Daria I. Melnikova

1 А.В. Centrul Național Științific Zhirmunsky de Biologie Marină, Filiala Orientului Îndepărtat, Academia Rusă de Științe, Vladivostok 690041, Rusia; ur.ovd.bmi@avokinlemd (D.I.M.); ur.ovd.bmi@oknesalva (A.E.V.)

Anna E. Vlasenko

1 А.В. Centrul Național Științific Zhirmunsky de Biologie Marină, Filiala Orientului Îndepărtat, Academia Rusă de Științe, Vladivostok 690041, Rusia; ur.ovd.bmi@avokinlemd (D.I.M.); ur.ovd.bmi@oknesalva (A.E.V.)

Timur Yu. Магарламов

1 А.В. Centrul Național Științific Zhirmunsky de Biologie Marină, Filiala Orientului Îndepărtat, Academia Rusă de Științe, Vladivostok 690041, Rusia; ur.ovd.bmi@avokinlemd (D.I.M.); ur.ovd.bmi@oknesalva (A.E.V.)

2 Școala de biomedicină, Universitatea Federală din Orientul Îndepărtat, Vladivostok 690090, Rusia

Abstract

Pentru prima dată, tetrodotoxina (TTX) a fost detectată într-o tulpină bacteriană după cinci ani de cultivare în condiții de laborator de la izolarea sa de gazda animalului. O metodă fiabilă potrivită pentru probe bacteriene, cromatografie lichidă de înaltă performanță cu spectrometrie de masă tandem, a fost utilizată pentru detectarea toxinei în culturi de spori și vegetative de Bacillus sp. 1839. TTX a fost detectat într-o cultură de spori a tulpinii.

1. Introducere

Tetrodotoxina (TTX), fiind una dintre cele mai renumite neurotoxine cu greutate moleculară mică, capabile să blocheze canalele de sodiu cu tensiune în țesuturile nervoase și musculare, a fost găsită într-o mare varietate de organisme marine și terestre și sedimente marine și de apă dulce [1]. Originea sa în organisme și ecosisteme este încă o problemă controversată, dar descoperirea a numeroase tulpini bacteriene capabile să producă TTX izolate din sursele menționate mai sus indică legătura dintre apariția bacteriilor și a toxinei. Existența unei tulpini bacteriene dovedită a produce TTX independent de organismul gazdă poate facilita dramatic descoperirea căilor încă necunoscute ale biosintezei TTX. Cu toate acestea, una dintre principalele preocupări asociate cu bacteriile producătoare de TTX este incapacitatea celor mai multe bacterii găsite de a produce toxine prin cultivare îndelungată sau chiar după mai multe treceri [2]. O altă întrebare importantă este metoda de detectare TTX. În ciuda diferitelor abordări metodologice bazate pe specificitatea antigenului, efectul neurotoxic sau proprietățile fizico-chimice ale toxinei utilizate de cercetările din studiile cu bacterii, numai cromatografia lichidă cu spectrometrie de masă tandem ar putea fi considerată cea mai specifică și de încredere până în prezent [1].

Grupul nostru de cercetare a lucrat pe problema distribuției TTX în ecosistemele marine, cu un accent deosebit pe screeningul producătorilor de bacterii TTX timp de câțiva ani. Căutarea bacteriilor producătoare de TTX în viermele cu panglică toxică Cephalothrix simula folosind TTX folosind microscopie confocală cu scanare laser cu anticorpi policlonali anti-TTX, desfășurată în 2014, a dezvăluit o etichetare TTX-pozitivă în celulele bacteriene ale tulpinii Bacillus [3]. Investigație detaliată a Bacillus sp. tulpina 1839 utilizând microscopie imunoelectronică cu anticorpi anti-TTX a arătat o asociere strictă a marcării TTX cu endospori și spori liberi de bacterii [4]. Investigații suplimentare privind ciclul de viață [5] și condițiile de sporulare [6] au arătat că tulpina a fost TTX-pozitivă chiar și după numeroase pasaje timp de trei ani de la descoperirea sa, care, în combinație cu sinteza TTX asociată cu sporii, o face unică printre altele Bacterii producătoare de TTX. Acest lucru indică importanța confirmării producției TTX de către Bacillus sp. 1839 prin metode mai fiabile de detectare a toxinelor.

Cercetările actuale sunt primul raport al sintezei TTX de către bacterii după cinci ani de la izolare. TTX a fost dezvăluit în cultura de spori a Bacillus sp. tulpina 1839 folosind cromatografie lichidă de înaltă performanță cu spectrometrie de masă tandem (HPLC-MS/MS).

2. Rezultate

Ca rezultat al analizei HPLC-MS/MS a sporului și a culturii vegetative a Bacillus sp. 1839, TTX a fost detectat (Figura 1 A, Tabelul 1). Toxina a fost găsită numai în cultura de spori a tulpinii. Spectrul de fragmentare MS/MS al Bacillus sp. Extractul din cultura de spori din 1839 a prezentat fragmente caracteristice de ioni de precursor TTX (M + H) + m/z 320: (M + H-H2O) + la m/z 302 și (M + H-C3H7O6) + la m/z 162 Figura 1 B).

stabilă

(A) Cromatografie lichidă de înaltă performanță cu cromatograme de spectrometrie de masă tandem (HPLC-MS/MS) ale standardului de tetrodotoxină (TTX) și Bacillus sp. 1839 extract de cultură de spori; (B) Spectrele MS/MS ale standardului TTX și Bacillus sp. 1839 extract de cultură de spori. Ca standard pentru TTX, a fost utilizată o soluție comercială TTX (CTTX = 1 ng/mL).

tabelul 1

Concentrația TTX în Bacillus sp. 1839 culturi de celule vegetative și de spori.

Bacillus sp. 1839 CultureToxin SumaTTX
Cultură de celule vegetativeng/ml de extract-
ng/L de pelete-
Cultură de celule sporeng/ml de extract0,751
ng/L de pelete30.04

În cultura de spori a vârfului de tulpină cu timpul de retenție (Rt) 5,66 min și s-au găsit tranzițiile MRM 272,10> 254,10 și 272,10> 162,10, probabil legate de 5,6,11-trideoxiTTX. Cu toate acestea, concentrația sa a fost mai mică decât LoQ (limita de cuantificare,> KF444411-KF444416) a fost obținută din Colecția de bacterii heterotrofe marine, A.V. Centrul Național Științific Zhirmunsky de Biologie Marină, Filiala Orientului Îndepărtat a Academiei de Științe din Rusia. Plăcile cu DifcoTM Marine Agar 2216 (BD, SUA) (pH 7,6) au fost utilizate pentru cultivarea bacteriilor. Pentru a obține o cultură de celule vegetative, bacteriile au fost incubate la 23 ° C timp de 2 zile. Cultura celulară îmbogățită de spori a fost obținută prin incubare la 23 ° C timp de 7 zile până când conținutul de spori a depășit 50%.

Metoda modificată Abbott a fost utilizată pentru a dezvălui sporii [18]; frotiul a fost colorat cu soluție de albastru de metilen (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA) cu 1% NaOH și apoi contracolorat cu roșu neutru (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA). Probele au fost examinate la microscopul cu lumină Olympus IX83 (Japonia). Bacteriile au fost recoltate prin adăugarea unei soluții fizice sterile la fiecare placă de agar și răzuirea biomasei folosind un împrăștiere în formă de L, cu centrifugare ulterioară (14.000 × g, 20 min, 4 ° C) și îndepărtarea supernatantului. Peleta rezultată a fost depozitată la -20 ° C până la investigații suplimentare.

4.2. Izolarea și purificarea toxinelor

Extractele au fost preparate utilizând următoarea procedură: peleta bacteriană a fost omogenizată în soluție de acid acetic 1% 1:10 (vol/vol) timp de 10 min folosind omogenizatorul FastPrep-24 ™ (MP Biomedicals, SUA) (4,5-5,5M, 10 cicluri, 60 sec fiecare); suspensia rezultată a fost centrifugată (14.000 × g, 30 min, 4 ° C) și supernatantul a fost luat; peleta a fost spălată de două ori cu soluție de acid acetic 1%, centrifugată, și supernatantul a fost scos și combinat. Curățarea extractului a fost efectuată cu cartușul SPE, Chromafix C18 ec (S) (Macherey-Nagel GmbH & Co., Germania). Extractul a fost aspirat prin coloană, coloana a fost spălată cu acid acetic 1% (0,5 vol de probă), apoi filtratele au fost reunite. Pentru a elimina proteinele, extractul a fost încălzit timp de 5 min la 95 ° C și centrifugat (14.000 × g, 20 min, 4 ° C), supernatantul final a fost depozitat la -20 ° C până la investigații suplimentare.

Purificarea toxinelor a fost efectuată folosind o coloană de cărbune activat în conformitate cu următorul protocol: 100 mL de cărbune activ (Sigma-Aldrich, SUA) au fost introduse în turbo-centriconii Vivaspin cu o limită moleculară de 300 kDa (Sartorius, Germania) și echilibrată cu apă. Un total de 5 ml de extract bacterian a fost pus pe coloană, cărbunele a fost resuspendat, amestecul a fost incubat timp de 5 minute la temperatura camerei și centrifugat la 700 × g timp de 5 minute. Apoi coloana a fost spălată de două ori cu 5 ml de apă distilată. Pentru eluarea toxinelor, cărbunele din coloană a fost resuspendat cu 1 ml de acid acetic 1% în etanol 20%, incubat timp de 5 minute la temperatura camerei și centrifugat; acest pas a fost repetat de zece ori. Procedeul de purificare a toxinelor a fost repetat până când întregul extract a fost tratat. Eluații au fost grupați și s-au evaporat la sec în vid. Precipitatele rezultate au fost dizolvate într-o soluție apoasă de acid acetic 0,1% într-un raport de 50 µL per 1 ml de peletă bacteriană și analizate pentru TTX și prezența analogilor săi prin HPLC-MS/MS (analiza HPLC-MS/MS a fost efectuată în școală of Biomedicine of Far Eastern Federal University) conform procedurii lui Bane și colab. [19] cu modificări (vezi mai jos).

4.3. Identificarea toxinelor prin HPLC-MS/MS

Contribuțiile autorului

Conceptualizare și proiectare studiu, T.Y.M.; pregătirea probelor și microbiologia, D.I.M.; Analiza HPLC-MS/MS și cuantificarea toxinei, A.E.V.; toți autorii au contribuit la scrierea și editarea manuscrisului.

Finanțarea

Această cercetare a fost finanțată de Fundația Rusă pentru Cercetare de Bază (RFBR), Grant nr. 18-04-00808 A.