• Găsiți acest autor pe Google Scholar
  • Găsiți acest autor pe PubMed
  • Căutați acest autor pe acest site
  • Pentru corespondență: [email protected]

ABSTRACT

Succesul Mycobacterium tuberculosis ca agent patogen poate fi atribuit capacității sale de a se adapta la schimbările de mediu pe parcursul cursului infecției. Aceste modificări includ privarea de nutrienți, hipoxia, diferite condiții de stres exogen și mediul intraphagosomal. A fost identificată o mare cohortă de gene care facilitează această adaptare și printre acestea se numără multe gene pentru regulatorii de transcripție, cum ar fi factorii sigma care modulează expresia genelor ca răspuns la diferite indicii fiziologice. Factorii Sigma interacționează cu ARN polimeraza pentru a permite legarea la secvențe promotor specifice și inițierea transcripției genice. Micobacteriile adăpostesc factori sigma ai familiei σ 70, care se încadrează în patru categorii diferite. SigA (grupul 1) este factorul sigma primar esențial în micobacterii, iar SigB (grupul 2) este paralogul său neesențial. Factorii sigma SigF (grupa 3) și funcția extracitoplasmatică (ECF) (grupa 4) sunt factori sigma alternativi, care permit adaptarea la o gamă largă de stimuli interni și externi. Factorii alternativi sigma variază considerabil în ceea ce privește tipul și numărul între specii, reflectând cerințele lor diferite pentru răspunsul la stres (15).

mycobacterium

Treisprezece factori sigma au fost identificați în M. tuberculosis (23, 29). Unsprezece dintre aceștia sunt clasificați ca factori sigma alternativi și mulți dintre ei sunt recunoscuți ca determinanți ai virulenței. Pierderea factorului sigma alternativ SigF a scăzut virulența M. tuberculosis la șoareci (5) și afectarea țesuturilor asociate bolii la șoareci (13), precum și la cobai (20). Pierderea SigF duce, de asemenea, la o compoziție modificată a peretelui celular din cauza lipsei de sulfolipide legate de virulență (13) și s-a demonstrat că supraexprimarea sigF afectează reglarea altor proteine ​​asociate peretelui celular implicate în interacțiunea gazdă-patogen (40). ).

SigF a fost inițial considerat a fi absent în micobacterii nepatogene, cu creștere rapidă, cum ar fi Mycobacterium smegmatis (9). Cu toate acestea, de atunci a devenit clar că SigF este bine conservat printre micobacterii (30, 31) și reglează mai mult decât simpla virulență. În timp ce SigF este legat de răspunsul la stres și factorii sigma sporulației la alte bacterii (8), rolul său ca factor de sigma stres și fază staționară în M. tuberculosis este în dezbatere (40).

La M. smegmatis, pierderea sigF crește susceptibilitatea la stres oxidativ, pH acid și șoc termic (12) și dezactivează sinteza carotenoidelor de protecție (28). Acest lucru sugerează că SigF mediază un răspuns general la stres. Cu toate acestea, există încă o lipsă de cunoștințe de bază referitoare la genele reglementate de SigF și modul în care SigF se potrivește în rețeaua de reglementare a factorilor sigma. Douăzeci și șapte de factori sigma au fost propuși pentru M. smegmatis (35, 38). Acesta este de două ori numărul de factori sigma găsiți în M. tuberculosis și, posibil, reflectă dimensiunea mai mare a genomului și mediile mai variabile la care această specie trebuie să se adapteze. Pe baza acestei observații, s-a sugerat că circuitele de reglementare care implică SigF vor diferi între micobacteriile tuberculoase și cele de mediu, având în vedere diferitele naturi ale mediului lor (31), dar lipsesc datele privind reglarea activității SigF în M. smegmatis.

În acest studiu raportăm asupra regulonului SigF al M. smegmatis în timpul creșterii fazelor exponențiale și staționare. Propunem un nou consens al promotorului SigF pentru M. smegmatis pe baza datelor noastre experimentale și identificăm noi gene țintă sub controlul direct al acestui factor sigma. Oferim o justificare pentru fenotipurile tulpinei igsigF observate în experimentele anterioare de provocare a stresului și propunem gene candidate implicate în reglarea posttranslațională a SigF în M. smegmatis.

MATERIALE ȘI METODE

Tulpini bacteriene și condiții de creștere. Tulpina Mycobacterium smegmatis mc 2 155 (33) și o tulpină de ștergere izogenă sigF (MSMEG_1804) (12) au fost cultivate în mod obișnuit în cultură discontinuă în bulion Luria-Bertani suplimentat cu 0,05% (greutate/vol) Tween 80 (LBT) la 37 ° C pe un agitator rotativ la 200 rpm. Gentamicina a fost adăugată la o concentrație finală de 5 μg ml -1 acolo unde a fost necesar. Creșterea culturii a fost monitorizată prin măsurarea densității optice la 600 nm (OD600). Probele au fost diluate în soluție salină (8,5 g/litru NaCI) pentru a aduce OD600 la sub 0,5 atunci când au fost măsurate în cuve cu o lungime a căii de lumină de 1 cm într-un spectrofotometru Jenway 6300. Culturile inițiale au fost crescute până la faza exponențială (OD600 = 0,5 ± 0,2) și utilizate imediat pentru a inocula 100 ml LBT proaspăt în baloane de 1 litru la un OD600 inițial de 0,005.

Recoltarea celulelor. Culturile în loturi au fost recoltate în fază exponențială (μ = 0,26 ± 0,04 h -1) și fază staționară (μ = 0,07 ± 0,01 h -1) folosind soluție salină rece de glicerol (36). Pe scurt, culturile au fost amestecate cu 2 volume de glicerină-soluție salină rece (3: 2 [vol/vol]; -20 ° C) și centrifugate timp de 20 min la 10.000 × g și -20 ° C. După centrifugare, supernatantul a fost decantat și celulele au fost resuspendate în 1 ml glicerol-soluție salină (1: 1 [vol/vol]; -20 ° C), congelate rapid într-o baie de gheață uscată/etanol și depozitate la - 80 ° C.

Extracția ARN-ului. ARN-ul total a fost extras cu TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) urmând recomandările producătorului. Probele congelate (-80 ° C) au fost centrifugate timp de 15 minute la 13.000 × g și 4 ° C. Celulele au fost resuspendate în 1 ml de reactiv TRIzol și întrerupte folosind margele de zirconiu de 0,5 ml (0,1 mm diametru) într-un Mini-BeadBeater (BioSpec Products, Bartlesville, OK) la 5.000 de oscilații pe min timp de trei cicluri de 30 s. Probele au fost răcite pe gheață timp de 30 de secunde după fiecare ciclu. La sfârșitul procedurii de extracție, peletele de ARN au fost uscate la aer și redizolvate în 50 μl de dietil pirocarbonat (DEPC) tratat cu apă ultrapură. ADN-ul rămas a fost îndepărtat cu Turbo DNase (Applied Biosystems/Ambion, Austin, TX) urmând instrucțiunile producătorului. Calitatea ARN a fost evaluată prin electroforeză pe un gel standard de agaroză 1%, iar cantitatea de ARN a fost determinată cu un spectrofotometru NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA).

Resurse microarray. Microarraysuri de ADN cu diapozitive de sticlă cu 7.736 oligonucleotide unice de 70 mer (reperate în triplicate) reprezentând fiecare cadru de lectură deschis (ORF) al genomului M. smegmatis mc 2 155 au fost achiziționate de la Centrul de Resurse pentru Genomică Funcțională Patogen (PFGRC) stabilit de NIAID/JCVI (http://pfgrc.jcvi.org). Procedurile standard de operare (SOP) pentru etichetarea ARN și hibridizarea matricei, precum și fișierele de aspect și adnotare pentru microarray au fost descărcate de pe site-ul web PFGRC. Suita software gratuită open source TM4 (www.tm4.org) a fost utilizată pentru analiza microarray-urilor.

Sinteza/etichetarea ADNc. ARN-ul micobacterian a fost marcat aminoalil (aa) conform SOP M007 din PFGRC. Pe scurt, ADNc a fost transcris invers de la 5 μg ARN total extras folosind 3 μg primeri aleatori și transcriptază inversă SuperScript III (ambii de la Invitrogen) cu un amestec de 25 mM de marcare aa-dUTP (2: 3 aa-dUTP la dTTP). 5- (3-aminoalil) -dUTP a fost cumpărat de la Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). ADNc sintetizat a fost apoi cuplat fie cu cianină-3, fie cu cianină-5 (Cy-3/Cy-5) coloranți fluorescenți (GE Healthcare Bio-Sciences, Little Chalfont, Marea Britanie) timp de 1 1/2 oră. Concentrația de ADNc și încorporarea coloranților au fost măsurate cu un spectrofotometru NanoDrop ND-1000. Sondele marcate au fost amestecate și preparate conform recomandărilor pentru hibridizare imediată la microarray.

Hibridizare microarray. Microarrays-urile au fost hibridizate conform SOP M008 de la PFGRC, cu excepția faptului că lamele au fost manipulate individual în tuburi conice de 50 ml în loc de borcane Coplin. Pe scurt, lamelele au fost blocate timp de cel puțin 2 ore și spălate cu apă ultrapură filtrată (0,22-μm), urmată de o spălare finală cu izopropanol. Lamele umede au fost centrifugate uscate timp de 10 minute la 800 x g la temperatura camerei. Lamelele au fost apoi imediat hibridizate cu probele preparate și incubate timp de cel puțin 18 ore. După hibridizare, lamelele au fost spălate, centrifugate uscate așa cum s-a descris mai sus și scanate imediat. Tampoanele de spălare au fost filtrate (0,22 μm) înainte de utilizare. Hibridizările care compară tulpinile de tip sălbatic și ΔsigF în ambele faze exponențiale și staționare au fost repetate în patru replici biologice, inclusiv swap de coloranți.

Achizitie de imagini. Diapozitivele au fost scanate folosind un scaner Axon GenePix4000B microarray (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) la o dimensiune de pixel de 10 μm și un câștig fotomultiplicator (PMT) ajustat automat. Fluorescențele la 532 nm (Cy3) și 635 nm (Cy5) au fost măsurate simultan și salvate în imagini TIFF separate pe 16 biți în tonuri de gri, care au fost apoi analizate cu programele TM4 Spotfinder, MIDAS și MEV.

Exemple de perechi pentru gene selectate pentru PCR în timp real