesterol ridicat.

Metode

Peste 14 săptămâni, peștele zebră adult a fost hrănit cu o dietă de control, cu o dietă bogată în colesterol sau din aceasta din urmă, suplimentată cu CPP. Pentru a măsura gradul de acumulare a lipidelor vasculare, timp de 10 zile peștele zebră larvar (care sunt optic transparent) au fost hrăniți cu aceleași diete cu adăugarea unui ester colesteril fluorescent.

Rezultate

La peștii zebra adulți, pe lângă CPP la o dietă bogată în colesterol, a suprimat semnificativ creșterea nivelului de colesterol din plasmă și ficat observată atunci când peștii au ingerat aceeași dietă lipsită de CPP. Nivelurile de transcripție ale genelor hepatice hmgcra (codificând 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A reductază A, o enzimă care limitează rata în biosinteza colesterolului) și mtp (codificarea proteinei de transfer trigliceridic microsomal, o proteină de transfer lipidic necesară pentru asamblarea și secreția lipoproteinelor) a fost semnificativ mai mică la peștii hrăniți cu dietă care conține CPP decât la peștii hrăniți cu dieta cu colesterol ridicat nesuplimentată. În contrast, nivelul de expresie al genei ficatului cyp7a1a (codificarea polipeptidei 1a a citocromului P450 a subfamiliei A din familia 7, o enzimă care limitează rata pentru biosinteza acidului biliar) a crescut semnificativ la consumul dietei care conține CPP. La peștii larvați, acumularea de colesterol marcat fluorescent în artera caudală a fost mult redusă în dieta care conține CPP.

Concluzii

Ingerarea CPP a suprimat acumularea de colesterol în plasmă, ficat și sistemul vascular al peștilor zebră. Reglarea descendentă a sintezei colesterolului și lipoproteinelor și reglarea ascendentă a sintezei acidului biliar în ficat pot fi mecanismele fundamentale fundamentale prin care CPP își exercită efectele hipocolesterolemiante. Aportul de CPP poate ajuta la prevenirea și gestionarea hipercolesterolemiei la om și sunt necesare investigații suplimentare pe această linie, folosind o varietate de rate ale dozelor de CPP.

fundal

Boala cardiovasculară este principala cauză de morbiditate și mortalitate la nivel mondial. Hipercolesterolemia declanșează ateroscleroza și este un factor de risc major pentru dezvoltarea bolilor cardiovasculare. Mai multe studii epidemiologice au arătat în mod clar că nivelurile crescute de colesterol plasmatic - în special colesterolul cu lipoproteine ​​cu densitate mică (LDL) - sunt asociate cu dezvoltarea bolilor cardiovasculare [1, 2]. Important, hipercolesterolemia este un factor de risc modificabil. Modificările stilului de viață și ingestia diferiților compuși dietetici - cum ar fi ceaiul verde, sterolii din plante și proteinele din soia - pot reduce hipercolesterolemia [3].

La nivel mondial, cafeaua este una dintre băuturile cele mai consumate și este o sursă extrem de bogată de polifenoli biologic activi [4]. Preparatele din polifenol de cafea (CPP) sunt bogate în acizi cafeoilchinici (CQAs), acizi feruloilchinici (FQAs) și acizi dicaffeoylquinic (diCQAs). Activitățile fiziologice ale CPP includ reducerea dozei dependente a tensiunii arteriale, îmbunătățirea funcției endoteliale și suprimarea acumulării de grăsime corporală indusă de dietă și a hiperglicemiei postprandiale [5-10]. Recent, a fost raportată reducerea nivelului de colesterol de către CPP și 5-CQA (acid clorogenic) [9, 11-14]. Cu toate acestea, s-a raportat puțin despre mecanismul de acțiune al acestor substanțe: s-a raportat doar că 5-CQA inhibă biosinteza colesterolului [11, 14]. Niciunul dintre efectele posibile ale CPP asupra acumulării lipidelor vasculare - un pas important important în aterogeneză - nu a fost studiat.

Zebrafish (Danio rerio) organele și țesuturile sunt similare cu cele ale oamenilor atât în ​​structură, cât și în funcție. În consecință, peștele zebră este din ce în ce mai utilizat ca model al bolii umane, deoarece (a) peștele este ușor supus manipulării genetice; (b) se reproduce ușor în captivitate; și, (c) coloniile experimentale pot fi întreținute ieftin [15]. În plus, mai multe studii au descoperit că peștele zebră este un model excelent al metabolismului lipidelor vertebratelor [16, 17]. Stoletov și colab. [18] a arătat că peștele zebră hrănit cu o dietă bogată în colesterol a dezvoltat hipercolesterolemie, a prezentat o capacitate remarcabilă de oxidare a lipoproteinelor și a lipidelor vasculare acumulate. Ei au ajuns la concluzia că peștele zebră a fost un model adecvat în care să studieze evenimentele patologice importante în aterogeneză în stadiu incipient.

Aici, am investigat efectele ingestiei de CPP de către peștele zebră redus hipercolesterolemic prin consumul unei diete bogate în colesterol. Am măsurat nivelul colesterolului din plasmă și ficat, nivelurile de expresie ale genelor hepatice implicate în metabolismul colesterolului și gradul de acumulare a lipidelor vasculare. Am comparat datele din cohorte de pește de testare și de control.

Metode

Pregătirea CPP

CPP-urile au fost preparate prin extracție cu apă fierbinte din boabe de cafea prăjite, iar compoziția CPP a fost determinată prin analiza HPLC a extractului [9]. Conținutul total de polifenoli ai preparatului CPP a fost de 77,1% (g/g). Compozițiile individuale de polifenoli au fost (toate greutate/greutate): 7,7% 3-CQA; 15,5% 4-CQA; 31,9% 5-CQA; 7,6% 3- FQA; 5,6% 4-FQA; 8,5% 5-FQA; 9,0% 3,4-diCQA; 8,9% 3,5-diCQA; și 5,3% 4,5-diCQA. Pudra CPP nu conținea cofeină.

Animale

Peștele zebră adult a fost achiziționat de la un furnizor local de animale de companie (Meito Suien Co., Ltd., Remix, Nagoya, Japonia). Toți peștii au fost crescuți și întreținuți la un ciclu de lumină: întuneric de 14: 10 ore la 28 ° C, iar calitatea apei a fost menținută așa cum este descris în Cartea Zebrafish[19]. Toți peștii au fost manipulați în strictă conformitate cu liniile directoare ale Comitetului pentru îngrijirea animalelor din Kao Corporation, Cartea Zebrafish, si Ghid pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator (Ediția a 8-a) [20].

Dietele

Dieta de control conținea 75% (greutate/greutate) standard de pește zebră (Otohime B2; Marubeni Nisshin Feed Co. Ltd., Tokyo, Japonia) și 25% (greutate) gluten (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japonia). Dieta bogată în colesterol a fost dieta de control cu ​​adăugarea de 4% (g/g) colesterol (Wako Pure Chemical Industries). „Dieta CPP” a fost dieta de control, cu adăugarea atât a colesterolului de 4% (greutate/greutate), cât și a 5% (greutate/greutate) CPP. Pentru a măsura conținutul de colesterol al chow-ului Otohime B2, lipidele au fost extrase utilizând metoda convențională Folch [21]. Conținutul de colesterol din dieta de control înainte de adăugarea de colesterol a fost de 0,4% (g/g).

Proiectare experimentală

Experimentul 1: Peștele zebră de sex feminin la 6 luni după fecundare a fost cântărit sub anestezie cu 0,005% (greutate/volum) tricaină (Sigma-Aldrich, MO, SUA) și repartizat la trei grupe de 7 sau 8 pești cu greutăți corporale similare. Fiecare grup a fost plasat într-un rezervor de 1,7 L. Cele trei grupuri au fost hrănite cu control, cu colesterol ridicat sau cu dieta CPP de două ori pe zi (20 mg de alimente/zi pe pește) timp de 14 săptămâni. În timpul hrănirii, fluxul de apă în rezervoare a fost întrerupt timp de 45 de minute, iar peștii au fost lăsați să-și consume dieta timp de 30 de minute. În ultima zi a experimentului, toți peștii au fost eutanasiați, au fost măsurate greutățile corporale și s-au prelevat probe de sânge din fiecare arteră caudală (în capilare de sticlă heparinizate) și hepatici disecați. Probele din fiecare ficat au fost stocate în duplicat pentru analiza nivelurilor de lipide și a modelelor de expresie a ARNm.

Analiza nivelurilor plasmatice și lipidice hepatice

Plasma a fost obținută prin centrifugarea probelor de sânge la 1500g timp de 5 minute la 4 ° C. Lipidele hepatice au fost extrase utilizând metoda convențională Folch [21]. Nivelurile de colesterol din plasmă și ficat au fost determinate enzimatic cu seturile de testare a colesterolului E (Wako Pure Chemical Industries, Ltd).

Extracția ARN și PCR cantitativă în timp real

ARN-ul total a fost extras din probele de ficat ale peștilor din Experimentul 1 folosind Mini-Kituri de țesut lipidic RNeasy (Qiagen KK, Tokyo, Japonia) și a fost transcris în ADNc utilizând un ARN de înaltă capacitate-ADNc (Applied Biosystems, CA, STATELE UNITE ALE AMERICII). PCR cantitativă în timp real a fost efectuată pe o platformă ABI PRISM (Applied Biosystems); analiza probelor de ADNc a folosit TaqMan Fast Universal PCR Master Mix. Testele TaqMan au explorat nivelurile de expresie ale următoarelor gene: eef1a1l1 (factorul de alungire a traducerii eucariote 1 alfa 1, ca 1; Dr03432748_m1); hmgcra (3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A reductaza A; Dr03428716_m1); mtp (proteină de transfer trigliceridă microsomală; Dr03133293_m1); și cyp7a1a (polipeptida 1a a subfamiliei A din familia 7 a citocromului P450; Dr03177268_s1). Fiecare nivel de bază și nivel de prag au fost setate manual în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Nivelurile relative de expresie a ARNm au fost determinate utilizând nivelul de expresie al eef1a1l1 ca standard intern.

analize statistice

Toate datele sunt afișate ca mijloace ± SE (eroare standard). Semnificația diferențelor observate a fost evaluată prin analiza varianței urmată de aplicarea comparației multiple a diferenței parțiale a celor mai mici pătrate a lui Fisher. O diferență a fost considerată a fi semnificativă dacă este comparativă P-valoarea a fost

Rezultate

Aportul alimentar și greutatea corporală a peștilor zebra adulți

Aportul de alimente în experimentul 1 a fost estimat prin observare zilnică. În perioada experimentală, toți peștii au consumat fiecare dietă complet (20 mg de alimente/zi pe pește). Greutatea corporală a crescut semnificativ (P figura 1

exercită

Nivelurile de plasmă și colesterol hepatic la adulți

Am examinat nivelul colesterolului plasmatic și hepatic la sfârșitul experimentului 1. Nivelul colesterolului plasmatic a fost semnificativ mai mare (P Figura 2

Exprimarea ARNm în ficatul peștilor zebra adulți

Într-un efort de a defini mecanismul prin care CPP-urile și-au exercitat efectele anti-hipercolesterolemice, am măsurat nivelurile de expresie a ARNm ale genelor asociate cu metabolismul colesterolului în ficat. Nivelurile de ARNm transcrise din hmgcra și mtp au fost semnificativ mai mici (P Figura 3

Acumularea colesterolului vascular în peștele zebră larvar

Am explorat efectul suplimentării dietetice cu CPP asupra gradului de acumulare a colesterolului vascular în arterele caudale ale larvelor optic transparente de zebră. Sunt prezentate imagini optice și fluorescente (Figura 4A și respectiv B). Colesterolul marcat cu un marker fluorescent acumulat în artera caudală (săgeți din figura 4B). Figura 4C prezintă imagini de fluorescență de la trunchi la coadă (inclusiv artera caudală) a peștilor din fiecare grup dietetic. Nivelul de fluorescență al colesterolului marcat cu un marker fluorescent al arterei caudale a fost semnificativ mai mare (P Figura 4

Discuţie

Am explorat dacă suplimentarea unei diete cu conținut ridicat de colesterol cu ​​CPP ar atenua efectul hipocolesterolemiant al fostei diete la peștele zebră. Adăugarea de CPP la dieta bogată în colesterol a suprimat creșterea nivelului de colesterol plasmatic indusă de dieta nesuplimentată. Cho et al. [11] și Wan și colab. [12] a raportat că, în plus față de 5-CQA, o componentă majoră a CPP, dietele bogate în grăsimi sau cu conținut ridicat de colesterol au suprimat creșterile nivelurilor de colesterol plasmatic observate în mod normal atunci când astfel de diete nesuplimentate au fost hrănite rozătoarelor. În studiul nostru, 5-CQA a constituit 31,9% (g/g) din CPP-urile adăugate; 5-CQA a fost astfel principalul polifenol prezent. Rezultatele noastre sugerează că CPP-urile dietetice scad nivelul colesterolului plasmatic, parțial deoarece CPP-urile au niveluri ridicate de 5-CQA. În plus, am constatat că suplimentarea cu CPP a suprimat creșterea nivelului de colesterol hepatic declanșat de ingestia unei diete bogate în colesterol. Murase și colab. [9] au constatat, de asemenea, că CPP-urile au suprimat acumularea de colesterol hepatic la șoarecii hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi. Împreună, datele sugerează că CPP exercită un efect hipocolesterolemiant prin influențarea metabolismului colesterolului în ficat. CPP-urile ingerate în alimente sau băuturi (cafea) pot fi utile în prevenirea și gestionarea hipercolesterolemiei.

Cho et al. [11], citat mai sus, a arătat că efectele hipocolesterolemiante ale 5-CQA ar putea fi atribuite unei scăderi a activității enzimatice HMGCR în ficatul rozătorilor. O astfel de reglare descendentă a activității, atribuibilă unei scăderi a nivelului transcripției ARNm din Hmgcr, S-a sugerat că este mecanismul fundamental prin care polifenolii dietetici epigalocatechin-3-galat, resveratrol, curcumină și hesperetină exercită efecte hipocolesterolemiante [28-33]. Deși relațiile structură - activitate ale acestor polifenoli rămân slab înțelese, datele acumulate ne încurajează să speculăm că compușii polifenolici reglează hepaticul Hmgcr expresia și astfel nivelurile HMGCR. Dacă este așa, reducerea normelor hepatice hmgcra expresia la suplimentarea alimentară CPP poate fi atribuită nu numai acțiunii 5-CQA, ci și activităților altor CPP.

Creșterea arterei caudale a acumulării unei forme fluorescente de colesterol la peștii hrăniți cu o dietă bogată în colesterol a fost inhibată de ingestia concomitentă de CPP. Fang și colab. [34] au constatat că, atunci când peștii zebra larvați au fost hrăniți cu o dietă bogată în colesterol timp de doar 2 săptămâni, nivelurile anumitor esteri colesteril oxidați, identici cu cei prezenți în LDL minim oxidați ai oamenilor și în leziunile aterosclerotice murine, au crescut de până la 70 de ori. La mamifere, hipercolesterolemia crește nivelul plasmatic al LDL-urilor oxidate și al peroxizilor lipidici, facilitând la rândul său aderența monocitelor și limfocitelor la endoteliul vascular [35, 36]. În special, acidul clorogenic poate inhiba oxidarea LDL umană indusă de cupru in vitro [37]. Chang și colab. [38] a constatat că acidul clorogenic a suprimat expresia moleculei de adeziune indusă de IL-1β și a indus producția de specii reactive de oxigen. Prin urmare, suprimarea observată a acumulării de colesterol fluorescent în artera caudală la suplimentarea alimentară cu CPP poate fi atribuită inhibării, de către componentele CPP, a oxidării colesterolului sau lipoproteinelor (sau ambelor) și reducerii exprimării moleculelor de aderență ale endoteliului vascular.

Am arătat aici că CPP-urile exercită efecte hipocolesterolemiante și inhibă acumularea de colesterol în vasele de sânge. Cu toate acestea, efectele ingestiei de cafea asupra hipercolesterolemiei și a bolilor cardiovasculare rămân controversate [39, 40]. Deși cafeaua este bogată în CPP, cafeaua conține mai mulți alți compuși potențial bioactivi, inclusiv cafeină, vitamina B3, magneziu, potasiu, materiale fibroase și hidroxihidrochinonă [40, 41]. Acest ultim compus, care este un generator de specii reactive de oxigen, compromite îmbunătățirile induse de acidul clorogenic ale tensiunii arteriale și ale funcției endoteliale [42]. Sunt necesare studii suplimentare pentru a defini compușii de cafea care exercită efecte benefice sau dăunătoare asupra metabolismului colesterolului și a sistemului endotelial vascular.

Concluzii

Am arătat aici că ingestia de CPP de peștele zebră hipercolesterolemic a suprimat acumularea de colesterol în plasmă, ficat și sistemul vascular prin reglarea descendentă a sintezei colesterolului și lipoproteinelor și reglarea ascendentă a sintezei acizilor biliari. Rezultatele noastre sugerează că CPP-urile pot preveni dezvoltarea hipercolesterolemiei la om și că ingestia de CPP poate ajuta la gestionarea acestei afecțiuni.

Informațiile autorilor

Shinichi Meguro, dr., Este cercetător principal principal în cercetare și dezvoltare - Cercetare în științe biologice la Kao Corporation. Dr. Obiectivul cercetării Meguro este metabolismul lipidic, nutriția și știința sănătății.

Takahiro Hasumura este om de știință în cercetare și cercetare - Cercetare în științe biologice la Kao Corporation. Domnul. Centrul de cercetare al Hasumura este știința sănătății.

Tadashi Hase DVM este vicepreședinte responsabil cu cercetarea și cercetarea - cercetarea științelor biologice la Kao Corporation. Dr. Centrul de cercetare al lui Hase este metabolismul lipidic, nutriția și știința sănătății.