• Ecran divizat
  • Pictogramă Vizualizări Vizualizări
    • Conținutul articolului
    • Cifre și tabele
    • Video
    • Audio
    • Date suplimentare

  • Link PDF PDF
  • Pictogramă Partajare Acțiune
    • Facebook
    • Stare de nervozitate
    • LinkedIn
    • E-mail

  • Marisol Ibet González, Danielle Vannan, Bertus Eksteen, José Luis Reyes; Receptorul NLRP3 contribuie la protecția împotriva colangitei experimentale mediată de antigen. Biosci Rep 28 august 2020; 40 (8): BSR20200689. doi: https://doi.org/10.1042/BSR20200689

    receptorul

    Descărcați fișierul de citare:

    Abstract

    Introducere

    Aici, descriem că NLRP3 este necesar pentru a limita imunopatologia observată în boala inflamatorie biliară experimentală specifică antigenului. Șoarecii lipsiți de inflammasomul NLRP3 au prezentat o distrugere mai severă a căilor biliare, care a fost agravată atunci când șoarecii au fost expuși la o dietă obezogenă.

    Materiale și metode

    Inducerea șoarecilor și colangitei

    Am modelat colangita acută utilizând un protocol ușor modificat din modelul OVAbil [15], după cum sa raportat anterior [16]. Experimentele pe animale au fost efectuate la Institutul Snyder pentru Boli Cronice (Universitatea din Calgary), iar protocolul de studiu M11025 a fost aprobat de Comitetul de îngrijire a animalelor de la Universitatea din Calgary și a fost în conformitate cu Ghidurile pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator. Pe scurt, șoarecii masculi C57BL/6 care exprimă fragmentul 139-285aa de proteină de ovalbumină legată de membrană (OVAbil) au fost folosiți ca animale primitoare și în comparație cu șoareci cu vârstă și sexe care nu au senzorul NLRP3 (OVAbilxNLRP3 -/-). Ambele grupuri au fost hrănite fie cu un chow standard (SC), fie cu o dietă bogată în grăsimi (HFD) timp de 12 săptămâni, după cum s-a descris anterior [16]. Ambii șoareci hrăniți cu SC și HFD au primit 1 × 10 7 limfocite splenice obținute de la șoareci transgenici OVA I și II (OTI și OTII), prin injecții intraperitoneale (ip.).

    Histologie

    Zece zile după transferul șoarecilor celulelor OTI și OTII (inducerea colangitei) șoarecii au fost uciși uman sub anestezie inhalatorie profundă (izofluran), urmată de luxația cervicală și probe de ficat recoltate. Țesutul a fost încorporat în parafină și secționat (5 µM grosime) înainte de a proceda la colorare cu H&E pentru analiza histopatologică. La microscopul cu lumină, 5 căi portale alese la întâmplare au fost punctate pentru arhitectura căilor biliare după cum urmează: 0; canal biliar bine conservat, 1; canal biliar dezorganizat 2; celulele infiltrante care deplasează colangiocitele, 3; duct biliar absent. Pentru evaluarea inflamației 0; fără celule infiltrante, 1; celule infiltrante moderate, 2; celule inflamatorii masive numai în tractul portal 3; celule inflamatorii masive, inclusiv parenchimul ficatului.

    Citometrie în flux

    La sacrificiu, ficatul din grupurile experimentale a fost recuperat și omogenizat în PBS conținând FBS folosind un disociator de țesut gentilMACS (Miltenyi Biotec Inc, Germania). Probele au fost stratificate pe gradienți de percoll de 33/77% (Percoll, GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala Suedia) și centrifugați timp de 20 min la 200 g, la temperatura camerei pentru a realiza separarea celulelor. Suspensiile celulare recuperate din gradienți au fost ajustate (1 × 106/ml) și colorate în tampon de citometrie în flux (5% FBS, 5 mM EDTA și 0,1% azidă de sodiu). Colorarea a fost efectuată utilizând următorii anticorpi conjugați cu fluorocrom: PO-CD11b, PECy7-F4/80, APC-Cy7-Ly6C și PE-Ly6G. Datele au fost achiziționate pe un citometru de flux Aria II (BD Biosciences) și analizate cu software-ul Kaluza (Beckman Coulter, S.U.A.).

    Testele serice

    Sângele integral a fost colectat prin puncție cardiacă de la șoareci sub anestezie profundă la sacrificiu (izofluran, produse halocarbonate). Probele de sânge au fost centrifugate și serurile din grupurile experimentale au fost testate pentru nivelurile de alanină aminotransferază (ALT) de către Calgary Laboratory Services (Calgary, AB, Canada) și mediatori imuni solubili cu citokina de șoarece 31-plex Discovery Assay (Eve Technologies, Calgary, AB, Canada) după cum sa raportat [16]. Concentrațiile de citokine și chemokine sunt prezentate ca pg/ml.

    Prezentarea datelor

    Toate rezultatele sunt prezentate ca medie ± eroare standard a mediei (SEM). Datele au fost analizate în software-ul Graph pad prisma 6.0 printr-un mod ANOVA urmat de comparații multiple în cazul în care șoarecii P -/- în comparație cu OVAbil (393 ± 51 vs 224 ± 49, respectiv, vezi Figura 1A). Analiza histopatologică a arătat un grad moderat de infiltrare a celulelor imune la șoareci SC OVAbil în ziua 10 post-transfer de celule OVA-T cu conducte biliare vizibile în tractul portal (Figura 1B, C). În schimb, OVAbilxNLRP3 -/- a avut focare inflamatorii mai largi la nivelul tractului portal și o pierdere a căilor biliare identificabile (Figura 1B, C). Apoi, am decis să testăm ipoteza că absența inflammasomului NLRP3 poate afecta selectiv modelul nostru OVAbil, deoarece s-a raportat anterior că NLRP3 este implicat în dezvoltarea obezității și a steatozei hepatice [17]. În conformitate cu descoperirile noastre anterioare [16], șoarecii OVAbil hrăniți cu o dietă obezogenă au prezentat celule imune infiltrante crescute care vizează colangiocitele rezultând conducte biliare absente (Figura 1D). Interesant este că șoarecii OVAbilxNLRP3 -/- au dezvoltat steatoză comparabilă cu șoarecii OVAbil, totuși, s-a observat o zonă mai mare de focare inflamatorii parenchimale periportale și mai frecvente (Figura 1D).

    Prezența NLRP3 previne pierderea căilor biliare

    Am raportat anterior că severitatea modelului nostru de colangită este asociată cu infiltrarea neutrofilelor și scăderea numărului de monocite [16]. Aici, am confirmat că o leziune histologică exagerată, care a apărut în absența NLRP3 la șoarecii OVAbil, a fost însoțită de recrutarea masivă de neutrofile (Figura 2A). În conformitate cu acest lucru, șoarecii obezi OVAbilxNLRP3 -/- au prezentat o creștere și mai dramatică a numărului de neutrofile (Figura 2A, panoul inferior). Când distribuția macrofagelor Ly6C hi și Ly6 lo a fost, de asemenea, determinată în populația mieloidă (CD11b +), am observat un număr mai mic de subpopulații Ly6C hi macrofage la șoareci lipsiți de NLRP3, indiferent de dieta utilizată (Figura 2B). Astfel, șoarecii OVAbil lipsiți de NLRP3 au agravat numărul de neutrofile care s-au corelat cu o răspuns necontrolat care vizează colangiocitele.

    Infiltrarea masivă a neutrofilelor se corelează cu afectarea biliară severă

    Profilul dependent de dietă al mediatorilor inflamatori duce la inflamația biliară

    Mediatori asociați tipului 2 în probe de ser

    Discuţie

    Analiza profilului de citokine a relevat că fenotipul sever afișat la șoareci lipsiți de NLRP3 a rezultat din diferite combinații de mediatori inflamatori la șoareci hrăniți cu HFD. La șoarecii hrăniți cu SC, abscența NLRP3 duce la o supraexpresie a IL-6 și CXCL10, ambii mediatori inflamatori înnăscuti. S-a demonstrat că unul dintre efectele secreției IL-1β mediate de NLRP3 este inducerea proteinelor IL-6 și C-reactive [20], prin urmare, o cale de activare canonică a NLRP3 va induce mai mult IL-6, în mod surprinzător, în mâinile noastre șoarecii lipsiți de NLRP3 au produs cantități mici comparabile de IL-1β ca la șoarecii suficienți de NLRP3 (Figura 3), dar IL-6 îmbunătățit sugerând că în acest model există o eliberare independentă de NLRP3 a IL-6 sau se produce o activare alternativă non-canonică NLRP3.

    Pe de altă parte, am raportat anterior că șoarecii obezi prezentau colangită severă legată de un profil combinat de IL-13/IL-15/IL-17 și într-adevăr neutralizarea IL-15 a atenuat boala. În mod curios, șoarecii obezi cu deficit de NLRP3, grupul cu o inflamație hepatică devastatoare, nu au prezentat o creștere a IL-15 și au suprimat de fapt IL-17, dar un profil combinat de IL-13/TNFα a fost legat de această boală copleșitoare. Acest lucru sugerează că IL-13 poate dobândi un rol extrem de patogen dacă este combinat cu alte citokine inflamatorii. În mod curios, a existat o creștere selectivă a IL-13 printre factorii de tip 2, sugerând că sursa celulară a IL-4 și IL-13 poate să nu fie partajată.

    Rolul NLRP3 în stimularea răspunsurilor Th-17 în tractul GI trebuie clarificat de la Tian et al. a raportat că activarea NLRP3 promovează producția de IL-17 în colestază autoimună generată de o izoformă negativă dominantă a receptorului TGFβ II (TGFβRII) [21]. În conformitate cu aceasta, Arsenijevic și colab. a descris recent un rol central al NLRP3 în conducerea IL-17 și într-un model infecțios al colangitei [22]. În schimb, șoarecii cu deficit de NLRP3 induși cu colită au eliberat mai mult IL-17 [9]. Astfel, în modelul nostru imun-mediat (OVAbil) absența NLRP3 a provocat o exacerbare a bolii independentă de IL-17.

    Astfel, deficiența NLRP3 la șoarecii OVAbil are ca rezultat un curs necontrolat al bolii la inducerea unui răspuns imun specific colangiocitelor. Sunt necesare studii suplimentare pentru a elucida această rețea complexă de celule imune și mediatori inflamatori.

    Interese concurente

    Autorii declară că nu există interese concurente asociate manuscrisului.

    Finanțarea

    Această lucrare a fost susținută de subvenții de la Institutul canadian de cercetare în domeniul sănătății (CIHR), semnarea inițiativei echipei de granturi în provocările de sănătate în inflamația cronică pentru B.E. și Programul Apoyo pentru proiecte de investiții și inovare tehnologică (Proiect IA204618) pentru J.LR.

    Contribuția autorului

    J.L.R. și B.E. a conceput și a planificat experimentele. M.I.G., J.L.R. și D.T.R. a efectuat experimentele. D.T.R., B.E. iar J.L.R a efectuat interpretarea rezultatelor și a scris manuscrisul.

    Mulțumiri

    Dorim să mulțumim dr. Daniel Muruve (Universitatea din Calgary) pentru furnizarea șoarecilor cu deficit de NLRP3.