• Găsiți acest autor pe Google Scholar
  • Găsiți acest autor pe PubMed
  • Căutați acest autor pe acest site
  • Record ORCID pentru Oliver Ingvar Wagner
  • Pentru corespondență: [email protected]

Abstract

Introducere

Rezultate

Interacțiuni funcționale și genetice între UNC-104, SYD-2 și PTP-3

(A-E) PTP-3B: CFP și GFP: SYD-2 colocalizare în inele nervoase (A-D) și corzi nervoase ventrale (E). (D) Imagine PDM pseudo-colorată (vezi Materiale și metode) indicând o colocalizare cuantificabilă între SYD-2 și PTP-3B în inelul nervos. (F) Cuantificarea ICQ a datelor prezentate în (C). (G) Semnal pozitiv PTP-3B/SYD-2 BiFC în inelul nervos al viermilor vii, indicând faptul că SYD-2 și PTP-3B sunt cel puțin 7-10 nm apropiați unul de celălalt. (H) Vierme care exprimă SNB-1: mRFP sub un promotor pan-neuronal. (I) Imagine combinată din (G) și (H). (J) Stive de VNC îndreptate (corzi nervoase ventrale) și neuroni ALM cu semnale PFC-3B/SYD-2 BiFC pozitive. * - indică localizarea somas în neuronii ALM. Barele la scară: 10 µm. N = 10 viermi în (F). Bara de eroare: ± max. și min. gamă. A - direcția anterioară și P - direcția posterioară.

ptp-3

Lipsa PTP-3B declanșează stări desfășurate crescute ale SYD-2

Deoarece SYD-2 există în stări pliate funcționale, propunem că plierea intramoleculară a SYD-2 afectează tendințele sale de legare la UNC-104. După cum s-a menționat mai sus, presupunem că la mutanții ptp-3 defosforilarea diminuată a SYD-2 la Y741 ar duce la creșterea stărilor desfășurate care ar spori interacțiunile sale cu UNC-104. Pentru a aborda această întrebare, am folosit teste FRET intramoleculare [39] așa cum este descris în Figura 3A. Din Figura 3B și C este evident că raportul FRET (IFRET/ID) al fuziunii Cypet: SYD-2: Ypet este redus semnificativ în mutanții ptp-3 (mu256), indicând faptul că stările desfăcute ale SYD-2 sunt mai pronunțată în absența PTP-3. În mod critic, dărâmarea genei ptp-3 folosind ARNi a condus la observații comparabile (Fig. 3C; Supliment. Fig. 3). Ca control, am proiectat un mutant SYD-2 non-fosforilabil Y741F și raporturile sale FRET sunt comparabile cu cele ale Cypet: SYD-2: Ypet exprimate la animale de tip sălbatic N2. Mai mult, o construcție SYD-2 Y741E cu fosfomimizare a condus la rapoarte FRET comparabile cu cele ale constructului Cypet: SYD-2: Ypet nemodificat exprimat în mutanți ptp-3 (mu256) (Fig. 3B + C). Aceste descoperiri demonstrează că SYD-2 apare într-o conformație deschisă mai pronunțată în absența PTP-3 și că acest mecanism este probabil o funcție a activității fosfatazei PTP-3 pe tirozină 741 din SYD-2.

(A) acumulări UNC-104 și modele de distribuție în segmente îndreptate de neuroni sub-laterali preluați de la viermi diferiți dintr-o populație și stivuite unul pe altul. (B) Dimensiunile clusterului UNC-104 în neuronii sub-laterali. (C) densitățile UNC-104 de-a lungul neuronilor sub-laterali. Bara de scalare: 10 µm. Graficul cutiei cu bare mediane și de eroare: ± max. și min. gamă. ANOVA unidirecțional cu test de comparație multiplu LSD Fisher. **** p 750 de evenimente. Parcele de cutii cu bare mediane și de eroare: ± max. și min. gamă. ANOVA unidirecțional cu testul de comparație multiplu LSD Fisher pentru UNC-104 în tulpini mutante și testul t cu corecția lui Welch pentru RNAi și SNB-1. **** p "rel =" gallery-fragment-images-1283311614 "data-figure-caption ="

Rezumat pictural al rezultatelor acestui studiu. PTP-3 este în amonte de SYD-2 care reglementează activitatea UNC-104. PTP-3 defosforilează SYD-2 în poziția Y741 rezultând plierea intramoleculară a SYD-2 care inactivează concomitent UNC-104. Viceversa, lipsa PTP-3 are ca rezultat configurații mai deschise ale SYD-2, rezultând o interacțiune sporită cu UNC-104 [3] promovând schele UNC-104 crescute de-a lungul axonului și activând UNC-104 cu viteze vizibil crescute. Cu toate acestea, STV-urile se acumulează în soma datorită expresiei reduse a syd-2 și unc-104 la mutanții ptp-3.

Materiale și metode

Constructe plasmidice și tulpini C. elegans

Tulpina mutantă ZM607 syd-2 (ok217) poartă o ștergere a majorității domeniilor CC N-terminale din gena syd-2 ducând la o mutație nulă [2]. Această ștergere a fost confirmată prin PCR utilizând următorul exemplu de set: CGCGGGAATTATGCCTATTA (înainte) și TTGCATCTGCAAAAGAAACG (invers). Tulpina mutantă RB633 ptp-3 (ok244) poartă o ștergere a trei domenii FN3 ducând la o schimbare de cadru și la terminarea prematură a izoformei PTP-3A. Ștergerea a fost confirmată prin PCR utilizând următorul set de exemple: ACCCAAACGTTACCGAACAG (înainte) și CCAGGGACTGCAGGAAAATA (invers). Tulpina mutantă CZ3761 ptp-3 (mu256) se caracterizează printr-o inserție a unui singur nucleotid în exonul 25 al genei ptp-3 rezultând o schimbare de cadru care duce la o oprire prematură la AA1777 (Sup. Fig. 1) [23]. Această inserție de nucleotidă unică a fost confirmată prin secvențiere și, în plus, s-a găsit o mutație de la G la T (rezultând codificarea aceleiași mutații de aminoacid - leucină), patru nucleotide în amonte de inserția menționată mai sus. Cu toate acestea, inserția unui singur nucleotid ar trebui să conducă la o oprire prematură care să ducă la o mutație nulă, așa cum este descris în [23]. Rețineți că viermii mutanți ptp-3 (mu256) au dezvăluit fenotipuri ușoare de retenție a ouălor (Sup. Fig. 2).

Microinjecția plasmidelor C. elegans

Tehnica de microinjecție descrisă în [60] a fost utilizată cu modificarea faptului că fie viermii în stadiu L4, fie cei mai mulți viermi adulți tineri au fost microinjectați. Pe scurt, viermii imobilizați (pe tampon de 2,5% agaroză scufundat într-o picătură mică de ulei mineral (Sigma, M5904)) au fost microinjectați utilizând funcția DIC a unui microscop Olympus IX81 echipat cu un micromanipulator controlat de un Eppendorf Femtojet express. Viermii au fost recuperați folosind tampon de recuperare sau tampon S și apoi plasați pe plăci NGM. Generațiile F1 au fost selectate pentru gene transgenice și menținute separat pentru a clona o linie stabilă la 20 ° C.

PCR în timp real

ARN Messenger a fost izolat din lizatele viermilor tineri adulți folosind reactiv TRIzol (Invitrogen) după transcriere inversă utilizând sistemul SuperScript First-Strand Synthesis (Invitrogen). Setul de primer folosit pentru qPCR al genei unc-104 a fost: GAAGGAAATAAAGCGAGAAC (înainte) și CTGCCAAATCAACCAAAG (invers) și setul de primer pentru gena syd-2 a fost: CGGAACAATACTCGACTTC (înainte) și GCCACACGGCTCCATT (invers). Controlul intern pentru qPCR a fost gena cdc-42 așa cum este descris de [61] și un set de exemple a fost: CTGCTGGACAGGAAGATTACG (înainte) și TCGGACATTCTCGAATGAAG (invers). ABI Power SYBR Green PCR Master Mix (ABI, SUA) a fost utilizat împreună cu o mașină PCR model ABI StepOne Plus PCR în timp real (Applied Biosystems). Experimentul a fost repetat de 3 ori și testul t Student nepereche a fost folosit pentru a compara grupurile de studiu.

Testele de co-imunoprecipitare

Analiza colocalizării și teste BiFC

Pentru analiza colocalizării (Fig. 2), imaginile au fost colectate de la viermi vii folosind un microscop confocal cu scanare laser Zeiss LSM 780 inversat. Valorile ICQ au fost apoi calculate dintr-o regiune de interes folosind pluginul ImageJ „Intensity Correlation Analysis” după scăderea fundalului utilizând pluginul „ROI”. Valorile ICQ variază între -0,5 până la +0,5, cu valori către +0,5 reprezentând doi fluorofori cu modele de expresie dependente și valori apropiate de -0,5 reprezentând fluorofori care prezintă modele de expresie segregate, în timp ce 0 reprezintă expresia aleatorie. În plus față de valorile ICQ, prezentăm imagini PDM bazate pe: Produsul diferențelor față de medie = (intensitate cian - intensitate medie cian) X (intensitate verde - intensitate medie verde).

Testul BiFC (complementarea fluorescenței bimoleculare) este un instrument puternic pentru a înțelege dacă două proteine ​​se află în imediata apropiere pentru interacțiuni funcționale presupuse în celule. Pe scurt, o proteină YFP (Venus) este împărțită în două jumătăți (Venus V-N-terminal și Venus V-C-terminal) și etichetată la cele două proteine ​​de test. Complementarea lui Venus va duce la un semnal fluorescent dacă cele două proteine ​​testate sunt cel puțin 7-10 nm apropiate una de alta [38, 62]. În acest studiu am proiectat fuziuni de PTP-3B: VC155 și VN173: SYD-2 (Fig. 2).

Knockdown RNAi

Interferența ARN a fost efectuată prin hrănirea viermilor cu tulpini bacteriene care exprimă dsARN pentru o anumită genă de interes (metoda de hrănire RNAi de [63]). Clonele de hrănire RNAi au fost obținute din biblioteca de hrănire RNAi de C. elegans a lui Julie Ahringer (Source BioScience LifeScience, SUA; furnizată de C. Elegans Core Facility, Taiwan). Tulpinile de hrănire au fost crescute peste noapte la 37 ° C pe plăci NGM conținând ampicilină (100 μg/ml) și 1 mM IPTG. Viermii F0 au fost transferați pe placa respectivă de ARNi și incubați la 20 ° C. Viermii au fost apoi transferați pe plăci noi în fiecare zi și analiza datelor finale a fost efectuată folosind adulți tineri din descendența F1 clonată.

Analiza intramoleculară FRET

Măsurători ale intensității fluorescenței STV în neuroni

Cuantificarea fluorescenței SNB-1: mRFP în somas, axoni, sinapse, VNC (cord nervos ventral) și DNC (cord nervos dorsal) (Fig. 4) au fost efectuate folosind ImageJ pe baza unui protocol publicat [67]. S-au ales parametri ca suprafață, densitate integrată, valoarea minimă/maximă a griului și valoarea medie a griului, apoi regiunea corespunzătoare de interes, precum și fundalul selectat și măsurat. Următoarea formulă a fost utilizată pentru a corecta fluorescența de fundal: Densitate integrată - (zona regiunii selectate * înseamnă valoarea gri de pe fundal). Intensitatea fluorescenței totale măsurată pentru un neuron a fost considerată 100% pentru a se normaliza pentru variația expresiei matricelor extracromozomiale între viermi individuali, astfel, procentul de încărcare măsurat în regiunile subcelulare este egal cu: (Intensitatea fluorescenței în regiunea subcelulară/intensitatea fluorescentă totală în neuronul) * 100. ANOVA unidirecțională cu testul de comparație multiplu LSD Fisher a fost utilizat pentru a compara grupurile de studiu.

Analiza axonală a motorului și a grupului de marfă

Pentru cuantificarea grupurilor de motoare UNC-104 (Fig. 5) de-a lungul neuronilor sub-laterali, imaginile au fost obținute folosind un microscop Olympus IX81 conectat la o cameră Andor iXon DV897 EMCCD și analizate folosind ImageJ. Rețineți că particulele cu dimensiuni mai mici de 3 pixeli au fost excluse din analiză pentru a respinge zgomotul aleatoriu. Pentru măsurători de densitate, numărul de particule de-a lungul axonilor a fost numărat manual și a fost notată lungimea axonului. Pentru calcularea densității a fost utilizată următoarea formulă: (Numărul total de particule din segmentul de neurită/Lungimea segmentului de neurită) * 100. Particulele analizate din diferite grupuri au fost supuse la ANOVA unidirecțional cu comparații multiple utilizând testul LSD Fisher.

Pentru cuantificarea particulelor SNB-1 (Fig. 4), am folosit un microscop confocal cu scanare laser Zeiss LSM 780 inversat pentru a colecta datele. Aria particulelor de SNB-1 a fost analizată așa cum s-a menționat mai sus. Pentru analiza distanțelor parcurse de încărcătura SNB-1, a fost trasată o linie între dealul axonului și particula fluorescentă detectată SNB-1 folosind instrumentul de linie ImageJ și apoi măsurarea executată. Distanțele măsurate au fost normalizate (distanța dintre colțul axonului și particula SNB-1 detectată/lungimea totală a regiunii axonale inițiale analizate) de lungimea totală a axonului văzută în câmpul de observare și convertite în procentul distanțelor parcurse de particule (Fig. 4D ). Pentru măsurători ale densității particulelor (UNC-104 și SNB-1), a fost utilizată următoarea formulă: (Numărul de particule din axon/Lungimea axonului) * 100. ANOVA unidirecțională cu comparații multiple utilizând testul LSD Fisher a fost utilizat pentru a compara grupurile de studiu.

Analiza motilității

Disponibilitatea datelor

Datele originale vor fi furnizate la cerere.

Contribuțiile autorilor

MMS - a proiectat experimente, a efectuat experimente, a analizat experimente și a scris manuscrisul, SNB - a efectuat și a analizat experimente, HYH - a efectuat experimente, OIW - a obținut finanțare, a proiectat experimente și a scris manuscrisul.

Conflicte de interes

Autorii nu declară niciun conflict de interese.

Mulțumiri

Îi mulțumim prof. Eric Hwang, Universitatea Națională Chiao Tung (Hsinchu, Taiwan) pentru îndrumarea sa în experimentele FRET intramoleculare. Mulțumim Dr. Prerana Bhan pentru îndrumări tehnice generale în laboratorul nostru. Mulțumim C. Elegans Core Facility (CECF) Taiwan (finanțat de Ministerul Științei și Tehnologiei, MOST) pentru furnizarea de sisteme de microinjecție și sisteme de observare a viermilor. Recunoaștem MOST subvenții NSC 100-2311-B-007-004- și MOST 103-2311-B-007 - 004 -MY3 către OIW.